专利名称：一种磷酸肌酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种磷酸肌酸的生产方法，特别是一种酶法生产磷酸肌酸的方法。
近年来，人们发现磷酸肌酸具有重要的药理作用，它是一种重要的心肌保护剂。大量的动物模型和临床实验已经证明它可以用于治疗心肌梗死，以及在心脏外科手术中减轻手术给病人心肌功能带来的损伤。因此，磷酸肌酸对改善病人心肌的能量代谢有重要意义。
目前磷酸肌酸的制备有合成和从肌肉提取两种方法。就合成法而言，化学合成法条件苛刻，成本高、产率低，而且由于大量使用酸碱等化学试剂会对环境造成破坏。就生物合成的酶法而言，则具有反应条件温和、反应速度快和专一性强等优点。在用酶法制备磷酸肌酸过程中，曾有用粗酶制剂作为酶原的发明，参见专利号为IT1044765的专利文献。该发明由于采用糖酵解中的某一物质，例如3-磷酸甘油酸，作为反应起始底物来生产磷酸肌酸，因此用的是包括肌酸激酶在内的复合酶体系，即动物肌肉细胞浆的粗抽提液。使用这样的粗酶体系，由于参与反应的酶较多，各种酶所要求的最适条件不同，因此不能保证同时满足所有酶的最适条件。最终结果是影响磷酸肌酸的产率。另外，用动物肌肉细胞浆制备的粗酶体系作为酶源，势必要加入较多的酶蛋白到反应体系中，这些酶蛋白在提纯时则成为一种必须分离除去的杂质，这给分离纯化带来困难。
本发明的目的在于提供一种磷酸肌酸的生产方法，生产过程可以监控，成本低，产率高，产物分离纯化容易，不对环境造成污染。
本发明是这样实现的一种磷酸肌酸的生产方法，包括下述步骤①制备肌酸激酶酶制剂；②配制反应物溶液反应物溶液中ATP的浓度为15-30mM，肌酸的浓度为ATP浓度的2-10倍，镁离子的浓度是ATP浓度的1-5倍，加入缓冲剂后调pH至7.5-10；③将反应物溶液在15℃-45℃保温；④加酶进行酶促合成反应在上述反应物溶液中加入浓度为10-5-10-3mM的肌酸激酶，酶反应过程中不时加入稀碱，测定pH值并维持其恒定，当反应液的pH不再发生变化时，终止反应；⑤磷酸肌酸的分离纯化用离子交换树脂吸附并洗脱磷酸肌酸。
所述酶反应过程中步骤②中反应物溶液中加入的缓冲剂为氨基乙酸，其浓度为10mM。
所述酶反应过程中步骤③中的反应物溶液在25℃-40℃保温。
所述酶反应过程中步骤④中加入稀碱后维持pH值在8-10。
所述酶反应过程中步骤⑤采用的是阴离子交换树脂吸附及洗脱，洗脱以0.01-0.05ml/ml树脂/min的流速通过上述阴离子树脂交换柱，采用电解质盐类作为洗脱剂进行梯度洗脱并收集磷酸肌酸组分。
所述酶反应中还可以包括下述步骤⑥将磷酸肌酸从大体积洗脱剂中分离并制备成磷酸肌酸钠盐。
本发明是利用从动物肌肉提取的肌酸激酶，以三磷酸腺苷和肌酸在最适酶反应条件下生产磷酸肌酸的过程。针对粗酶体系的缺点，我们采用较为纯净的肌酸激酶制剂作为酶原，以它的直接底物三磷酸腺苷作为初始底物，不仅保留了酶法的优点，而且使纯化和对反应的控制都更为便利。
肌酸激酶在哺乳动物肌肉细胞浆中的含量是很高的。我们进行生产磷酸肌酸的酶反应，由于反应体系只含一种生成磷酸肌酸的酶，因此容易控制酶反应条件，保证了磷酸肌酸的产率；由于我们所用酶的纯度较高，因此酶的用量较少，减少了杂蛋白混入产品的可能性，提高了产品的纯度。
ATP的制备在中国已是成熟的技术，ATP是一容易开发和找到的产品，使用ATP比使用其它物质，如三磷酸甘油酸，作为肌酸的磷酸源成本更低。由于ATP是经肌酸激酶反应使肌酸磷酸化的直接底物，所以反应完成后的产物分离便变得相对简单，这样也有利于提高产品的纯度。
本发明生产过程使用了监测酶反应程度的监测手段。由于在肌酸激酶反应过程中不断地放出H+，这给整个酶反应过程的监测提供了条件。根据酶反应过程中pH的变化，随时加入稀碱液以便保持酶反应在恒定的碱性条件下进行。根据稀碱液耗量的多少及反应过程中pH的变化，可以判断反应是否完成及完成的程度。
本发明在操作过程中省去了使酶失活这一通常步骤，从而避免了磷酸肌酸在该处理过程中的分解。
上述特点使本发明大大不同于以前的相关发明。按照本发明制备磷酸肌酸，不仅使得磷酸肌酸的生产能够在温和和可调控的条件下进行，而且产率稳定，生产规模可以根据需要自行确定。
为实施本发明的方法，肌酸激酶可来源于哺乳动物的肌肉。为了得到高活力的酶制剂，应该使用新鲜的动物肌肉。酶的制备和测活方法请参照“Methods inEnzymology”II.pp605-610。
反应混合物中磷酸肌酸产率，通过液相色谱法测定。离子交换柱是Mono QHR 5/5，缓冲液A是10mM K2HPO4，pH8.0；缓冲液B是50mM K2HPO4，pH8.0，0.5M NaCl；梯度是30分钟达到0-75％缓冲液B。测试仪器可用AKTA液相色谱仪或其它HPLC谱仪。产物产率由所得分离图谱中ADP和ATP在260nm峰的面积比来确定，参考文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，83，4162-4166，1986.。
为了使酶反应能在一较为恒定的条件下进行，应该在酶反应液中加入少许缓冲物质，使其具备一定的缓冲能力。为此目的优选使用氨基乙酸-NaOH缓冲液。酶反应可在pH7.5-10间进行。合适的温度是15-45℃，优选25-40℃。酶反应时间可以根据反应条件来改变，但通常是30分钟-5小时，优选时间是1.5-3小时。
本发明获得的磷酸肌酸可以很容易地回收。例如，反应结束后，反应液可用离子交换树脂分离提取，所得磷酸肌酸组分可进一步从酒精和水的混合物中经重结晶得到所需产品。
实施例1.一种制备磷酸肌酸的方法，包括下述步骤(1)制备肌酸激酶酶制剂原则上，哺乳动物的肌肉都可作为肌酸激酶制剂的来源。我们使用的是兔肌。制备步骤包括1).使兔急性致死取兔肌。兔肌应尽量去除筋膜和结缔组织，并将其剪成碎块，应避免有水混入；2).加入10mM KCl溶液，用高速捣碎机将兔肌捣成匀浆并在低温下抽提搅拌30分钟，离心取上清液；3).加入固体NH4Cl使溶液浓度达到100 mM；4).加入95％冷乙醇使其终浓度达至60％并在20℃下搅拌抽提2小时，使不耐受酒精的蛋白沉淀并离心除去；5).加入硫酸镁使肌酸激酶在酒精中沉出；6)用乙酸镁溶液抽提肌酸激酶的镁盐沉淀；7).在肌酸激酶的乙酸镁抽提液中加入冷乙醇，收集36-50％沉淀组分，溶于稀柠檬酸铵溶液中，分别对该溶液及稀NH4OH透析，高速离心所得上清液就是肌酸激酶制剂。测定酶制剂的浓度和比活力，放入低温冰箱保存待用。
(2)配制反应物溶液在含1260ml下述反应物的反应器中来进行酶反应ATP20mM，肌酸58mM，乙酸镁25mM，氨基乙酸10mM。
(3)将反应物溶液加温至30℃。
(4)加酶进行酶促合成反应在上述反应物溶液中加入肌酸激酶，使其浓度为33.3×10-4mM，酶反应在pH9.0下进行约3小时。为维持pH之恒定，应不时加入稀碱。反应进行中要不断搅拌。当反应液的pH不再发生变化时，停止反应。反应完毕后，用AKTA液相色谱仪给出的260nm处ADP和ATP峰面积之比来确定反应产率。反应产率通常可达80％左右。
(5)磷酸肌酸的分离纯化反应完毕后，反应液通过Dowex I或相类似的强阴性离子交换树脂。上述酶反应液为1610ml。该反应液通过一12.5×5cm的层析柱，接着用上柱缓冲液冲洗该柱。按260毫微米处的光吸收变化计算，吸附率可达99％；按210毫微米处的光吸收变化计算，吸附率是85％。
实施例2上述实施例1制备磷酸肌酸的方法中，步骤(2)反应物溶液中ATP的浓度为15mM，肌酸的浓度为30mM，缓冲剂Tris5mM，其它条件同实施例1。步骤(3)的温度为25℃。步骤(4)中，调pH至10反应时间为3小时。该反应磷酸肌酸产率为77％。
实施例3上述实施例1制备磷酸肌酸的方法中，步骤(2)反应物溶液中ATP的浓度为30mM，肌酸的浓度为300mM，反应物溶液中镁离子的浓度是50mM，缓冲剂Tris15mM。步骤(3)的温度为40℃。步骤(4)中，调PH至8.0反应时间为1.5小时。该反应磷酸肌酸产率为78％。
实施例4制得的磷酸肌酸经过置换反应可获得磷酸肌酸钠盐。
权利要求
1.一种磷酸肌酸的生产方法，其特征在于包括下述步骤①制备肌酸激酶酶制剂；②配制反应物溶液反应物溶液中ATP的浓度为15-30mM，肌酸的浓度为ATP浓度的2-10倍，镁离子的浓度是ATP浓度的1-5倍，加入缓冲剂后调pH至7.5-10；③将反应物溶液在15℃-45℃保温；④加酶进行酶促合成反应在上述反应物溶液中加入浓度为10-5-10-3mM的肌酸激酶，酶反应过程中不时加入稀碱，测定pH值并维持其恒定，当反应液的pH不再发生变化时，终止反应；⑤磷酸肌酸的分离纯化用离子交换树脂吸附并洗脱磷酸肌酸。
2.根据权利要求1所述的磷酸肌酸的生产方法，其特征在于所述酶反应过程中步骤②中反应物溶液中加入的缓冲剂为氨基乙酸，其浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的磷酸肌酸的生产方法，其特征在于所述酶反应过程中步骤③中的反应物溶液在25℃-40℃保温。
4.根据权利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生产方法，其特征在于所述酶反应过程中步骤④中加入稀碱后维持pH值在8-10.5。
5.根据权利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生产方法，其特征在于所述酶反应过程中步骤⑤采用的是阴离子交换树脂吸附及洗脱，洗脱以0.01-0.05ml/ml树脂/min的流速通过上述阴离子树脂交换柱，采用电解质盐类作为洗脱剂进行梯度洗脱并收集磷酸肌酸组分。
6.根据权利要求1或2或3所述的磷酸肌酸的生产方法，其特征在于所述酶反应中还可以包括下述步骤⑥将磷酸肌酸从大体积洗脱剂中分离并制备成磷酸肌酸钠盐。
全文摘要
本发明的名称是一种磷酸肌酸的生产方法。属于酶法生产磷酸肌酸的技术领域。目的在于提供一种磷酸肌酸的生产方法，生产过程可以监控，成本低，产率高，产物分离纯化容易，不对环境造成污染。本发明的步骤包括①制备肌酸激酶酶制剂；②配制反应物溶液；③将反应物溶液在15℃－45℃保温；④加酶进行酶促合成反应；⑤磷酸肌酸的分离纯化。本发明利用从动物肌肉提取的肌酸激酶，以三磷酸腺苷和肌酸在最适酶反应条件下生产磷酸肌酸。方法可操作性强，磷酸肌酸产率高，产物分离纯化容易，无污染。
文档编号C12P9/00GK1478899SQ0212920
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月27日 优先权日2002年8月27日
发明者侯立向 申请人:中国科学院生物物理研究所, 鞍山天物生制药有限公司