专利名称：重组人b淋巴细胞刺激因子表达载体及构建方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是一九九九年新发现的一种属于TNF超家族并与人体免疫密切相关的细胞因子；为Ⅱ型三结式跨膜蛋白，在人体内主要由外周血单核细胞、脾脏、淋巴结、骨髓等组织细胞表达，它能刺激B淋巴细胞分化、增殖，诱导其分泌免疫球蛋白，从而提高免疫缺乏或低下病人的自身免疫能力。体外重组hBLyS(rhBLyS)胞膜外部分的功能片段(rhsBLyS)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及昆虫细胞sf9等真核细胞中的表达已见报道；而且获得的rhsBLyS在与anti-IgM或LPS等协同作用时，具有刺激人B淋巴细胞分化、增殖的功能。但至今国内外尚未见到有关原核表达载体的构建及其在原核系统中进行表达、表达产物生物学活性的研究报道。因此，若能在原核系统表达出同样有生物学活性的rhsBLyS，则其理论意义和实际意义都将是非常重大的。
相关技术资料1、Paul A.Moore,Omella Belvedere,Amy Orr,David W LaFleur,Ping F,Yuling L,David M.Hilbert et al.BLyS:Member of the Tumor Necrosis Family and BLymphocyte Stimulator.Science,1999,285:260～2632、Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2ed,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:35～563、Jane A.Gross,Janet Johnston,Sherri Mudri,et al.TACl and BCMA arereceptors for a TNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease.Letters tonature,2000:(404)995-999本发明的目的是为了进一步研究rhsBLyS的高级结构和生物学功能，为了今后运用基因工程大量制备rhsBLyS以用于临床及生物制药。
本发明的目的可以通过以下措施来达到本发明包括原核表达载体pET30a(+)/hsBLyS及其构建方法。原核表达载体pET系统是重组蛋白基因在E.coli中克隆和表达最有效的系统，在T7的强转录和翻译信号控制下，靶基因克隆在pET质粒中，T7RNA聚合酶有一定的选择性和活性，能使几乎所有原核细胞转向表达靶基因，诱导几个小时后，靶蛋白占细胞总蛋白的50％以上。这个系统在未诱导时，能使靶基因处于表达静止状态。本发明选择此表达载体系统与带有His-Tag(亲合纯化组氨酸接头)的融合表达基因(约850bp)一起，运用基因工程分子克隆技术(具体见“载体构建步骤”)，构建成一个全新的原核融合表达载体pET30a(+)/hsBLyS(见
图1)。
本发明还包括表达的融合蛋白的肠激酶酶切位点与His-Tag(6个组氨酸接头)的连接位序。
本发明还包括两对引物的设计(PCR引物及Nest-PCR引物)；引物的序列详见“载体构建步骤1”。
本发明运用PCR及Nest-PCR方法，将hsBLyS的DNA片段从人胎盘cDNA文库中扩增出来，经纯化、测序鉴定后，运用酶切、连接等重组手段，将所得到的融合基因(rhsBLyS)定向插入带有His-Tag序列的原核表达载体pET-30a(+)，构建成pET-30a(+)/hsBLyS融合表达载体；然后在大肠杆菌λDE3中高效表达；基因产物融合靶蛋白用本实验室研究制备的高效特异性Ni2+亲和胶(正在申请专利，申请号为00112143.X)分离纯化；得到带有His-Tag的融合蛋白经电泳鉴定后进行生物学功能测定；结果表明，采用原核系统表达获得的rhsBLyS具有刺激人B淋巴细胞增殖之功能。(载体构建步骤如附图3)1、引物的设计与合成根据已知hBLyS的cDNA序列，设计特异性的PCR引物为上游引物5′CAAACACAGATAACAGGAAATGAT3′；下游引物5′CATGGTGTAAGTAGGTCACAGCA3′；Nest-PCR引物为上游引物5′GATATCGACGACGACGACAAGGCCGTTCAGGGTCCAG 3′；下游引物5′AAGCTTGGTGTAAGTAGGTCACAGCAGTTT3′。在Nest-PCR引物中，上游引物里含有EcoRⅤ的酶切位点，下游引物里含有HindⅢ的酶切位点。
2、PCR和Nest-PCR以人胎盘cDNA文库为模板，用上述第一对引物进行PCR，扩增得到hBLyS的cDNA；经Geneclean Kit纯化并克隆测序鉴定后，直接以PCR扩增得到的hBLyS产物为模板，用上述第二对引物进行Nest-PCR，扩增得到hBLyS胞膜外部分(hsBLyS)的DNA片段，用Geneclean Kit纯化并克隆测序鉴定；再克隆到PCR-Blunt载体系统中扩增，然后用QINprep Plasmid Miniprep Kit纯化质粒并用HindⅢ及EcoRⅤ双酶切；用Geneclean Kit纯化后，电泳检测所得到的纯hsBLyS的DNA片段。
3、pET-30a(+)/hsBLyS质粒的构建将上述用PCR及Nest-PCR等方法所得到的hsBLyS的DNA片段经纯化鉴定后，克隆到pET-3a(+)载体中，构建成能表达出带有His-tag纯化标记的融合蛋白的原核表达质粒。(见附
图1)在本发明中，运用基因工程及分子克隆等方法，构建了原核表达载体pET-30a(+)/hsBLyS，并在大肠杆菌λDE3中表达成功。从基因工程上讲，由于原核表达系统比真核表达系统简单、方便，而且容易操作并可大量获得所需活性蛋白；因此，本研究的成功为进一步从基础免疫学角度研究hsBLyS的受体分布、活化B细胞的信号传播途径、hsBLyS分子的高级结构和各种生物学功能及作用机制形成了一个良好的开端，亦为hsBLyS的大量制备和早日应用于临床及免疫治疗奠定了初步基础。
本发明的优点在于1、在本发明中，运用基因工程及分子克隆方法，构建了原核表达载体pET-30a(+)/hsBLyS，并在大肠杆菌λDE3中表达成功。从基因工程上讲，由于原核表达系统比真核表达系统简单、方便，而且容易操作并可大量获得所需活性蛋白；因此，本研究的成功为进一步从基础免疫学角度研究hsBLyS的受体分布、活化B细胞的信号传播途径、hsBLyS分子的高级结构和各种生物学功能及作用机制形成了一个良好的开端。
2、构建成的原核表达载体pET-30a(+)/hsBLyS可以高水平地大量制备rhsBLyS蛋白质，提供给临床试验；亦为hsBLyS的大量制备和早日用于免疫治疗奠定基础。这是目前真核表达系统所无法实现的。
图1是构建的原核表达载体pET-30a(+)/hsBLyS结构2是rhsBLyS的活性测定及其与anti-IgM的协同作用实验检测图从图2实验结果的图示分析可得(1)与空白对照相比，单独加入anti-IgM或者单独加入rhsBLyS时，B淋巴细胞的增殖情况并没有明显的变化；而且随着加入anti-IgM或rhsBLyS量的增加也没有明显的变化(数据未显示)。
(2)在加入anti-IgM的量一定(2ul、10ul或20ul)时，随着所加入的rhsBLyS的量增加，B细胞的增殖幅度增大；反之，在加入rhsBLyS的量一定时，随着anti-IgM加入的量增加，B淋巴细胞的增殖幅度也增大。
图3是原核表达载体pET-30a(+)/hsBLyS的构建实验步骤示意图实施例效果检测---表达产物rhsBLyS的活性检测将上述构建好的表达载体转染大肠杆菌λDE3，培养表达后用本研究室研制的Ni2+亲和层析胶纯化得到纯的rhsBLyS；再用纯rhsBLyS配制成浓度为2mg/ml的溶液并与anti-IgM(10万单位溶液)一起进行B淋巴细胞活性测定(在细胞培养板上进行)分9个实验组(图2中横坐标)，每组三个孔，第一组为对照组(不加anti-IgM和rhsBLyS)；第二组为单加rhsBLyS组(每孔加2ul)；第三组为单加anti-IgM组(每孔加10ul)；第四组到第九组为加anti-IgM和rhsBLyS组，其中第四组每孔加2ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第五组每孔加10ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第六组每孔加20ul anti-IgM和5ul rhsBLyS，第七组每孔加2ulanti-IgM和10ul rhsBLyS，第八组每孔加10ul anti-IgM和10ul rhsBLyS，第九组每孔加20ul anti-IgM和10ul rhsBLyS。再运用MTT法测定各组的细胞密度(图2中纵坐标，单位细胞数×103/毫升)。测定结果表明(见图2)原核系统表达的rhsBLyS具有刺激人B淋巴细胞增殖的功能，与真核表达系统表达的rhsBLyS相比具有同样的活性；并且，从图2实验结果的图示分析可得(1)与空白对照相比，单独加入anti-IgM或者单独加入rhsBLyS时，B淋巴细胞的增殖情况并没有明显的变化；而且随着加入anti-IgM或rhsBLyS量的增加也没有明显的变化。
(2)在加入anti-IgM的量一定(2ul、10ul或20ul)时，随着所加入的rhsBLyS的量增加，B细胞的增殖幅度增大；反之，在加入rhsBLyS的量一定时，随着anti-IgM加入的量增加，B淋巴细胞的增殖幅度也增大。
权利要求
1.一种重组人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)原核表达载体pET30a(+)/rhsBLyS，其特征在于本发明采用两对引物；包括PCR引物序列以及Nest-PCR引物的序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于PCR引物序列为5′CAAACACAGATAACAGGAAATGAT3′；5′CATGGTGTAAGTAGGTCACAGCA3′。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于Nest-PCR引物序列为5′GATATCGACGACGACGACAAGGCCGTTCAGGGTCCAG3′；5′AAGCTTGGTGTAAGTAGGTCACAGCAGTTT3′
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于PCR引物以及Nest-PCR引物扩增而获得的融合基因(rhsBLyS)。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于原核表达载体pET30a(+)/rhsBLyS在大肠杆菌DE3中表达所获得的融合靶蛋白rhsBLyS。
6.一种重组人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)原核表达载体pET30a(+)/rhsBLyS构建方法，其特征在于运用PCR及Nest-PCR方法，将hsBLyS的DNA片段从人胎盘cDNA文库中扩增出来，经纯化、测序鉴定后，运用酶切、连接等重组手段，将其定向插入带有His-Tag序列的原核表达载体pET-30a(+)，构建成pET-30a(+)/hsBLyS融合表达载体的方法。
7.根据权利要求6所述的表达载体构建方法，其特征在于融合基因中His-Tag与肠激酶切割位点的设计方法以及此两个位点之间的位序。
全文摘要
重组人B淋巴细胞刺激因子(rhBLyS)表达载体及其构建方法。本发明设计两对引物,运用PCR及Nest－PCR方法,将hsBLyS的DNA片段从人胎盘cDNA文库中扩增出来,经纯化、测序鉴定后,采用酶切、连接等重组手段,将所得到的融合基因(hsBLyS)定向插入带有His－Tag序列的原核表达载体pET－30a(+),构建成pET－30a(+)/hsBLyS融合表达载体;然后在大肠杆菌λDE3中高效表达;得到基因产物重组融合靶蛋白(rhsBLyS)。
文档编号C12N15/62GK1308127SQ0011909
公开日2001年8月15日 申请日期2000年11月2日 优先权日2000年11月2日
发明者张双全, 刘平 申请人:南京师范大学