专利名称：鳜鱼弹状病毒毒株及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产动物病毒病原的分离、纯化及制备技术，特别涉及淡水名优鱼类病毒的体外增殖与检测技术、病毒纯抗原的制备技术、以及研制病毒细胞工程疫苗和基因工程疫苗的材料来源，更具体涉及一种鳜鱼弹状病毒毒株，还涉及鳜鱼弹状病毒株的制备方法，还涉及鳜鱼弹状病毒毒株在淡水鱼类病毒病原检测、鉴定和细胞工程疫苗与基因工程疫苗研制中的用途。
背景技术：
鳜鱼(Siniperca chuatsi，mandarin fish)为肉食性鱼类，肉质细嫩，无肋间小刺，古词言道“桃花流水鳜鱼肥”，可见，鳜鱼不仅体肥味美，且充满诗情画意，是特别受青睐的淡水养殖鱼类品种。鳜鱼有很大的国内外需求量，但随着鳜鱼人工繁殖技术的成功掌握和养殖量不断扩大，其病害问题也日益突出和严重，尤其是在二十世纪九十年代中后期，我国南方地区养殖的鳜鱼发生了大面积的爆发性流行病，致使有的鱼池中鳜鱼死亡率超过90％，甚至达到100％。仅在广东地区就造成年均损失超过亿元人民币的重大损失。已证实，鳜鱼流行病的发生与不同的病毒感染有关。
病毒是宿主细胞内的寄生物，至今尚无有效药物能杀灭入侵动物体内的病毒，制备和使用病毒疫苗仍是预防鳜鱼病毒病流行和危害最有希望的途经。病毒病不仅传染性强、发病快，能导致高死亡率，而且鳜鱼的病毒病原是复杂的。由于病毒病造成水产养殖业的巨大损失，已引起上至政府要员下至专家学者的高度重视，有关部委已组织多个科研单位开展了水产动物病毒病的专项研究。
关于鳜鱼虹彩病毒研究已有一些报道，包括鳜鱼虹彩病毒的超微观察和分离、鱼体回接感染和传播途经、细胞培养、核酸的分析、PCR诊断方法、及基因组序列的测定[吴淑琴等，水产学报，1997，21(增刊)56-60；2000，24(2)165-169；2001，25(5)460-463；何建国等，中山大学学报，1998，(5)25-31；He等，Virology，2001，291(1)126-39；方勤等，中国病毒学，2000，15(3)297-301]。
除了虹彩病毒外，对患暴发性流行病的鳜鱼组织制备的超薄切片进行电镜观察，显示存在不同的鳜鱼病毒，包括弹状病毒SCRV、杆状病毒SCBV病毒和球形病毒SCSV[张奇亚等，科学通报，1999，44(2)192-195]。这一结果还提示，单一疫苗对鳜鱼因一种病毒导致的病害预防虽有效，但抗多种病毒病原的引起的病害作用还是有限的。因此，只有分别克隆出相应的病毒病原，并研制和使用多联疫苗，才可能阻止鳜鱼病毒病的传播和流行。
发明内容
本发明的目的在于提供鳜鱼弹状病毒毒株，该鳜鱼弹状病毒株在GCF0208细胞中大量增殖，其效价可达到107TCID50/ml。
本发明另一个目的是提供了一种鳜鱼弹状病毒毒株的制备方法，方法简单易行，该方法有效地将弹状病毒与之伴随感染的其它病毒分离开，以扩增均一的SCRV0208，通过纯化，获得高纯度的病毒抗原。
本发明还涉及一种鳜鱼弹状病毒毒株在细胞工程疫苗和基因工程疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案病毒克隆技术就是从病毒在细胞或宿主培养物中，获得由一个病毒后代增殖的病毒群体。所获得的这种生物学性状一致的病毒培养物称为克隆病毒株，从而可以达到纯化筛选病毒株的目的。将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在细胞上覆盖一层固体介质，如琼脂糖，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性、肉眼或光镜下可见的变性细胞区，这通常被称为“蚀斑”。理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。同时，蚀斑技术也是测定病毒悬液中感染病毒含量的一种准确的方法。本发明就是通过挑取蚀斑再培养，而获得克隆的鳜鱼弹状病毒株。通过电子显微镜在患流行病的鳜鱼组织中观察到3种不同形态的病毒。结合电镜进行超微观察和挑斑克隆，对不同鳜鱼病毒进行分离，直到最近才获得克隆鳜鱼弹状病毒毒株(Siniperca chuatsirhabdovirus，SCRV0208)，CCTCC NOV202008。这为水生动物弹状病毒细胞工程疫苗和基因工程疫苗的研制奠定了坚实基础。其特征是GCF0208细胞经TC199培养基加10％新生牛血清，培养12-14小时，长成单层细胞，用0.1ml SCRV0208病毒液(效价为107TCID50/ml)接种后，铺上一层琼脂糖，继续在25℃恒温培养箱中培养。同时在接种病毒后培养12-36小时，并在不同培养时段取样，制备超薄切片，并进行电镜观察，确定在SCRV0208接种到GCF0208单层细胞中培养20小时后进行挑斑。经过反复进行7次这样的挑斑过程，获得克隆的鳜鱼弹状病毒株SCRV0208，继续扩大培养，再经差速离心、蔗糖梯度离心，并经负染和电子显微镜观察，证实获得了大量纯化的SCRV0208。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1.将细胞培养与电镜技术相结合，获得鳜鱼弹状病毒在宿主细胞中增殖的直观结果。
2.当确定弹状病毒在宿主细胞中大量扩增的最佳时段后，能准确挑斑纯化。
3.获克隆鳜鱼弹状病毒株。
4.获得纯化的弹状病毒。
图1、在挑斑纯培养之前，感染鳜鱼病毒的细胞电镜照片，显示有SCRV0208、也有与之伴随的球形病毒。x30000图2、经过7次挑斑分离后，在GCF0208中纯培养的SCRV0208电镜照片。显示在宿主细胞中仅存大量SCRV0208，而未见球形病毒。x30000图3、纯化SCRV0208的负染电镜照片，显示有大量类似子弹头样的病毒颗粒。x60000具体实施方式
在鳜鱼流行病发生的疫区收集有典型病症的鳜鱼，病鳜鱼的症状主要表现为吻端、头部皮肤、背鳍和尾鳍基部充血或有出血点，有的鱼眼球突出，腮因缺血而发白。据观察，一旦出现这些病症，鱼池中的鳜鱼在3-7天内会大量死亡。取出病鱼的内脏组织(包括肝、脾、肾等)，剪碎、加入1-2倍体积的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，再加入双抗后，置冰箱-20℃冰冻过夜，次日取出待其融化后，以1000-2000转/分的速度离心10分钟，获SCRV0208病毒粗提液。将制备好的SCRV0208病毒粗提液经过滤，并在草鱼鳍细胞GCF0208中增殖。在SCRV0208病毒粗提液感染细胞的超薄切片，经电镜观察，可见细胞内即有球形病毒，也有弹状病毒(图1)。
将SCRV0208病毒粗提液接种的GCF0208细胞液收集，两次在-20℃下冻融，制备成SCRV0208细胞液，将SCRV0208细胞液分别接种到8瓶已长成单层的草鱼鳍细胞GCF0208中，置25℃条件下培养。从接种后12小时开始，每间隔2-4小时取一次样，用戊二醛固定，制备超薄切片，JEM-1230型透射电镜下观察。观察结果显示，在SCRV0208接种后12-18小时之间的细胞超薄切片中，球形病毒比弹状病毒量要大；但在SCRV0208接种GCF0208细胞后20小时或更长时间的细胞超薄切片中，细胞内弹状病毒的量大大增加，而球形病毒几乎很难找到。因此确定，在将病毒接种到长成单层的GCF0208细胞后，覆盖琼脂，继续培养20小时后挑斑。经过7次这样的挑斑，终于获得克隆鳜鱼弹状病毒株SCRV0208。在SCRV0208感染的GCF0208细胞超薄切片中，病毒形态特征是大小为70-110×30-45nm、形态是一端尖头、另一端平头的弹状病毒(图2)。
将获得的SCRV0208病毒株在GCF0208细胞中扩增培养，收集病毒后经差速离心、再经20-60％的蔗糖梯度离心和超速离心洗糖纯化。取提纯的病毒样品经2％的磷钨酸负染和电镜观察，结果可见有大量类似子弹头样的病毒颗粒(图3)。
权利要求
1.一种鳜鱼弹状病毒株，其特征是在于鳜鱼弹状病毒毒株Siniperca chuatsirhabdovirus，SCRV0208，CCTCC NOV202008。
2.根据权利要求1所述的一种鳜鱼弹状病毒毒株，其特征是病毒微形态特征是大小为70-110×30-45nm、形态是一端尖头、另一端平头的弹状病毒。
3.一种实现权利要求1所述的一种鳜鱼弹状病毒毒株的制备方法，包括下列步骤首先是GCF0208细胞经TC199培养基加10％新生牛血清，培养12-14小时，长成单层细胞，用0.1ml SCRV0208病毒液接种后，铺上一层琼脂糖，继续在25℃恒温培养箱中培养；其次是在接种病毒后培养12-36小时，在不同培养时段取样，超薄切片观察，确定在SCRV0208接种到GCF0208单层细胞中培养20小时后进行挑斑；第三是反复进行7次挑斑，获得克隆的鳜鱼弹状病毒株SCRV0208后，扩大培养，再经差速离心、蔗糖梯度离心，就可获得纯化的SCRV0208。
4.权利要求1所述的鳜鱼弹状病毒毒株在细胞工程疫苗和基因工程疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鳜鱼弹状病毒毒株及制备方法和应用，鳜鱼弹状病毒毒株Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV
文档编号C12N7/01GK1410535SQ0213928
公开日2003年4月16日 申请日期2002年11月14日 优先权日2002年11月14日
发明者张奇亚, 陶建军, 李正秋, 桂建芳 申请人:中国科学院水生生物研究所