专利名称：非同位素聚合酶链式反应－单链构象多态性检测基因突变的方法
技术领域：
本发明属于用于疾病诊断的检测基因突变的方法。
非同位素聚合酶链式反应-单链构象多态性检测基因突变的方法已经广泛应用。
这些方法包括以下步骤(1)按常规方法提取DNA；(2)PCR扩增待检DNA；(3)经高温或加碱进行变性处理；(4)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)银染法显示SSCP分析区带。这些方法存在一些缺点一部分基因用传统的高温变性法或加碱变性法有效，但有许多基因用这二种方法都无效，导致显色后出现的区带紊乱，模糊不清，且重现性差，片段较大时更是如此，因而检测灵敏度随着DNA片段的增大而下降很快(对200bp以下的片段可达100％，300bp时已低于85％)，故其应用受到很大限制。一般在检测前均要进行复杂、费时的条件摸索。
本发明的目的在于提供一种可广泛应用于各种基因突变的检测(无论片段大或小)，且区带更清晰、灵敏度更高、重现性好、简便、快速的一种非同位素聚合酶链式反应-单链构象多态性检测基因突变的方法。
本发明的方法包括以下步骤(1)按常规方法提取DNA；(2)PCR扩增待检DNA；(3)变性处理；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)银染法显示SSCP分析区带，其特征在于采用的变性方法为按PCR产物变性剂(内含0．01～3％SDS、10～50mMEDTA)上样缓冲液(内含95％甲酰胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚蓝、10mM EDTA)=1∶1∶1(体积比)条件下，在90～100℃进行变性处理3～5分钟。
所述变性剂中的SDS可以用以下物质中的一种或二种所替代尿素、DMSD(二甲亚砜)、tritonX-100、OP、DTT等。
由于采用了离子键极性很强的变性剂，变性时，可通过与单链的极性基因发生相互作用而稳定单链构象，同时提供较大的空间位阻，使其他分子不易与单链相互作用，成为稳定DNA单链构象的主要因素，由于这种独特的稳定作用，可以实现无论片段大或小，均能获得区带清晰、灵敏度更高、重现性好的实验结果，也避免了旧方法复杂费时的条件摸索过程，可以应用于各种基因突变的检测，方法简单、快速。
实施例1九例女性性反转者SOX9基因突变检测(1)常规法提取DNA；(2)PCR扩增待检DNA；(3)PCR产物2μl，变性剂2μl(内含0．01％SDS、20mMETDA)上样缓冲液2μl(95％甲酰胺、0．1％溴酚蓝、0．1％二甲苯青及10mMEDTA)放在0．5ml离心管中混匀，沸水浴加热3～5分钟后，立即放置冰浴中骤冷3～5分钟，高速离心5秒、置于冰上；(4)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)银染法显示SSCP分析区带，区带清晰。
实施例2，八例骨关节病患者软骨细胞线粒体DNA基因检测，步骤同实施例1，所用变性剂为0．5％尿素、30mMEDTA，区带清晰。
实施例3，六例女性性反转患者SRY基因检测。步骤同实施例1，所用变性剂为3％OP、50mMEDTA，区带清晰。
权利要求
1.一种非同位素聚合酶链式反应-单链构象多态性制检测基因突变的方法，包括以下步骤(1)按常规方法提取DNA；(2)PCR扩增待检DNA；(3)变性处理；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)银染法显示SSCP分析区带；其特征在于采用的变性方法为按PCR产物变性剂(内含0．01～3％、SDS、10～50mM EDTA)上样缓冲液(内含95％甲酰胺、0．1％二甲苯青、0．1％溴酚蓝、10mM EDTA)=1∶1∶1(体积比)条件下，在90～100℃进行变性处理3～5分钟。
2.根据权利要求1的所述方法，其特征在于变性剂中的SDS可以用以下物质中的一种或二种所替代尿素、DMSD(二甲亚砜)、tritonX-100、OP、DTT等。
全文摘要
本发明公开了一种非同位素聚合酶链式反应－单链构象多态性检测基因突变的方法,是将传统方法中采用的经高温或加碱进行变性处理改为采用离子键极性很强的SDS变性剂与上样缓冲液在90～100℃进行变性处理3～5分钟,实现无论片段大或小,均能获得区带清晰、灵敏度更高、重现性好的实验结果。
文档编号C12Q1/68GK1288958SQ00113518
公开日2001年3月28日 申请日期2000年6月30日 优先权日2000年6月30日
发明者朱敏, 谭文斌, 周钢, 谢慎思 申请人:湖南医科大学