专利名称：一种固相载体上校读pcr检测基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及基因突变的检测方法，更具体涉及一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法。
背景技术：
所说的在固相上用校读PCR检测基因突变，是指针对目标基因及其突变热点，设计一对外引物和与突变热点相对应的内引物，在对内引物进行二硫化物和磷酸化修饰后，固定于巯基硅烷衍生的普通载玻片，以外引物扩增产物为模板，也可直接以未经扩增的临床样品为模板，运用高保真DNA多聚酶，在同一反应体系和反应条件下对内引物进行固相延伸，使与基因突变相对应的内引物获得特异性固相延伸，结合传统酶标技术对反应信号进行原位检测，实现基因的准确、快速和灵敏检测。本方法既可检测基因的单点突变，也可对基因内多个突变热点进行同步检查，或结合多重PCR等技术，对属于不同基因的多个基因突变进行同步检测。
基因突变，尤其是基因点突变，与人类疾病密切相关。研究表明，遗传性疾病一般都与基因密切相关，如家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia，FH)是由于细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)的基因突变所致，地中海贫血(thalalssmia)多数情况下是由于有关珠蛋白基因突变所致，甲型血友病(haemophilia A)是由于FVIII基因突变所导致，乙型血友病(haemophilia B)是由于FIX基因的突变所致等；另有研究显示，随着抗生素等药物的广泛使用，人类病原菌的耐药性情况已经逐渐凸显出来，给许多疾病的治疗带来了很大的困难，比如结核菌对异烟肼、链霉素、利福平、毗嗪酰胺、乙醇丁胺等一线抗结核药物的耐药性均与结核菌有关基因的突变密切相关，肺炎链球菌中编码PBP2b和PBP2x的基因突变导致了青霉素耐药性的产生等；近年来，由于细菌耐药性特别是多重耐药情况日益严重，许多当时看来已经被控制住的细菌性疾病在时隔多年以后重新爆发或流行，如结核病、鼠疫等，2000年我国结核病患者已达600余万人，每年约25万人死于这一疾病。这些情况已经成为全球关注的热点，引起了世界卫生组织和一些发达国家政府的高度重视。基因突变的检测，对包括上述疾病在内的许多疾病的准确快速诊断和指导临床用药等方面具有重要意义。目前已经有许多基因突变的检测方法，包括基因测序、核酸杂交、等位基因特异性扩增、PCR-SSCP、聚丙烯酰胺凝胶电泳、化学切割、基因芯片等。
但这些已有方法有的每次只能检测基因一个突变位点(如等位基因特异性扩增、PCR-SSCP)，而且必须采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行结果检测，操作多有不便，难以实现检测自动化；核酸杂交虽然操作原理简单，但对于探针的设计和杂交、洗脱条件等要求极为苛刻，难以实现多个不同位点的同步检测；目前运用基因芯片进行突变检测，或采用芯片杂交，重复性较差，或采用三维基因芯片，制作和操作流程复杂，并且都需要昂贵的信号检测仪器，成本高，离实用化尚有一定距离；基因测序虽然准确有效，但成本高，需要专门仪器和技术人员进行操作，难以推广应用。而且，在众多的疾病相关基因中，大多存在多个疾病相关的突变热点，如B-地中海贫血症相关基因存在有十个以上的突变点，涉及多个氨基酸密码子；结核菌利福平耐药性相关基因存在有四十余种突变体。因此，已有的方法显然不能满足要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法，设计引物，经修饰和处理后固定于普通载玻片，进行固相PCR反应，操作简便，成本低，能快速、灵敏的同步检查基因多个突变热点。
为达成上述目的，本发明采用如下技术路线根据目标基因及其突变热点，设计一对外引物和与突变热点相对应的内引物，后者在经二硫化物和磷酸化修饰后固定于普通载玻片，或直接以临床样品为模板，或以外引物扩增产物为模板，进行固相PCR，利用高保真DNA多聚酶的外切酶活性，特异性延伸与突变位点相对应的固相引物，延伸过程中掺入生物素，随后采用传统酶标技术对延伸产物进行检测，检测结果可直接目测，或借助小型酶学检测仪器，从而实现目标基因中多个基因突变热点的在同一反应体系和反应条件下的同步检测，其步骤是A、根据目标基因，设计一对外引物和有关内引物，后者与基因突变热点相对应，对内引物的两个末端分别进行二硫化物和磷酸化修饰，如果涉及一组内引物，尽量使各引物的Tm值保持一致；B、对普通载玻片进行巯基硅烷化修饰，固定突变热点对应内引物；C、选用有关高保真DNA多聚酶(pfu、Vent)，优化反应条件，在对酶的聚合活性的影响不大的前提下，充分发挥其外切酶活性；D、使用高保真酶，以外引物从临床样品中扩增目标基因，并进行纯化；
E、以纯化样品(或直接以未经扩增的临床样品)为模板，进行固相半巢式PCR，特异性延伸与基因突变对应的内引物；F、运用传统酶标技术，对扩增结果进行原位信号检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明可对同一基因的多个突变可能发生点进行同步扫描，或结合多重PCR等技术，对多个不同基因的基因突变情况进行检查，检测速度快，灵敏度高，操作简便，成本低，适用于细菌耐药性、遗传病的临床检测。
图1是核酸共价固定后酶标检测结果示意图，其中A为未固定任何核酸的阴性对照，B为固定未掺生物素的核酸作为阳性对照，C为固定掺有生物素的核酸获得阳性结果。
图2是固相半巢式PCR的原位酶标检测结果示意图，其中A为阳性对照，B为引物W35590(未经磷酸化修饰)固相扩增所得阳性结果。
图3是固相校读PCR检测结核菌利福平耐药性相关基因突变原位酶标检测结果示意图，所用模板为结核菌利福平临床耐药株的基因组提取物，该耐药株的rpoB基因经外引物(引物54684与54685)扩增后直接测序证明，该基因第531位密码子第二个碱基由G突变为T。图3左A为引物W35591，固相扩增后呈阳性结果，B为引物W35590，固相扩增受到抑制而呈阴性结果；图3右A为引物W22612(与已突变位点直接对应)固相扩增阳性结果，B为未固定任何引物而得的阴性结果。
具体实施例方式
突变热点对应引物根据野生型基因而设计，3’端羟基用化学基团修饰。与突变模板结合并在3’端形成错配后，利用高保真DNA多聚酶的外切酶活性切除引物3’端的突出碱基，然后实现引物的正常延伸，否则，引物延伸将受到抑制。以本方法检测结核杆菌利福平耐药性相关基因突变的具体步骤如下1.根据利福平耐药相关野生型基因rpoB，设计上外引物和下引物(上游引物为5’-CAGACCACGATGACCGTTCC-3’，编号54684；下游引物为5’-GAGCCGATCAGACCGATGTT-3’，编号54685)，扩增产物长度为442bp；同时针对该基因的两处可能突变位点，设计三条突变对应引物(5’-TTTTTTTTTTAGTTCTTCGGCACCAGCCAG-3’，编号W35590；5’-TTTTTTTTTTAGTTCTTCGGCACCAGCCAT-3’，编号W35591；5’-TTTTTTTTTTACCGCCGGGCCCCAGCGCCG-3’，编号W22612)，其中前两条与rpoB基因69bp突变热点区的第一个碱基相对应，W10685根据野生型基因设计，W1355913’端最后一个碱基由G突变成T；W22612也根据野生型基因设计，与rpoB基因69bp突变热点区的第531密码子的第二个碱基相对应；引物长度均为20碱基，5’端额外添加10个碱基T作为连接臂，并以二硫化物进行修饰，3’端羟基磷酸化修饰。
2.用巯基硅烷对普通载玻片进行衍生化处理，然后通过二硫键共价固定以上引物。
3.选用pfu DNA多聚酶，优化反应条件(20mM Tris-HCl pH8.3，20mM KCl，1mMMgCl2，0.1mg/ml BSA，50μM dNTPs)，在对酶的聚合活性影响不大的前提下，提高酶的外切酶活性。
4.使用pfu DNA多聚酶，以外引物为液相引物，以临床样品为模板，在相同条件下对以上三条引物进行固相半巢式PCR，在扩增过程中掺入生物素；反应条件为94℃ 3’1cycle；94℃ 45”，65℃ 2’15” 30 cycles；65℃ 10’1cycle。
5.运用酶标技术，对扩增结果进行原位信号检测封阻液进行室温封阻15分钟，甩干；亲和素标记碱性磷酸酶室温作用15分钟；漂洗液漂洗两次，15分钟/次；底物缓冲液漂洗5分钟，甩干；加底物NBT/BCIP，37℃显色约30分钟。
权利要求
1.一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法，它包括下列步骤A.根据目标基因，设计一对外引物和内引物，后者与基因突变热点相对应，对内引物的两个末端分别进行二硫化物和磷酸化修饰；B.对普通载玻片进行巯基硅烷化修饰，固定突变热点对应引物；C.选用pfu高保真DNA多聚酶，优化反应条件为20mM Tris-HCl pH 8.3，20mMKCl，1mM MgCl2，0.1mg/ml BSA，50μM dNTPs；使酶的外切酶活性达到最佳；D.使用高保真酶，以外引物为液相引物，以临床样品为模板，在相同条件下对内引物进行固相半巢式PCR，特异性扩增突变位点对应内引物，在扩增过程中掺入生物素；E.运用酶标技术，对扩增结果进行原位信号检测，封阻液进行室温封阻15分钟，甩干，亲和素标记碱性磷酸酶室温作用15分钟，漂洗液漂洗两次，15分钟/次，底物缓冲液漂洗5分钟，甩干，加底物NBT/BCIP，37℃显色30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种固相载体上校读PCR检测基因突变的方法,设计引物,经二硫化物和磷酸修饰处理后,固定于普通载玻片,进行固相PCR反应;在PCR过程中,利用DNA多聚酶的3’－5’外切酶活性,实现突变基因的固相有效扩增,PCR过程中掺入生物素,扩增产物用酶标方法进行原位检测。本发明可对同一基因多个突变发生位点进行同步检测,对多个不同基因的基因突变情况进行检查,检测速度快,灵敏度高,操作简便,成本低,可用于细菌耐药性、遗传病等的临床检测。
文档编号C12Q1/68GK1348993SQ01133630
公开日2002年5月15日 申请日期2001年11月2日 优先权日2001年11月2日
发明者张先恩, 邓教宇, 张治平, 文继开, 陆红兵, 刘强, 刘虹, 谢卫红, 谢斌 申请人:中国科学院武汉病毒研究所