P2y嘌呤受体的表达在鉴定肿瘤前期和肿瘤状态中的应用的制作方法

专利名称：P2y嘌呤受体的表达在鉴定肿瘤前期和肿瘤状态中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定哺乳动物的肿瘤前期和肿瘤状态的方法，特别是根据P2Y嘌呤受体的差异性表达鉴定细胞和组织中的肿瘤前期和肿瘤形成的方法。
背景技术：
在进行癌症诊断时，必须考虑到活检样品中诸如癌细胞体积和形状的变异性程度、活跃分裂细胞的比例以及对邻近组织的入侵等细胞特点。常用的组织学染色剂是苏木精(初染)和伊红(复染)，它们可差异性标记亚细胞成分。其他诊断方法是采用针对细胞成组织中(通过细胞内表位)或细胞/组织表面(通过细胞外表位)的特定诊断性分子的抗体，使这些分子，如癌胚抗原(CEA))在显微镜/分析中可见，一些具体实施例叙述如下。
前列腺癌在西方国家中，前列腺癌的发生率正以惊人的速率增长，过去五年中，其增长超过1倍。在所有肿瘤中，它有最高的发生率，仅次于全世界男性癌死亡最常见病因的肺癌，是澳大利亚的第一位癌症死亡病因[1]。良性前列腺增生(BPH)在50岁以上的男性中常见，它可能是前列腺上皮内瘤形成(PIN)的前兆，其本身是前列腺癌的前兆。尸体解剖研究表明70％男性达到80岁后，其前列腺中有恶性细胞[2]。
尽管这种情况很严重，但诊断方法却很少，且不精确。目前评估预后的方法，例如直肠指检法(DRE法)、超声波法、前列腺酸性磷酸酶水平法、雄激素剥夺法，前列腺特异性抗原(PSA)密度法、PSA速变法、PSA年龄特异性参考范围法以及Gleason组织病理学分级法都不能对前列腺癌的临床结局提供可靠的预测信息[3]。例如，研究显示DRE的结果有36.9％假阴性率[4]。PSA是与前列腺外许多组织相关的一种33-kDa的丝氨酸蛋白酚[5]，受雄激素、糖皮质激素和黄体酮的上调，据认为参与生长因子的调节。不幸的是，血清PSA水平的假阴性诊断率为23％，假阳性诊断率为36.7％[5]。甚至有人提出超过半数的新筛检病例实际上为假阳性[6]。试图通过引进其他的测试法，例如PSA密度。速率以及年龄特异性参考范围来改进筛检方法结果也是不确定的。一项研究表明，将正常PSA上限提高到4.5ng/mL的年龄特异性PSA参考范围的应用结果并不能检测出大量的临床上明显的癌症[7]。由于这种不确定性，常进行前列腺的活组织检查来证实恶性，但这种检测方法很令人不满意，存在23％的假阴性诊断率[8]，原因是未能直接采到发生癌变部位的样品。
治疗方法的选择在很大程度上取决于根据组织切片显微镜分析得出的临床阶段[9]。这种技术依赖于对组织学表现与临床结局相关性的判断和相当的经验。不幸的是，前列腺癌组织是有名的异质性的，而某一种重要的诊断特征可能在切片检查时很容易被忽略。使这种情况更加复杂化的是，尚没有检验外科手术或是放射治疗结果的随机和可控制的试验[2]。可选择的治疗方法包括基本上前列腺切除术、放射治疗法、雄激素剥夺法和“观测性等待”。“观测性等待”对根治性干预问题的明确回答需等待前列腺癌干预对观察试验的结论[10]。这些决定的结果对于病人而言是严重的。例如前列腺切除术法常常导致小便失禁，阳痿，膀胱颈狭窄，疼痛和消沉[11]。
对于其他诸如乳腺癌或皮肤癌等癌症，采样可能由于若干原因而被错误诊断.例如乳腺肿瘤，定位肿瘤的边界可能不很明确，类似于皮肤癌，(如果H & E染色判定)组织学上明显癌瘤和正常组织之间的边界也是常常变化的。在这些肿瘤的周围切下了或多或少的超过期望的正常组织。
本发明的目的是提供一种鉴定肿瘤前期和/或肿瘤细胞的方法，从克服或基本上改善当前技术的至少某些缺陷或提供有效的替代方法。

发明内容
P2Y嘌呤受体是能结合三磷酸腺苷的G蛋白偶联组织受体，某些P2Y受体亚型能结合三磷酸尿苷。已令人惊奇地发现P2Y受体的表达模式可以用来诊断哺乳动物的肿瘤前期形成以及肿瘤的形成。
哺乳动物的癌前期和癌症各个阶段伴随着在生长，细胞外基质，新陈代谢和神经支配因子上的显著差异以及上皮下离子钙和微管的增加。采用本发明的新的抗体，P2Y受体可以容易地通过免疫细胞化学方法而观察到，并且已显示它们存在各种各样的表达模式，如细胞表面，管状和斑点标记。这些表达模式可以用于鉴定癌发展的不同阶段，从完全正常组织开始，发展至肿瘤前期。以P2Y受体在前列腺中表达为例，最初出现在单个受影响腺胞的细胞核内。在更进一步但尚没有出现癌形态迹象的肿瘤前状态中，这些受体离开细胞核而扩散进入腺胞中的细胞质、侧膜和基底膜，然后沉积在上皮细胞的顶膜上，同步发生伴有早期癌症的形态学变化。由于这些阶段在性质上较形态学定义的肿瘤明显区域更普遍，这种诊断性分阶段并不限于用来指导紧邻肿瘤区域的取样，而且可以检测远处肿瘤的存在。因此，本发明为诊断癌症前期状态(如增生)至癌症阶段，以及为研究癌症发生的生理学和病因学提供了一种新方法。
根据第一方面内容，本发明为诊断哺乳动物肿瘤前期和/或肿瘤状态提供了一种方法，所述方法包括检测所述哺乳动物细胞和/或组织的P2Y嘌呤受体表达图，并将其与正常细胞和/或组织的预先确定的表达图作比较。
根据第二方面内容，本发明为确定哺乳动物肿瘤前期和肿瘤状态的各阶段提供了一种方法，包括检测所述哺乳动物细胞和/或组织的P2Y嘌呤受体表达图，并将其与正常细胞和/或组织的预先确定的表达图比较。
根据第三方面内容，本发明为确定哺乳动物癌发生的病因学提供了一种方法，包括检测所述哺乳动物细胞和/或组织的P2Y嘌呤受体表达图，并将其与正常细胞和/或组织的预先确定的表达图作比较。
优选所述的哺乳动物是人，但这一方法可以适用于包括马，牛，羊，狗，猫，大鼠和小鼠的任何适当的哺乳动物。
细胞和/或组织优选来自于前列腺/乳腺或皮肤。然而熟练技术人员将认识到这种方法也可能适用于包括上皮细胞的其他的细胞类型。
当肿瘤前期或肿瘤状态是前列腺癌前期或前列腺癌时，与正常的前列腺细胞或组织的表达图相比，其前列腺细胞或中的P2Y2嘌呤受体表达图强度增强，本文即定义为存在前列腺癌前期或前列腺癌的诊断指标。
当肿瘤前期或肿瘤状态是乳腺癌前期或乳腺癌时，与正常的乳腺细胞或组织的表达图相比，其乳腺细胞或组织的P2Y2嘌呤受体的表达图强度减弱，本文即被定义为存在乳腺癌前期或乳腺癌的诊断指标。
当肿瘤前期或肿瘤状态是皮肤癌前期或皮肤癌时，与正常的皮肤细胞或组织的表达图相比，其皮肤细胞或组织的P2Y2嘌呤受体的表达图强度减弱，本文即定义为存在皮肤癌前期或皮肤癌的诊断指标。
皮肤癌宜为恶性黑色素瘤，鳞细胞癌或基底细胞癌。因而，按照本发明，辨别皮肤癌状态与那些所述及的角化棘皮瘤和光化性角化病等其他良性损害是可能的。
优选的P2Y受体表达图是P2Y2，P2Y4，和/或P2Y6受体表达图，更优选的是P2Y2受体表达图。熟练技术人员能够不经过过多的实验而确定哪种P2Y受体最适合用来实践该具体方法。一般而言，那些能够在肿瘤前期或肿瘤细胞/组织与正常细胞或组织相比在表达图强度的差异上产生最大对比的P2Y受体是最理想的。
在一个实施例中，肿瘤前期状态是P2Y受体表达图中细胞核发生变化的早期、肿瘤前期状态。或者，在另一实施例中，肿瘤前期状态是一种较晚的前期状态，其中P2Y受体表达图是P2Y受体在细胞质和/或侧膜和/或基底膜内表达的图谱。
在另一实施例子中，肿瘤状态是一种P2Y受体在上皮细胞的顶膜上表达的图谱。
熟练技术人员将会明白，P2Y受体表达图可以联合其他标记的表达图。具体说，P2Y受体表达图可以联合P2X受体表达图，优选P2X1和/或P2X2表达图。
优选P2Y受体表达图用免疫组织化学方法来检测。然而，熟练技术人员将会明白，根据细胞或组织样品的来源以及可获得的试剂，P2Y受体可以用包括ELISA，RIA或类似的免疫学技术等其他方法检测。优选P2Y受体用比色试验例如DAB(二氨基联苯胺)或LSAB(标记的链霉亲和素生物素技术)第二抗体检测试剂盒(Dako)来检测。
本领域熟练技术人员将会明白，标准的Western印迹技术和标准的P2Y嘌呤受体mRNA的Northern测定方法也可用于测定P2Y受体表达图。
根据第四方面内容，本发明提供了能鉴别肿瘤前期或肿瘤细胞和/或组织与正常细胞和/或组织的P2Y嘌呤受体的特异性抗体。
优选该抗体对于P2Y2，P2Y4，和/或P2Y6受体是特异性的。最优选该抗体对于P2Y2受体是特异性的。
本领域熟练技术人员将会明白，P2Y受体特异性抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本领域熟练技术人员将会明白，P2Y受体特异性抗体可与其他抗体联用，具体说与一种或多种P2X受体特异性抗体联用。P2X受体特异性抗体也可以是单克隆或多克隆抗体。在优选实施例中，P2X受体的抗体是P2X和/或P2X2受体特异性抗体。
根据第五方面内容，本发明提供了包括前述第四方面抗体的一组抗体。
根据第六方面内容，本发明提供了第四方面所述的P2Y嘌呤受体的特异性抗体，或第五方面所述的一组抗体，用于鉴别肿瘤前期或肿瘤细胞和/或组织与正常细胞和/或组织。
根据第七方面内容，本发明提供了与第四方面所述P2Y嘌呤受体特异性的抗体或与第五方面所述一组抗体结合的分离的哺乳动物细胞或组织样。
本发明中所用的细胞和/或组织可以从活组织检查中得到(例如通过细针抽取，特别是从乳腺组织中抽取)，但也可以用任何其他方法获得，包括从体液中获得，或者如果是前列腺细胞和/或组织，则可从直肠指检渗出物或精液中获得。
本领域技术人员将会明白，本发明的方法和P2Y受体特异性抗体可以与其他互补性检测方法联用，例如肿瘤恶性试验。肿瘤恶性度试验可以采用针对人端粒酶蛋白质(hTP1)的特异性抗体进行抗端粒酶抗体测试，或者任何其他适当的试验，例如抗肌腱蛋白试验。
根据第七方面内容，本发明提供了诊断哺乳动物肿瘤前期和/或肿瘤状态的试剂盒，其含有检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
根据第八方面内容，本发明提供了确定哺乳动物肿瘤前期和/或肿瘤状态阶段的试剂盒，其含有检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
根据第九方面内容，本发明提供了确定哺乳动物癌发生病因学的试剂盒，其含有检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
优选测定P2Y嘌呤受体表达图的试剂，是第四方面所述的抗体或是第五方面所述的一组抗体。
该试剂盒优选应用于第一方面至第三方面任一所述的方法中。
在本发明上下文中所述及的“肿瘤细胞”和“肿瘤组织”术语，按其普通含义理解，包括但不限于具有肿瘤细胞或组织特征的细胞或组织，例如，增生或肥大性生长模式以及被苏木精和伊红染料(即H&E)特征性着染突现异常的细胞形状大小和细胞核大小。
在本发明上下文中所述及的“肿瘤前期细胞”和“肿瘤前期组织”术语，按其普通含义理解，包括但不限于增生或肥大性生长的细胞或组织。但是所述的细胞或组织并没有肿瘤细胞或组织的特征，例如被H&E特征性着染的肿瘤细胞或组织突现异常的细胞形状大小和细胞核大小。
在本发明上下文中所述及的“正常细胞”和“正常组织”的术语，按其普通含义理解，包括但不限于与既没有肿瘤前期形成也没有肿瘤形成的个体的细胞的P2Y表达图(相比)没有可见的实质性改变的细胞或组织。在本发明上下文中所述及的与前列腺状态相关的“正常细胞”术语还包括从良性前列腺增生的前列腺获得的细胞。
在本发明上下文中所述及的“一组抗体”术语包含多克隆抗体，其含有对相同或不同抗原具有特异性的几种不同抗体而能特异性辨别各种受体亚型。当此抗体为单克隆抗体时，“一组抗体”还包括能够特异性辨别每种受体如P2Y和P2X或受体亚型如P2Y2和P2Y4的抗体组。
在本发明上下文中所述及的“表达图谱”的测定，包括表达模式或强度的测定。
除非在上下文中另有明确要求，本说明书和权利要求中的词汇“包含”，“包括”以及类似的措词，构成了包含含义，与排除或去除含义相反；即，含义为“包括，但不限于”。
附图简要说明

图1显示肿瘤形成前期的第一阶段，用P2Y2抗体标记的突出的上皮细胞核。
图2显示典型的肿瘤形成前期的第二阶段，(箭头处)肿瘤着色，标示形成一点状模式而细胞核内无着色，尚无癌症的形态学证据。
图3着色显示P2Y2聚集在组织的顶部上皮(箭头)上，显示伴随癌瘤的进展，形态学变化的证据。
图4显示第三期病例前列腺组织(明显的癌肿瘤)的P2Y2，P2X1和P2X2抗体联合标记。
图5显示用P2Y2，P2X1和P2X2抗体联合标记的非癌性乳腺组织(纤维腺瘤)。用此混合抗体标记后，观察到标记强度有小的提高。
图6显示用P2Y2标记的一组相似的非癌性纤维腺瘤切片，显示接近的相似着色。
图7显示用P2Y2，P2X1和P2X2抗体联合标记的癌性乳腺组织。该癌性组织没有被标记。
图8显示用P2Y2标记的乳腺癌组织，显示非常相似的阳性着色缺失。
图9显示用P2Y2抗体标记的正常皮肤良性损伤的活组织切片检查的实例，可见受标记的突出的细胞核(PN)。
图10显示用P2Y2抗体标记的恶性黑色素瘤的活组织切片，所有在正常样品中可见的标记在恶性黑色素瘤中都缺失了。小于2m的黑色素瘤的正常标记得到恢复。联合应用上述抗体得到相同的结果。
具体实施例方式
本发明的基础是发现肿瘤前期和肿瘤细胞差异性表达了P2Y嘌呤受体。这种差异性表达可以用来鉴定肿瘤前期和肿瘤细胞。另外，由于在肿瘤形成前期和肿瘤形成的不同阶段，P2Y嘌呤受体在细胞中分布不同，P2Y嘌呤受体的表达图可用于肿瘤前期和肿瘤状态阶段的确定。P2Y的差异性表达模式也可用于确定癌发生的病因学。并且，本发明包括含有检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂的诊断肿瘤前期和/或肿瘤状态的试剂盒；含有检测P2Y嘌呤受体表达图试剂的确定肿瘤前期和/或肿瘤状态阶段的试剂盒，含有检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂的确定癌发生病因学的试剂盒。
现在通过实施例描述的优选实施方式实施例1.抗体的产生按照Hansen等[15]采用的方法，检验了人P2Y2[12]、人P2Y4[13]和人P2Y6[14]克隆受体共有序列的适当的抗原性表位。采用了与P2Y2中Leu226-Lys242区段相对应的非同源性抗原表位和相当的P2Y4(Arg226-Arg242)及P2Y6(Cys220-Lys236)序列。各种通过在P2Y2和P2Y4表位添加N-末端Cys经马来酰亚胺辛酸-N-羟基琥珀酰亚胺交联接头与白喉类毒素相连。所有的合成均用标准的t-BOC化学材料在ABI合成器中完成[16]。将此肽-抗原交联物用水配成5mg/ml的悬浮液，取等份与完全Freund’s佐剂混合乳化。随后肌肉注射含有2mg肽和不完全Freund’s佐剂的1ml乳液，间隔两周进行第二，第三，第四，第五次免疫。在第10到12周，在确认所用兔子或羊已得到了针对各抗原表位的足够的抗体滴度后，通过静脉穿刺作最终采血。将血液37℃温育30分钟，4℃保存15小时后离心收集血清，分成小等份零下20℃存储。用ELISA试验测定血清中针对各个肽的特异性抗体。抗体滴度定义为EUSA试验中产生的吸光值高于本底1.0的血清稀释度的倒数。其测定值在75000+/-4000范围内，与之相比，免疫前血清样品的滴度为225±25。发现各抗体对特定亚型均有特异性。
将各抗体用其特定抗原表位作亲和纯化，结果该抗体的本底降低但标记倾向相同。抗小鼠P2Y2抗原表位的单克隆抗体产生了相同结果。
实施例2.免疫组织化学程序用Reichert Jung 2800冷冻低温切割刀从非固定的冰冻组织中或从石蜡包埋组织中切得厚度8μm的切片。使切片在室温中空气干燥1小时后，在零下20的丙酮中固定12小时，在室温中再空气干燥1小时然后进行抗体标记。将其与单克隆的小鼠，兔或绵羊抗-P2Y2第一抗体一起室温培育。洗涤之后，将切片与第二抗体一起培育30分钟对小鼠第一抗体为1∶30稀释的HRP-偶联的山羊抗小鼠第二抗体(Dako)，对家兔第一抗体为HRP-偶联的抗兔第二抗体或HRP-偶联的山羊抗绵羊第二抗体。再洗涤切片之后，将其浸在15％的二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB-Sigma)中10分钟。淋洗切片，空气干燥后安置于DPX(Merck)中。对照切片与第一次培育稀释缓冲液一起培育，之后用与实验切片相同的方式进行处理。除了第一抗体用非免疫血清替代外，阴性对照切片用与实验切片相同的方式进行处理。
证实了所有抗体的独特特异性。
实施例3.人(前列腺)癌组织中的P2Y受体在一项对40个正常人和40个人前列腺癌病例的研究中，人前列腺癌组织中的P2Y2亚型显著增加。正常组织或良性前列腺增生没有可见的标记。癌组织中的P2Y2标记模式非常独特，在前列腺癌的各阶段有更大比例的被标记的腺泡上皮细胞，这表明癌瘤转化与P2Y2腺泡标记的程度之间直接相关，始于细胞核(阶段1；图1)，发展到细胞核外或细胞质中点状标记(第2阶段，图2)，再发展到顶端和侧面上皮细胞出现沉积(阶段3；图3)，在晚期第3期病例还伴随有形态学上的变化。
P2Y和P2X受体抗体联用P2X是快速起作用的配体(ATP)-门控离子通道，其将离子尤其是钙离子进入细胞的通道打开。P2Y受体是代谢回归作用相对较慢的感受体，其进行内部细胞钙存储时须先由ATP或UTP甚或ADP通过引发G-蛋白层叠结合的活性激活，其功能与P2X受体完全不同。
当P2X受体抗体与P2Y受体抗体联用时，得到了与单用P2Y受体抗体所述的相似模式。特别是用抗P2Y2受体抗体和抗P2X1或P2X2受体亚型抗体的一种或两种标记前列腺细胞/组织时，得到的结果要比单用抗P2Y2受体抗体更好。
按下述方法产生了P2X抗体按照大鼠抗体[15、24]所用的方法检查了人P2X1[17]、人P2X2[18]、人P2X3[19]、人P2X4[20]、人P2X5[21]、人P2X6[22]和人P2X7[23]的共有序列中的合适的抗原表位。与P2X1中所用的Lys68-Val84区段相对应的非同源性抗原表位中添加了N-末端Cys。从P2X2选择得到His209-Cys226。从P2X3选择得到Asn185-Cys203。从P2X4选择得到Cys270-Glu285。从P2X25选择得到Cys272-Ser288。从P2X6选择得到Asn200-Cys218。从P2X7选择得到添加了C-末端Cys的Val65-Lys81。将所有表位通过马来酰亚胺辛基-N-羟基琥珀酰亚胺交联与白喉类毒素相连。在家兔和绵羊中产生了抗体并如上述对P2Y抗体的方法进行纯化。
图4显示联用P2Y2，P2X1，P2X2抗体标记的第三期病例(明显癌症)的前列腺组织。
同诸如P2X3.P2X7等其他P2x亚型结果与前列腺样品的结果相类似。
实施例4.人(乳腺和皮肤)癌组织中的P2Y受体在其他癌症例如乳腺癌(单一或多个病灶)和包括恶性黑色素瘤的皮肤癌中，此标记模式是相反的。在这些组织中，正常组织的P2Y2抗体标记强列(提示P2Y2在正常细胞中表达较高)，而在癌组织中没见到P2Y2抗体标记。在联用抗P2X受体抗体和抗P2Y2受体挤体，尤其是抗P2X1和P2X2亚型抗体，结果更为明显(图5-图10)。
实施例5.P2Y受体抗体诊断与其他检验方法联用显然，上述的P2Y(和P2X)受体抗体诊断法可以与其他互补检验方法联用。这些检验方法可能对癌症的性质提供更多的信息，例如，用来诊断肿瘤恶性的试验，如抗端粒酶抗体试验，和/或抗-肌键蛋白试验可用于设计治疗方案。
尽管本发明通过参见特定的实施例进行了描述，但本领域熟练技术人员会懂得本发明可以用许多其他的形式进行实施。
权利要求
1.一种诊断哺乳动物肿瘤前期和/或肿瘤状态的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述哺乳动物的细胞和/或组织中的P2Y嘌呤受体表达图并将其与预先确定的正常细胞和/或组织的表达图作比较。
2.一种确定哺乳动物肿瘤前期和/或肿瘤状态阶段的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述哺乳动物的细胞和/或组织中的P2Y嘌呤受体表达图并将其与预先确定的正常细胞和/或组织的表达图作比较。
3.一种确定哺乳动物癌发生病因学的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述哺乳动物的细胞和/或组织中的P2Y嘌呤受体表达图并将其与预先确定的正常细胞和/或组织的表达图作比较。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人、马、牛、羊、狗、猫、大鼠或小鼠。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞和/或组织源于前列腺、乳腺、皮肤或其他上皮组织。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤前期或肿瘤状态是前列腺癌前期或前列腺癌，其前列腺细胞或前列腺组织中的P2Y2嘌呤受体表达图与正常前列腺细胞或前列腺组织中的表达图相比强度增加，是前列腺癌前期或前列腺癌的诊断性指标。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤前期或肿瘤状态是乳腺癌前期或乳腺癌，其乳腺细胞或乳腺组织中的P2Y2嘌呤受体表达图与正常乳腺的乳腺细胞或乳腺组织中的表达图相比强度降低，是乳腺癌前期或乳腺癌的诊断性指标。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肿瘤前期或肿瘤状态是皮肤癌前期或皮肤癌，该哺乳动物皮肤细胞和/或组织中的P2Y2嘌呤受体表达图与正常皮肤的皮肤细胞或组织中的表达图相比强度降低，是存在皮肤癌前期或皮肤癌的诊断性指标。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述皮肤癌是恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌或基底细胞癌。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述P2Y受体表达图是P2Y2、P2Y4和/或P2Y6受体表达图。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述P2Y受体表达图是P2Y2受体表达图。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤前期状态是细胞的细胞核中P2Y受体表达图发生变化的早期肿瘤前期状态。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤前期状态是P2Y受体出现在细胞质内和/或细胞侧膜和/或细胞基底膜中的P2Y受体表达图的较晚肿瘤前期状态。
15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤状态是在内皮细胞顶膜上出现P2Y受体的P2Y受体表达图的肿瘤状态。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述P2Y受体表达图与其他标记的表达图联用。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述P2Y受体表达图与P2X受体表达图联用。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述P2Y受体表达图与P2X1和/或P2X2受体表达图联用。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述P2Y受体表达图通过免疫组织化学法或Western或Northern印迹技术检测。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述P2Y受体表达图通过ELISA法或RIA法检测。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述P2Y受体表达图通过比色试验检测。
22.一种P2Y嘌呤受体特异性抗体，其中所述抗体能够肿瘤前期或肿瘤细胞和/或组织与正常细胞和/或组织。
23.如权利要求22中所述的抗体，其中所述抗体是P2Y2、P2Y4和/或P2Y6受体的特异性抗体。
24.如权利要求23中所述的抗体，其中所述抗体是P2Y2受体的特异性抗体。
25.如权利要求22-24中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
26.如权利要求22-24中任一项所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
27.权利要求22-24中任一项所述的抗体与至少一种其他抗体联合。
28.如权利要求27所述的抗体，其中所述至少一种其他抗体是P2Y受体特异性抗体或P2X受体特异性抗体。
29.如权利要求27所述的抗体，其中所述P2X受体抗体是P2X1或P2X2受体特异性抗体。
30.如权利要求27-29中任一项所述的抗体，其中所述至少一种其他抗体是单克隆抗体。
31.如权利要求27-29中任一项所述的抗体，其中所述至少一种其他抗体是多克隆抗体。
32.一组P2Y抗体，其特征在于，所述抗体包括权利要求22-31中任一项所述的抗体。
33.如权利要求22-31中任一项所述的抗体或如权利要求32所述的一组抗体，在如权利要求1-21中任一项所述方法中的应用。
34.如权利要求22-31中任一项所述的抗体或如权利要求32所述的一组抗体，在辨别肿瘤前期或肿瘤细胞和/或组织与正常细胞和/或组织中的应用。
35.如权利要求1-21中所述的方法，其中所述细胞和/或组织通过活体组织检查得到。
36.如权利要求35中所述的方法，其中所述活体检查组织是通过细针抽吸从体液中得到的，或者如果是前列腺细胞和/或组织，则是从直肠指检渗出物或精液中获得。
37.如权利要求1-2 1中任一项所述的方法与一种互补试验联用。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述互补性试验是肿瘤恶性度试验。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述肿瘤恶性度试验是采用抗人端粒酶蛋白质1(hTP1)的特异性抗体进行的抗端粒酶抗体试验或是抗肌腱蛋白试验。
40.与权利要求22-31中任一项所述的P2Y嘌呤受体特异性抗体或权利要求32所述的一组抗体结合的分离的哺乳动物细胞或组织样品。
41.一种诊断哺乳动物中肿瘤前期和/或肿瘤状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
42.一种确定哺乳动物中肿瘤前期和/或肿瘤状态阶段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
43.一种确定哺乳动物癌发生病因学的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测P2Y嘌呤受体表达图的试剂。
44.如权利要求41-43中任一项所述的试剂盒，其中所述检测P2Y受体表达图的试剂是权利要求22至31中任一项所述的抗体或权利要求32中所述的一组抗体。
45.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物的细胞和/或组织邻近于肿瘤前期细胞或肿瘤细胞，其本身并非是肿瘤前期或肿瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及鉴定哺乳动物肿瘤前期和肿瘤状态的方法，具体是根据P2Y嘌呤受体差异性表达鉴定细胞和组织肿瘤形成前期和肿瘤形成的方法。
文档编号C12Q1/02GK1533440SQ01822353
公开日2004年9月29日 申请日期2001年12月11日 优先权日2000年12月11日
发明者J·巴登, M·斯莱特, J 巴登, 程 申请人:生物权威控股有限公司