专利名称：深红酵母菌高酶活菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母菌的筛选方法，确切地说是深红酵母菌高酶活菌株的筛选方法。
深红酵母菌(Rhodosporidium Rubra)中含有L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)可以转化肉桂酸生成L-苯丙氨酸。因此筛选高酶活菌株对肉桂酸的转化至关重要。
常规的筛选方法通常是菌种用物理方法或者化学诱变剂处理后在培养皿中进行培养，然后挑选生长旺盛的菌落来接种斜面并加以验证。常规的方法工作量大，效果不明确。
深红酵母在生长过程中产生L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)，从而代谢L-苯丙氨酸(L-Phe)及其结构类似物L-络氨酸(L-tyr)，当菌体生长在营养丰富的外界环境条件下时，会优先利用葡萄糖、蛋白胨等易于代谢的营养物质，而当外界环境中葡萄糖、蛋白胨等易于利用的营养物质匮乏而富含L-Phe或L-tyr时，就会代谢L-Phe或L-tyr来满足菌体的生长需要，相应地，菌体会产生相对较多的PAL来代谢更多的L-Phe或L-tyr。
本发明针对深红酵母菌产酶特性而设计的筛选方法，旨在能直观、迅速地筛选出高酶活菌株。
本发明利用同一培养皿中不同成份的培养基来培养诱变后的菌液，由于底物L-tyr的溶解度较低(0.4g/L)，在一定浓度的固体培养基中，过饱和L-tyr呈细针状晶体存在，使整个培养基为不透明状态，当菌落在这种培养基上培养时，就会代谢培养基中的L-tyr，使针状晶体消失，形成L-tyr的代谢空斑。当酶活力较高时，代谢的L-tyr量较大，相应的空斑也就较大。
本发明在培养皿中设计三层培养基，上层为营养层，各组份的比例(质量百分比，下同)为蔗糖2％,NaNO30.3％,KH2PO40.1％,KCL0.05％,MgSO4·7H2O0.05％,FeSO4·7H2O0.001％,琼脂1.8％,PH7.0；中层为诱导层，L-Tyr1.2％，琼脂1.8％；下层为琼脂1.8％；各层余为蒸馏水。
本发明所设计的三层培养基各有其不同的作用，对三层不同成份的培养基来说，最下层的琼脂培养基作用是把平皿的底部衬平，防止倒中层培养基时出现厚薄不匀，以免影响代谢所形成的空斑的大小和形状；中层为诱导培养基，只含有一定浓度的底物L-Tyr；上层为适于菌体生长的营养培养基。每层培养基要求很薄，且厚薄要均匀，当涂布后的菌液在上层生长时，由于上层中营养物质较多，菌体会迅速增殖，但上层培养基较薄，营养物质会被迅速地消耗完，这时，菌体就要向下吸收中层诱导培养基中的底物L-Tyr产生大量的PAL代谢底物来满足菌体生长。诱导培养基也很薄，于是菌体也逐渐代谢菌落周围的底物，形成底物空斑并逐渐扩大。若每层培养基很厚，就会干扰空斑的形成，若上层营养培养基太厚，菌体就只利用上层中营养物质，不向中层代谢底物，若中层太厚，底物量大，形成的空斑就小，判断不出酶活力的大小。此外，底物浓度对斑形也有较大的影响，底物浓度太高，菌体代谢不掉，也就无法形成空斑，底物浓度太低，则对背景映衬太弱，使空斑不易观察。
取诱变后的浓度为102个/ml菌悬液两滴，涂布于三层培养基上30℃培养二天，即可观察到代谢的空斑。空斑大的菌落即可认定为高酶活菌株。
分别挑取斑形较大和较小的菌落接种于空白斜面培养基，30℃恒温培养，各配400ml发酵液分装20只1000ml三角烧瓶，灭菌后接入斜面菌种，在30℃，90rpm摇床培养，当OD值长至1.0时，离心，取菌泥配制100ml转化液(NH4HCO313.3g，肉桂酸1.2g，NH4OH16.8ml)30℃转化48小时，斑形较大的菌落转化肉桂酸5.14g，斑形较小的菌落转化肉桂酸3.26g。
以上转化实验证明，斑形较大的菌落其转化酶活力相对较大，斑形小的菌落其转化酶活力相对较小。斑形的大小与酶活力的高低成正比。本方法可以直观迅速地筛选出高酶活菌株，无需如常规方法那样加以验证。
附图
为以L-Tyr为底物三层培养基菌落生长所形成的代谢斑。图中的暗背景为L-Tyr的细小结晶体，实物为白色不透明的针状晶体；无色空斑为L-Tyr被菌体代谢后，晶体消失，成为透明状态；空斑中的黑点为深红酵母菌菌落，实物为深红色。
实施例取以下原料在蒸馏水中各配成100ml培养基上层蔗糖2g,NaNO30.3g,KH2PO40.1g,KCL0.05g,MgSO4·7H2O0.05g,FeSO4·7H2O0.001g,琼脂1.8g,PH7.0。
中层L-Tyr1.2g，琼脂1.8g。
下层琼脂1.8g。
培养基灭菌后按由下到上顺序用无菌移液管各取5ml分装于直径为90mm培养皿使培养皿中各层培养基分布均匀。
取诱变后的浓度为102个/ml菌悬液两滴涂布于上层培养基上，30℃培养两天，即可观察到如图所示的空斑。
权利要求
1.一种深红酵母菌高酶活菌株的筛选方法，取诱变后的菌种在培养皿中进行培养，其特征在于培养皿中的培养基是由上层营养层和中层诱导层以及下层琼脂层所构成的固体培养基。
2.根据权利要求1所述的深红酵母菌高酶活菌株的筛选方法，其特征在于三层培养层的成份与配比如下上层蔗糖2％,NaNO30.3％,KH2PO40.1％,KCL0.05％,MgSO4·7H2O0.05％,FeSO4·7H2O0.001％,琼脂1.8％,PH7.0；中层L-Tyr1.2％，琼脂1.8％；下层琼脂1.8％；余为蒸馏水。
全文摘要
一种深红酵母菌高酶活菌株的筛选方法,取诱变后的菌种在培养皿中进行培养,该培养皿中的培养基是由上层含葡萄糖等的营养层和中层含L－Tyr等的诱导层以及下层琼脂层所构成的固体培养基。最后生长的菌落在培养基中形成形状大小不一的肉眼可见的代谢斑形。其中斑形大的菌落即是高酶活菌株。
文档编号C12N1/16GK1288947SQ0011906
公开日2001年3月28日 申请日期2000年10月20日 优先权日2000年10月20日
发明者张晓斌, 范守荣, 左美林, 高仰哲, 孙志愿, 戚正奎, 冯立文 申请人:安徽省科苑应用技术开发(集团)股份有限公司