专利名称：重组质粒psp1,转化微生物,产生一种碱性蛋白酶vapk的方法
技术领域：
本发明涉及到了一种包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的基因vapk、和可增加质粒载体自身稳定性的par基因的重组性质粒载体pSPI，该重组性质粒载体转化的一种微生物metschnikovii弧菌，以及应用该微生物来产生一种碱性蛋白酶VapK的方法。
应用上述的微生物来产生碱性蛋白酶的最重要的因素，是碱性蛋白酶的高生产率问题，这可以影响生产过程中的成本。
根据近年来的研究，包含有编码碱性蛋白酶的重组性载体可以应用基因工程的技术加以制备，为了提高碱性蛋白酶生产率而制备转化体。此外，质粒性载体的稳定性可能会直接影响碱性蛋白酶的生产率，因此，也就有了若干与提高重组性质粒载体稳定性有关的研究加以报道。
本发明人此前所申报的一份专利申请(KR 1999-12588)命名为“适用于洗衣店去污剂的碱性蛋白酶VapK，vapk基因，重组性表达载体，以及经转化的微生物”，其中的微生物是metschnikovii弧菌KS1，并且重组性表达载体为pSBCm。在本发明中，也是应用了与之相同的微生物和重组性表达载体。
为了应用改进的稳定性的重组性质粒载体产生出转化的微生物，本发明者曾经进行了深入细致和广泛地研究并加以验证。首先，制备了一种包含有碱性蛋白酶基因和par基因的重组性质粒载体，碱性蛋白酶基因分离自metschnikovii弧菌KS1，par基因具有增加质粒载体自身稳定性的功能，并且，转化的metschnikovii弧菌带有上述的重组性质粒载体，因此，包含有已提高了稳定性和蛋白酶活性的质粒载体的转化微生物也加以制备。
本发明还提供了一种能够得到权利要求1中所提及的重组性质粒载体pSP1的方法，即通过将par基因插入到一种重组性质粒载体pSBCm(KCCM-10142)的PvuII和HincII识别位点之间构建而成，而重组性质粒载体pSBCm所包含的vapk基因，可编码一种来源于弧菌的碱性蛋白酶，其中的par基因具有改善质粒载体自身的稳定性的功能。
还有，本发明提供了一种已转化的宿主细胞，它包含有重组性质粒载体pSP1。
此外，本发明提供了一种已转化的宿主细胞，该宿主细胞包括埃菲氏属大肠杆菌或者metschnikovii弧菌。
本发明还提供一种应用上述的转化的宿主细胞产生一种碱性蛋白酶VapK的方法。
图1说明了包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的vapk基因的重组性质粒载体pSBCm的电泳结果。电泳泳道M代表的是标准参照物的大小，电泳泳道1代表的是重组性质粒载体pSBCm，电泳泳道2代表的是重组性质粒载体pSBCm/Hind III，它由一种2.2千碱基对的运载体pKF3和一种2.9千碱基对的弧菌的碱性蛋白酶基因所组成。
图2说明了包含有碱性蛋白酶基因vapk的重组性质粒载体pSBCm的限制性内切酶谱。
图3说明了包含有碱性蛋白酶基因vapk和par基因的重组性质粒载体pSP1的限制性内切酶谱。
发明的详细描述本发明提供了一种由包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的vapk基因、和能够增强质粒载体自身稳定性的par基因的重组性质粒载体转化的微生物，并且提供了一种在上面所提及的转化微生物内部，增强重组性质粒载体稳定性的方法。
根据本项发明，编码碱性蛋白酶的基因是经过以下的几个步骤加以分离的培养metchnikovii弧菌KS1，离心并回收metchnikovii弧菌KS1细胞，使这些细胞破裂并将其离心以获得无细胞的上清液，以及从这种无细胞的上清液中提取metchnikovii弧菌KS1的染色体DNA。应用以上提取的metchnikovii弧菌KS1的染色体DNA，形成转化的埃菲氏属大肠杆菌，即通过应用如HindIII的限制性内切酶，酶切消化上述的metchnikovii弧菌KS1的染色体DNA，形成DNA片段，将这些DNA片段克隆入质粒载体中，构建成为pSBCm和pSP1，并将这些载体转化入埃菲氏属大肠杆菌中。
首先，碱性蛋白酶的表达是通过应用上面所提及的重组埃菲氏属大肠杆菌加以引导的，该大肠杆菌中包含有质粒载体pSBCm，并且在碱性的情况下，由转化的埃菲氏属大肠杆菌所产生的碱性蛋白酶的表达水平是可以测量的。在这种结果的基础上，正如我们以前所知道的，上面所提及的转化的埃菲氏属大肠杆菌的碱性蛋白酶的表达是较低的。
为了解决上述问题，本项发明者将重组性质粒载体pSBCm克隆入弧菌中。然而，结果却是重组性质粒载体pSBCm的稳定性较低。由此，为了提高上面所提及的重组性质粒载体的稳定性，作为众所周知的具有改善质粒载体自身稳定性功能的par基因，被插入到上述的重组性质粒载体pSBCm中，随即构建形成重组性质粒载体pSP1。结果，重组性质粒载体pSP1的稳定性，比没有par基因的重组性质粒载体pSBCm升高了40％。
本项发明中所应用的metchnikovii弧菌KS1菌株，收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年12月15日，编码为KFCC-10141。该菌株通过应用N，N-亚硝基胍(NTG)作为突变剂，处理metchnikovii弧菌RH530N-4-8而产生的，并且metchnikovii弧菌RH530N-4-8则收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年2月23日，编码为KFCC-11030。结果，由metchnikovii弧菌KS1菌株产生的碱性蛋白酶的量，是metchnikovii弧菌RH530N-4-8菌株的两倍。
还有，包含有本项发明中重组性质粒载体pSBCm的埃菲氏属大肠杆菌Top10F′菌株，则收录于汉城的韩国微生物培养中心，其登记时间是1998年12月15日，编码为KCCM-10142。
在下文中，将通过以下提供的诸多例证，更加详细地描述了本项发明的特殊功效，并不限制本发明的精神和范围。
埃菲氏大肠杆菌HB101菌株在LB培养基中培养后，把100mM浓度的氯化钙添加到埃菲氏大肠杆菌HB101的液体培养基中。该混合物在0℃储存15分钟，然后离心收集埃菲氏大肠杆菌HB101。将沉淀细胞悬浮在100mM氯化钙溶液中，在0℃储存15分钟。把重组质粒载体pSBCm添加到悬浮溶液中，在0℃储存1小时。该上清液在42℃加热90秒，然后在0℃储存5分钟。在上清液中加入1ml的LB培养基，然后铺在含有34μg/ml的氯霉素的LB琼脂培养基中，30℃孵化24小时，挑选生长的克隆。
在30℃下的LB培养基中培养metchnikovii弧菌KS1菌株后，通过在4℃下，每分钟6,000转离心10分钟，以收获已长满的细胞，并且将它们以20∶1的体积比，悬浮于一种H-缓冲溶液中，该缓冲液包含有200毫摩尔浓度的蔗糖，1毫摩尔浓度的HEPES和10％的丙三醇。在重复上述实验步骤两次以后，细胞被悬浮在80μl的H-缓冲溶液中。将重组性质粒载体添加入悬浮液中，并且将这种溶液倒入一0.2厘米的试管中。在1,500V的电压下，将含有10μF和200Ω的细胞悬液的试管放入由Bio-Rad公司制造的基因电脉冲仪II中。添加600μl的LB培养基入电穿孔处理溶液并在30℃下孵育。培养基覆盖在含有25□/ml氯霉素的LB琼脂培养基上面，挑选生长的克隆。
产业上的适用性根据本项发明，通过应用一种metchnikovii弧菌菌株，来改善包含有编码一种碱性蛋白酶vapk基因的重组性质粒载体稳定性的方法，其应用可能是有效的。
权利要求
1.一种重组性质粒载体pSP1，其中的par基因是被可隆入一种重组性质粒载体pSBCm(KCCM-10142)中的，而重组性质粒载体pSBCm则包含有编码一种碱性蛋白酶的vapk基因，以改善质粒载体自身的稳定性。
2.一种能够得到权利要求1中所提及的重组性质粒载体pSP1的方法，即通过将par基因插入到一种重组性质粒载体pSBCm(KCCM-10142)的PvuII和HincII识别位点之间构建而成，而重组性质粒载体pSBCm所包含的vapk基因，可编码一种来源于弧菌的碱性蛋白酶，其中的par基因具有改善质粒载体自身的稳定性的功能。
3.一种转化的宿主细胞，它包含有权利要求1中的重组性质粒载体pSP1。
4.根据权利要求3中的转化宿主细胞，其中该宿主细胞包含有埃菲氏属大肠杆菌或者metschnikovii弧菌。
5.一种产生碱性蛋白酶VapK的方法，应用权利要求3或4中的转化宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及到了一种包含有编码一种碱性蛋白酶VapK的基因vapk，和可增加质粒载体自身稳定性的par基因的重组性质粒载体，该重组性质粒载体转化的一种微生物metschnikovii弧菌，以及应用该微生物来产生一种碱性蛋白酶VapK的方法。
文档编号C12N1/21GK1441847SQ01812800
公开日2003年9月10日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月19日
发明者秦基洪, 李贤焕, 卢贤模, 金炯锡 申请人:第一制糖株式会社