专利名称：固定化细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化微生物细胞的制备方法。
长期以来，烃类尤其是烷烃、芳烃的羟基化和烯烃的环氧化在化学上一直是比较难以实现的过程。而以低碳烃类为碳源和能源的的微生物则可以很容易地对这类化合物进行转化和利用，使其生成相应的醇和环氧化合物，并且反应条件温和，不会对环境造成污染。例如，以甲烷为唯一碳源和能源的甲烷利用细菌就可以直接氧化甲烷、乙烯、丙烯等低碳烃类小分子化合物，产生甲醇、环氧乙烷和环氧丙烷等。但是由于这类微生物的培养周期比较长(一般为4-5天)，并且反应过程需要辅酶NADH的参与，而辅酶NADH价格昂贵，限制了其工业应用。所以要利用此类微生物进行反应至少需要解决3个问题。一是细胞的活性保持，二是细胞的重复使用，三是辅酶的再生问题。为了降低成本、提高效率，以达到工业化的要求，需要将细胞固定化。从80年代开始，国内外就有许多研究者采用各种方法，将微生物细胞进行固定化(Ching T.Hou，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1987，19，1.G.A.Kovalenko，V.D.Sokolovskii，Biotechnol.Bioeng.，1992，39，522.陆仕灿，陶坚铭，邱蔚然，俞俊棠，华东理工大学学报，1994，20，21)，但获得的结果大都不尽人意。高灿柱等人采用吸附法将细胞吸附在沙子、硅胶、聚丙烯丝等无机和有机载体上，反应活性虽然有所提高，但重复使用4次以后，固定化细胞就失活了，不能继续利用(高灿柱，李树本，宁治中，缪德埙，分子催化，1991，5，227-232)。后来他们采用一种方法(专利号ZL 90 1 04573.X)，将细胞包埋在海藻酸钙中，包埋细胞活性保持地较好，在连续反应器中可以再生使用8批，但存在细胞容易破碎的问题。
本发明的目的在于解决上述问题而提出一种运用溶胶凝胶法制备固定化细胞，用于催化烃类的氧化，可以达到使用多次而固定化细胞不破碎且一直保持较高活性的方法。
一种溶胶凝胶法制备固定化细胞的方法，该方法包括以下步骤a.选用甲烷利用细菌Methylomonas sp.GYJ3，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养；b.培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度；c.用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48-120小时。
本发明所用的硅酸钠溶液的浓度为0.1-5克/毫升，盐酸溶液的浓度为1-12摩尔/升。
本发明所用的甲烷和空气的体积比为1～10∶1。
本发明所用的磷酸盐缓冲溶液的pH＝6-8.5，浓度为5-100毫摩尔/升。
本发明所用的无机培养基组成为NH4Cl0.1-1克/升，MgSO4·7H2O0.1-2克/升，FeSO4·7H2O0.1-2克/升，CaCl2·2H2O0.1-1克/升，CuSO4·5H2O0.01-5毫克 /升，MnSO4·H2O0.01-5毫克/升，ZnSO4·7H2O0.01-5m毫克/升，NaMoO4·7H2O0.01-5毫克/升，Na2PO4·12H2O0.1-5克/升，KH2PO4·7H2O0.1-5克/升。
通过本发明制备的固定化细胞可以用于催化烃类的氧化反应中，具体是将溶胶凝胶法制备的包埋细胞，在含有浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸氢二钠和浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸二氢钠成分的反应液中悬浮，并充入空气和丙烯的混合气。于10-60℃的恒温环境中用摇床或磁力搅拌器进行搅拌。反应5-10小时后，离心收集产物，并用该反应液冲洗。
催化烃类的氧化反应中采用的反应温度为25-50℃，转数为150-220r/min。
催化烃类的氧化反应中所用的丙烯和空气的体积比为1～99∶1本发明与已有技术相比具有以下优点1在温和条件下将微生物活细胞包埋于硅酸钠凝胶中，细胞活性不但不会减小损失，而且比包埋前有较大提高。
2溶胶凝胶法包埋制备生物催化剂方法简单，原材料价廉易得。
3用适当方法再生后，可以重复使用多次，包埋细胞不会破裂，活性也基本保持不变。
现进一步通过实施实例来阐述本发明的实现方式实施例1选用甲基单胞菌种Methylomonas sp.GYJ3，用无机培养基，在甲烷∶空气为1∶1的气氛中，温度为32℃的条件下摇床培养4天。将培养好的菌体细胞离心分离，并将菌体细胞用无机培养基悬浮。先用硅酸钠溶液和盐酸溶液制成溶胶，然后加入1毫升的悬浮菌液，轻轻晃动，半小时后溶胶变成凝胶，同时将菌体细胞包入其中。硅酸钠溶液的浓度为0.克/毫升，盐酸溶液的浓度为1-12摩尔/升。凝胶在低温环境中放置1-5天，用灭菌蒸馏水洗涤包埋细胞。将洗好的催化剂放入250毫升锥形瓶中，加入适量无机培养基，充入1∶1的甲烷和空气的混合气，在摇床上培养80小时。
取包埋好的固定化细胞湿重5.6克(固定化细胞中共含有菌体细胞干重毫克，装入250毫升锥形瓶中，充入100毫升丙烯。锥形瓶置于32℃的摇床中，摇床使用速度为150转/分，反应5-10小时后共生成80.7微摩尔环氧丙烷，此时环氧丙烷量不再增加。用pH为7的50毫摩尔/升的磷酸缓冲液洗涤2次。洗净后通入1∶1的甲烷和空气的混合气，培养时间为5-10小时。培养结束后，继续进行丙烯环氧化反应。这样反复进行。将一次投入的包埋细胞反应的总活性(微摩尔/毫克细胞于重)列入表1次数1 2 3 4 5 6 7活性1.121 2.237 1.726 1.036 1.457 1.123 1.316次数8 9 1011121314活性1.272 1.313 1.466 1.562 1.421 1.397 1.411次数15161718192021活性1.496 1.474 1.505 1.510 1.560 1.664 1.653次数22232425活性1.606 1.392 1.164 1.208同时取离心后的未固定化的细胞1.0克(干重70毫克)，反应条件同实例1，细胞仅反应4批便失活，反应6小时的总活性(微摩尔/毫克细胞干重)列入下表次数 12 3 4活性 0.6490.621 0.314 0.020实施例2其它同实施例1，仅将反应温度改为在25-50℃范围内选取不同值，150r/min摇床反应5-7h，反应完毕后，离心分离产物。所得活性结果如下(微摩尔/毫克细胞干重)包埋细胞活性 未包埋细胞活性25℃ 1.025 0.50332℃ 1.212 0.63737℃ 1.278 0.60145℃ 1.540 0.42550℃ 1.204 0.262比较发现包埋后不仅细胞活性有很大提高，并且耐高温的能力也大大增强，最适温度由未包埋前的32℃，提高到包埋后的45℃。
实施例3其它同实施例1，仅将反应pH值改为在6-8.5范围内选取不同值，150r/min摇床反应5-7h，反应完毕后，离心分离产物。所得活性结果如下(微摩尔/毫克细胞干重)包埋细胞活性 未包埋细胞活性pH＝6 1.1210.575pH＝6.5 1.2580.614pH＝7.0 1.3490.655pH＝7.5 1.5080.583pH＝8.5 1.4330.409比较发现包埋后不仅细胞活性增加，并且抗碱性的能力也有较大提高，最适pH值由未包埋前的7.0，提高到包埋后的7.5。
权利要求
1.一种固定化细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.选用甲烷利用细菌Methylomonas sp.GYJ33，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养；b.培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度；c.用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48-120小时。
2.如权利要求1所述的方法，硅酸钠溶液的浓度为0.1-5克/毫升，盐酸溶液的浓度为1-12摩尔/升。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于甲烷和空气的体积比1～10∶1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于磷酸缓冲液的pH值为6-8.5，浓度为5-100毫摩尔/升。
全文摘要
本发明公开了一种在温和条件下,制备固定化微生物细胞的方法。用无机硅酸钠水溶液和盐酸溶液制成溶胶的同时,加入微生物细胞,待溶胶凝固变成凝胶后,同时将微生物细胞包埋于其中。这种方法克服了一般固定化方法所造成的细胞活性损失大,制得的固定化细胞容易脱落或破碎的缺点,包埋细胞可以重复使用多次而活性不下降。溶胶凝胶法制备固定化细胞,方法简便,原材料价廉易得,反应活性高,有利于大规模生产。
文档编号C12N11/00GK1327052SQ0112154
公开日2001年12月19日 申请日期2001年6月18日 优先权日2001年6月18日
发明者陈建波, 徐毅, 辛嘉英, 崔俊儒, 夏春谷, 李树本 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所