专利名称：水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片断的分离克隆和应用。所述的DNA片断能够赋予植物抵抗由白叶枯病菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生Xa26(t)介导的对多种病原菌的防卫反应。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生防卫反应，杀死病原物或阻止其生长。
虽然植物缺乏像动物一样的循环系统和抗体，也缺乏特化的防卫细胞，但它有一套区别于脊椎动物免疫系统的抗病防卫体系。在这一体系中，植物的每一个细胞都有对病原物的侵染产生组成型抗性(constitutive resistance)和诱导型抗性(induced resistance)的能力。组成型抗性又称为被动抗病性，主要靠形态和组织结构产生的机械障碍(主要指能够抗穿刺和阻止病原物的移动物质，如角质层、木栓质、蜡质、木质素、硅和二价阳离子等)以及抗病原物的化学因子(如酚类化合物、生物碱等，但不包括病原物侵染后发生防卫反应产生的活性因子)来降低病原物对宿主的损害(王金生，1999，分子植物病理学，中国农业出版社)。组成型抗性相对较弱。诱导抗性又称为主动抗性，是在植物和病原微生物长期相互作用中产生的，指寄主植物被病原物侵染后，产生或激活的抗病特性。植物对病原物的这种主动抗病形式由植物的抗病基因介导，其可见的标志是过敏反应，抗性很强。许多植物抗病基因已经被遗传定位。
植物和病原菌的互作分为亲和性互作和非亲和性互作两种。前者是指病原物侵染寄主植物并引起发病；后者是指病原物遇上抗病寄主和非寄主植物时病害一般不会发生。植物的主动抗病反应主要是针对非亲和性病原菌产生。这种反应一般具有病原小种特异性。Flor(1956，Adv.Genet.829-54)根据对亚麻(Linumusitatissmum)锈病(Melampsora lini)的研究提出基因对基因学说解释植物主动抗病反应。该学说认为，当植物携带的抗病基因的产物能够识别病原菌无毒基因(avirulent gene)产物时，植物表现出抗病。针对寄主的每一个抗病基因，在病原菌方面或迟或早都会发现一个毒性基因(virulent gene)。毒性基因只能克服其对应的抗病基因，而产生致病效应。这一遗传假说为深刻理解植物宿主-病原物的相互作用提供了理论基础，并进一步引导了研究者们对病原物无毒基因和植物抗病基因的克隆。研究者们对抗病基因的深入研究进一步证明了基因对基因学说的合理性，并从分子水平上对这一学说作出了解释植物对病原物的防卫反应起始于对病原物特殊信号分子-激发子(elicitor)的识别(激发子是病原物无毒基因直接或间接产物)；抗病基因编码这些信号分子的受体，受体和激发子的结合启动宿主对病原物产生抗性，抑制病原物的生长(Staskawicz等，1995，Science 268661-667)。
植物中已有多个抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多数基因都编码信号分子识别蛋白。这类抗病基因介导的抗病反应可以用基因对基因学说解释(Baker等，1997，Science 276726-733)。根据基因产物的结构，一般可将采用基因对基因学说原理介导抗病反应的抗病基因分为5类(Jones，2000，InDickinson M and Beynon J.Molecular Plant Pathology，Annual Plant Reviews，Vol 4.108-143；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833)(表1)。
表1 部分已克隆的采用基因对基因学说原理介导抗病反应的植物抗病基因类基因 宿主 病原菌 蛋白质结构 参考文献a群1Rps2拟南芥Pseudomonas CC-NBS-LRR Bent等，1994syringaeRps4拟南芥P.SyringaeCC-NBS-LRR Gassmann等，1999RPS5拟南芥P.syringaeCC-NBS-LRR Warren等，1998Rpp8拟南芥P.Parasitica CC-NBS-LRR McDowell等，1998Rpp13 拟南芥P.parasitica CC-NBS-LRR Bittner-Eddy，2000Rpm1拟南芥P.maculicola CC-NBS-LRR Grant等，1996HRT 拟南芥TCV CC-NBS-LRR Cooley等，2000Prf 番茄 P.syringaeCC-NBS-LRR Salmeron等，1996Mi 番茄 Meloidogyne， CC-NBS-LRR Milligan等，1998MacrosiphumI2番茄 Fusarium. CC-NBS-LRR Simons等，1998OxysporumXa1 水稻 Xanthomonas CC-NBS-LRR Yoshimura等，1998oryzae
Pita 水稻Magnaporthe CC-NBS-LRRBryan等，2000griseaPi-b 水稻M.griseaCC-NBS-LRRWang等，1998，Dm3 莴苣Bremia lactucae CC-NBS-LRRMyers等，1998Mla1 大麦Bluserta graminis CC-NBS-LRRZhou等，2001Mla6 大麦B.graminis CC-NBS-LRRHalterman等，2001Rp1-D玉米Puccinia.Sorghi CC-NBS-LRRCollins等，1999Rpp5 拟南芥 P.parasiticaTIR-NBS-LRR Parker等，1997Rpp1 拟南芥 P.parasiticaTIR-NBS-LRR Botella等，1998N烟草TMV TIR-NBS-LRR Whitham等，1994L6亚麻Melampsora lini TIR-NBS-LRR Lawrence等，1995M亚麻M.lini TIR-NBS-LRR Eliss等，1995N亚麻M.lini TIR-NBS-LRR Dodd等，20012 Cf9 番茄CladosporiumLRR-TMJones等，1994FulvumCf2 番茄C.fulvumLRR-TMDixon等，1996Cf4 番茄C.fulvumLRR-TMThomas等，1997Cf5 番茄C.fulvumLRR-TMDixon等，1998HS1pro-1甜菜Heterodera LRR-TMCai等，1997Schachtii3 Pto 番茄P.syringae 蛋白激酶 Martin等，1993PBS1 拟南芥 P.syringae 蛋白激酶 Swiderski和Innes，20014 Xa21 水稻X.oryzaeLRR-TM-蛋白 Song等，1995激酶5 RPW8 拟南芥 E.Cichoracearum CC-NBSXiao等，2001a参考文献目录Bent A F et al.Science，1994，2651856-1860Bitter Eddy P D et al.Plant J，2000，21177-188Botella M A et al.Plant Cell，1998，101847-1860Bryan G T et al.Plant Cell，2000，122033-2045Cai D et al.Science，1997，275832-834Collins N et al.Plant Cell，1999，111365-1376Cooly M B et al.Plant Cell，2000，663-676Dixon M S et al.Cell，1996，84451-459
Dixon M S et al.Plant Cell，1998，101915-1925.
Dodds P N et al.Plant J.2001，27439-452Ellis J G et al. Proc Nat Acad Sci USA，1995，924185-4188Gassmann Wet al.Plant J.1999，20265-277Grant M Ret al.Science，1995，269843-846Halterman D et al.Plant J.2001，25335-348Jones D A et al.Science，1994，266789-793Lawrence G J et al.Plant Cell，1995，71195-1206Martin G B et al.Science，1993，2621432-1436Meyers B C et al.Plant Cell，1998a，101817-1832Milligan S B et al.Plant Cell，1998，101307-1319Parker J E et al.Plant Cell，1997，9879-894Salmeron J M et al.Cell，1996，86123-133Simons Get al.Plant Cell，1998，101055-1068Song W Y et al.Science，1995，2701772-1804Swiderski M R and Innes R W.Plant J.2001，26101-112Thomas C M et al.Plant Cell，1997，92209-2224Wang Z X et al.Plant J.1999，1955-64Warren R F et al.Plant Cell，1998，101439-1452Whitham S et al.Cell，1994，781101-1115Xiao S et al.Science，2001，291118-120Yoshimura S et al.Proc Natl Acad Sci，1998，951663-1668Zhou F et al.Plant Cell，2001，13337-350第一类抗病基因编码具有NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine richrepeat)结构域的蛋白质，它是已被克隆的抗病基因中最大的一群(表1)。这类抗病基因可被进一步分为两个亚群(Richter和Ronald，2000，Plant Mol.Bio.42195-204)。一个亚群其抗病基因编码的蛋白氨基端是CC(Coiled-coil)结构域，拟南芥中的RPS2和RPM1以及番茄中的Mi基因属于这一亚群。另一亚群含有TIR结构域(homology to the cytoplasmic domains of the Toll receptor ofDrosophila melanogaster and the IL-1 receptor of birds and mammals)，如烟草中的N基因、拟南芥中的Rpp5和亚麻中的L基因。该类基因编码的蛋白一般存在于细胞质内，抗病基因编码蛋白和激发子的相互作用也发生在细胞内；其NBS结构域比较保守，LRR结构域不很规则，相互之间同源性较差(Baker等，1997，Science 276726-733；Kobe和Deisenhofer，1994，Trend Biochem.Sci.19415-421)。
第二类抗病基因编码胞外LRR结构域(表1)。这类抗病基因编码的LRR结构域比第一类抗病基因编码的LRR规则。LRR存在于细胞外，通过跨膜结构域(TM)将其锚定于细胞膜上。在这类抗病基因介导的抗病反应中很可能激发子和胞外的LRR结合，由TM将信号传递入胞内。该类蛋白质的胞内结构域很小，较保守，可能涉及到和细胞内的信号传递体的相互作用(Jones等，1994，Science 266789-793；Dixon等，1998，Plant Cell 101915-1925；Thomas等，1997，Plant Cell 92209-2224)。
第三类抗病基因编码蛋白激酶(表1)。如番茄的Pto基因(Martin等，1993，Science 2621432-2436；美国专利第5,648,599)编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶。这个蛋白质是一种典型的信号传递蛋白质。从结构分析该蛋白似乎缺乏受体的功能。但目前已证明该蛋白能直接和由病原菌avrPto编码的蛋白结合，亦能和植物体内其它的蛋白-很可能是与信号传递相关的蛋白相互作用。Pto蛋白发挥作用时需要Prf基因编码的LZ(leucine zipper)-NBS-LRR类蛋白质的协助(Scofield等，1996，Science 2742063-2065；Tang等，1996，Science2742060-2063)。另一个抗病基因-PBS1也属于这一类群。PBS1也编码一种蛋白激酶，但和Pto不属于一类。它发挥作用同样需要一类NBS-LRR蛋白质-RPS5的协助。
第四类抗病基因编码受体激酶(表1)。从水稻中分离克隆的抗白叶枯病基因Xa21属于此类。Xa21蛋白由LRR、TM和蛋白激酶三部分结构域组成。一般认为LRR位于胞外，激酶部分在胞内(Song等，1995，Science 2701772-1804)。到目前为止，Xa21蛋白是唯一发现具有抗病活性的受体激酶。从结构上分析，这个蛋白具有典型的信号识别和传递功能。
第五类抗病基因编码产物仅包含截短的CC-NBS结构(表1)。拟南芥的RPW8基因属于此类(Xiao等，2001，Science 291118-120)。目前，研究者们还不知道该基因编码的蛋白质如何完成对病原菌的识别。
水稻白叶枯病是一种非常严重的病害，由稻黄单孢杆菌中的致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)侵染引起。这种病害在亚洲、欧洲、非洲、南美、美国和澳大利亚都有发生；而以日本、印度和中国发生比较严重。我国主要发生在华东、华中、华南稻区，在西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布。白叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻(过崇俭，1995，中国农作物病虫害，中国农业出版社，14-24)。受侵染的水稻一般减产20-30％，严重时能够达到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition.)。白叶枯病造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，则造成稻株的大量枯死，损失会更大。
控制白叶枯病害流行的最好的方法改良水稻品种的抗性。转基因技术为品种改良提供了高效技术途径。但利用这一途径的前体是必须具有优良基因克隆。目前已被鉴定的抗白叶枯病基因有20多个，但国际国内已报道被分离克隆的抗白叶枯病基因只有两个Xa21(Song等，1995，Science 2701804-1806，美国专利号5,859,339)和Xa1(Yoshimura等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA951663-1668)。Xa21基因抗谱广，但它只具有成株期抗性。Xa1基因虽然具有全生育期抗性，但它的抗谱窄。另外，Xa21基因的知识产权不属于我国，使利用这个基因克隆改良水稻品种的抗性受到限制。籼稻品种明恢63是我国水稻生产中种植面积最大、使用时间最长的杂交水稻的恢复系。由明恢63配制的杂交水稻的主要优势是产量高和适应性强。这些杂交水稻适应性强的一个重要方面是它们具有较好的抗白叶枯病性能。明恢63携带至少两个抗白叶枯病基因(Chen等，2002，Phytopathology 92750-754)。明恢63携带的抗病基因在我国的水稻品种改良中具有很好的应用前景。
克隆抗病基因是对水稻抗病机理研究的前提，揭示水稻抗白叶枯病的机理可以更好的控制和减低Xoo对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是分离克隆水稻品种明恢63中携带的一个抗白叶枯病基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段，利用这个基因改良其它水稻品种或其它植物抵御病害的能力。
本发明涉及分离和应用一种包含Xa26(t)基因的DNA片段，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。这一发明适用于所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种受体蛋白激酶，它包含细胞外的LRR结构域和细胞内的蛋白质激酶结构域，其氨基酸序列如(
图11)所示。本发明所示的DNA片段的表达具有组织特异性。
所分离克隆的Xa26(t)抗病基因编码受体蛋白激酶。这种蛋白质包含两个主要结构域由26个LRR组成的胞外结构域和胞内的蛋白激酶结构域。已被克隆的水稻抗白叶枯病基因Xa21也编码受体蛋白激酶。但Xa21蛋白的胞外结构域由23个LRR组成。另外，Xa26(t)基因和Xa21基因编码的蛋白激酶结构域也存在序列上的差异。Xa26(t)基因中编码LRR或蛋白激酶结构域的核酸片段可能具有独立的功能。将Xa26(t)基因中编码胞内或胞外结构域的片段与其它核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。对Xa26(t)基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。例如，将该基因的胞外结构域替换为Xa21基因的胞外结构域，可能会改变基因的抗谱；对该基因的胞外结构域进行定点突变，可能会改变基因的抗性和抗谱等。
本发明同样包括将Xa26(t)抗病基因的主要结构部分有效连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。如这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何环境条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达，同样，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件、和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。
本发明中，Xa26(t)基因的内源启动子也可以控制该基因的表达。该启动子同样也可以控制嵌合基因或其它基因的表达。因此将该基因的启动子和任何其它基因连接、特别是与抗病基因连接，同样会改变植物的抗性，包括抗真菌和细菌的抗性的等。本发明的Xa26(t)基因的启动子是一种组织特异性的启动子。我们检测到它在叶、根中表达，没有检测到它在花期茎和穗中的表达。
在cDNA和基因组文库中，可以采用已经克隆的Xa26(t)基因为探针，筛选到本发明的基因或同源基因。同样，可以在基因组中、mRNA和cDNA中，采用PCR技术，扩增到本发明中的核苷酸序列中任何感兴趣的一段或与其同源的一段。例如，所扩增的序列用于蛋白质的表达、用作探针筛选文库、测序或其它目的等。采用以上技术，可以分离到包含Xa26(t)基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
本发明为增强植物对细菌性病害的抗性提供了一种新的方法。这些方法包括将该片段转入感病植物或者将Xa26(t)结构基因和可调控的启动子连接或将Xa26(t)的重组基因转入植物，拓宽和增强植物对病原菌的抗性。另一方面，本发明涉及到重组表达载体，所述载体赋予植物在侵染点对细菌性病原体所致病害的防卫反应。所述重组表达构件包含分离的DNA片段，其赋予植物对细菌性病原体的抗性，其中，所述DNA片段基本上相当于SEQ ID NO1中所述的核酸序列或其功能等同的亚片段。
将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植株中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。抗病基因的克隆是克服传统育种不能在植物种间转移抗病基因的问题前提。
本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它的植株。
在本发明的实施例部分，我们阐述了Xa26(t)基因的分离过程和该基因的特点，分离的Xa26(t)基因能够和适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性(图1)。
序列表、附图及其说明序列表SEQ ID No1.包括Xa26(t)基因和Xa26(t)基因启动子的DNA序列。
图1.是本发明的水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)的分离克隆和应用流程图。
图2.是本发明的水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)在第11染色体分子标记遗传连锁图上的位置。
图3.用DNA杂交技术分析Xa26(t)基因区段的BAC克隆之间的重叠关系。将提取的BAC质粒(33P4、65H1、3H8、5B14、31B6、65A17、39F18、26G20、57B2和38G13)用Hind III完全酶切，电泳后转移至尼龙膜。然后用经Hind III酶切消化、放射性同位素P32标记的BAC克隆3H8、39F18和57B2分别与尼龙膜杂交，根据杂交带型的重叠情况确定BAC克隆之间的重叠关系。
图4.覆盖Xa26(t)基因区段的物理图谱。短横线代表不同BAC克隆。竖虚线表示某一BAC克隆包含的分子标记经过DNA杂交验证。分子标记之间的阿拉伯数字表示在F2感病群体中某一分子标记与Xa26(t)基因之间存在重组的单株数目。Xa26(t)基因被定位在BAC克隆3H8上。
图5.对BAC克隆3H8进行测序分析后，获得两条长DNA序列。一条长36.4kb，另一条长30.4kb。长36.4kb的序列中包含3个编码LRR-蛋白激酶类蛋白质的基因，分别被命名为RKa、RKb和RKc。垂直虚线示来源于3H8的分子标记3H8-RKa、3/7A-8、2/15B-29、3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在3H8或3个基因(RKa、RKb和RKc)上的相对位置。用这些分子标记分析重组自交系群体中在Xa26(t)基因区段发生重组的5个家系(表型为抗病，但与Xa26(t)共分离的分子标记R1506和Xa26(t)基因两侧的分子标记RM224和RM144位点处是感病亲本的基因型)，发现3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在这5个家系中检测出不规则(A)的杂交带型(既非抗病亲本的带型，也非感病亲本的带型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在这5个家系中检测到抗病亲本的杂交带型(R)。根据这些结果和图3中的结果，可以确定RKb就是Xa26(t)基因。图6.示3个转基因T1家系(RKb17、RKb18和RKb22)的不同单株对白叶枯病菌生理小种PXO61的抗性(叶片病斑长度)发生分离。IR24和牡丹江8号(MDJ8)是对照感病品种，明恢63(MH63)是对照抗病品种。MDJ 8/MH63是两个亲本的杂交(F1)后代。
图7.采用RKb基因的特异性引物，通过PCR扩增检测3个T1转基因家系(RKb17、RKb18和RKb22)中的各个单株。带有RKb基因的阳性转基因单株和抗病水稻品种明恢63(MH63)呈现出很强的带，而阴性单株和感病品种牡丹江8号(MDJ 8)因只带有与RKb同源的序列，故呈现出弱带或无带。
图8.用RT-PCR方法分析明恢63接种白叶枯病菌和对照(假接种)处理中Xa26(t)基因的表达水平。用RKb2R和RKb/3’race-2引物扩增明恢63的总DNA和明恢63 RNA的反转录产物(cDNA)获得大小不同的片段。
图9.Xa26(t)基因内含子的剪切位点。
图10.Xa26(t)基因的结构。
图11.Xa26(t)基因编码的受体激酶类膜蛋白质的结构，其中包括两个主要的结构域LRR和激酶(kinase)。在Kinase结构域序列中用下划线标注的氨基酸残基是蛋白激酶的保守结构域。
图12.Xa26(t)基因在不同组织内的表达分析。1、分蘖期的根；2、苗期的叶鞘；3、苗期叶；4、分蘖期的叶；5、抽穗期的茎；6、灌浆期穗。
具体实施例方式
以下实施例中进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例一水稻品种明恢63中的抗白叶枯病基因的遗传定位本发明采用两个遗传作图群体定位水稻品种明恢63中的抗白叶枯病基因。其中一个群体是由感病亲本珍汕97和抗病亲本明恢63杂交配制的F2群体，该群体包含2533个F2单株。另一个群体是由珍汕97和明恢63杂交配制的重组自交系群体，包含241个家系。对F2群体进行白叶枯病菌接种鉴定，确定了477株极端感病单株，由它们组成感病群体。我们在前期工作中已经鉴定出明恢63的一个抗白叶枯病基因位于水稻第11染色体的两个分子标记RM224和RM144之间(Chen等，2002，Phytopathology 92750-754)。因此，可以用这两个分子标记筛选F2极端感病单株组成的群体，寻找和发现抗病基因和分子标记间的重组事件。分子标记和抗病基因之间发生的重组事件越多，两者的遗传距离越远。二者之间的交换率采用最大似然法来估计(Allard，1956，Hilgardia 24235-278)，其中交换率c＝(N1+N2/2)/N，N为所测定的感病单株总数，N1为感病群体中呈现纯合抗病带型的个体数，N2是呈现杂合带型的个体数。标准差为Vc＝c(1-c)/2N。
用RM224标记在感病群体内检测出两个重组单株，用RM144标记在感病群体中检测出20个重组单株。这一结果进一步确认这两个分子标记之间存在一个抗白叶枯病基因。进一步用这两个标记之间的其它分子标记分析它们和抗病基因间的重组事件，将这个抗病基因定位于分子标记RM224和Y6855RA之间。这两个分子标记距抗病基因的遗传距离分别为0.21和2.1cM(centiMorgan)(图2)。另外，这个抗病基因与分子标记R1506共分离(图2)。根据这个抗病基因的染色体位置和携带这个基因的水稻品种明恢63的抗谱，我们认为该基因可能是一个抗白叶枯病新基因，命名为Xa26(t)。
实施例二建立覆盖Xa26(t)基因区段的物理图谱Xa26(t)基因区段的物理图谱的构建采用本实验室构建的明恢63 BAC文库。该文库由26,000个克隆组成，平均插入片段150kb，覆盖水稻基因组9倍(Peng等，1998，Acta Botanica Sinica 401108-1114)。首先采用和Xa26(t)基因紧密连锁的分子标记筛选BAC文库。分子标记R1506属于单拷贝探针，用该探针从文库中筛选到3个重叠的BAC克隆，分别是33P4，65H1和3H8。分子标记S12886位于基因的另一侧，用该标记筛选到另外3个重叠BAC克隆，分别为26G20、57B2和39F18。另外，用与S12886共分离的分子标记Y6855RA鉴定出3个BAC克隆，分别是31B6、65A17和7M24。从保存的文库中将筛选到的BAC克隆取出，扩大培养，采用标准碱裂解法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)分离提取BAC质粒。将所得BAC质粒用Hind III完全酶切、电泳、转移至尼龙膜；然后用Hind III完全酶切的BAC克隆作探针与载有BAC质粒的尼龙膜杂交，根据电泳位置相同的杂交带的有无和多少确立不同BAC克隆之间的重叠关系。两个BAC克隆分享相同的杂交带越多，则重叠区段越长，图3显示了跨越基因区段的10个BAC克隆之间的重叠情况。最后，从中确立了6个冗余最少的BAC克隆，建立了覆盖Xa26(t)基因区段的重叠群(图4)。
为确定BAC克隆插入片段的大小，采用Not I对BAC克隆进行酶切，1％琼脂糖脉冲场电泳分离酶切片段，并和已知大小的DNA片段的迁移率做比较，计算出插入片段的大小。电泳条件如下电泳缓冲液为0.5×TBE，转换时间(switchtime)1-12秒，角度为120度，电压6V/cm，温度14℃，电泳时间16小时。通过脉冲电泳分析，确定了跨越Xa26(t)基因区段的重叠群长约500kb。
分子标记R1506和Xa26(t)基因间在F2代感病单株组成的群体内没有检测出重组单株，但在重组自交系中找到5个重组单株。进一步以明恢63的BAC克隆3H8的亚克隆为探针，分析F2感病群体中所发生的重组事件。BAC克隆3H8的亚克隆3/7A-10和3/7A-80在这个感病群体内检测到14个重组单株，3H8的另一个亚克隆M196-1和抗病基因共分离。综合上述各方面的信息，我们将Xa26(t)基被定位在一个BAC克隆-3H8上(图4)。
实施例三测序分析包含Xa26(t)基因的BAC克隆和Xa26(t)候选基因的分离克隆1.BAC克隆3H8的Shotgun文库的构建采用超声波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)构建Shotgun文库。用超声波处理明恢63 BAC克隆3H8的环形质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离出1.5-2.5kb的DNA片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端，与Sma I酶切的去磷酸化的pUC18载体平端连接，电转化大肠杆菌DH10B，进行蓝白斑筛选。提取阳性克隆质粒，并与空pUC18质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI双酶切，检测插入片段大小。
2.随机亚克隆片段的测序采用M13-R和M13-F引物、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big DyeKit)、以双脱氧核苷酸末端终止法分别从每个亚克隆的两端测序。测序仪为PerkinElmer公司的ABI377 Sequencer。
3.原始序列的拼接使用Sequencher 4.1软件(美国Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1软件自动去除末端测序较差的序列和pUC18载体序列；用Sequencher 4.1软件没有去除干净的序列则用手工删除。BAC载体pBeloBAC11的碎片序列和污染的细菌DNA序列则通过和BAC序列进行比较或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher 4.1软件对两条序列进行拼接的参数是重叠序列长度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重叠序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一个碱基的确定都要参照重叠在该位点的多个Shotgun片段序列。对于由一个Shotgun片段序列所覆盖的区域要再次测序验证，以确保碱基的准确性。而由一个亚克隆覆盖的断口处，则对该克隆进行长序列胶测序或用primer walking的方法，填补缺口。
4.BAC克隆的序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)分析所得序列。然后采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)软件分析预测基因结构，分析结果进一步用Blastp方法(Altschul等，1997，NucleicAcids Res.253389-3402)进行确证。两条或多条核苷酸或氨基酸序列的比较分析使用BLAST 2 sequence方法(Tatiana等，1999，FEMS Microbiol Lett.174247-250)和ClustalW方法(http//www.ebi.ac.uk)。
对BAC克隆3H8测序和序列拼接形成两个大的序列片段，一个片段长36.4kb，另一个片段长30.4kb，二者之间有一个小于1kb的间隙(图5)。序列分析发现在36.4kb的片段上有3个区段编码LRR-蛋白激酶类蛋白，并与水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的产物有不同程度的同源性，它们被分别称之为RKa、RKb和RKc(图5)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析表明，RKa、RKb和RKc是3个完整的基因。RKa和RKb的转录方向相同，而RKc的转录方向相反。
5.Xa26(t)候选基因的确定采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法分析(具体操作方法见实施例四)，检测到RKa和RKb基因的表达，没有检测到RKc基因的表达。
用与Xa26(t)共分离的分子标记R1506和Xa26(t)基因两侧的分子标记RM224和RM144检测重组自交系群体，发现5个重组家系(R85，R96，R102，R117和R240)。这5个家系在上述3个分子标记位点处是感病亲本的基因型，而表型则是抗病。用BAC克隆3H8的亚克隆3/7A-8、2/15B-29、M196-1、3/7A-80、3/7A-10以及3H8的PCR产物3H8-RKa和3H8-RKb作探针检测这5个家系，发现3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29在这5个家系中检测出不规则(A)的杂交带型(既非抗病亲本的带型，也非感病亲本的带型)，而3H8-RKb、M196-1、3/7A-80和3/7A-10在这5个家系中检测到抗病亲本的杂交带型(R)(图5)。3H8-RKa、3/7A-8和2/15B-29是RKa基因的片段；3H8-RKb和M196-1是RKb基因的片段；3/7A-80是RKc基因的片段，但RKc基因不表达，且3/7A-80与Xa26(t)之间检测到14个重组交换单株(图4)。综合上述各方面的信息，初步确定基因RKb就是Xa26(t)基因(图5)。
6.分离克隆Xa26(t)候选基因和遗传转化鉴定候选基因的功能用Dra I限制性内切从BAC克隆3H8上获得6.6kb包含RKa基因的编码区、启动子以及加尾序列的片段和7.5kb包含RKb基因的编码区、启动子以及加尾序列的片段。将这两个片段分别连接到Sma I酶切的pCAMBIA1301遗传转化载体上。通过农杆菌介导得遗传转化，将携带RKa和RKb的片段分别导入感病水稻品种牡丹江8号，获得转化了包含RKa的DNA片段的转基因植株120株，转化了包含RKb片段的转基因植株40株。对转基因植株接种白叶枯病菌生理小种PXO61，所有转化了包含Rka基因片段的转基因植株都感病，在转化了包含RKb基因片段的转基因植株的T0代和T1代植株中都发现抗病单株(表2和图6)。采用遗传转化载体所携带的报告基因Gus的引物和RKb基因的特异性引物扩增检测(图7)部分转基因T1代单株，发现转基因植株的抗性和RKb基因共分离(表2、图6和图7)。这说明转基因单株的抗性是由RKb提供的，从而确定RKb基因就是Xa26(t)基因。
表2.转基因植株和对照水稻品种对水稻白叶枯病菌生理小种PXO61的抗性以及转基因T1代单株的抗性与RKb基因、Gus基因共分离分析水稻材料 单株 病斑长度(cm) RKb基因 Gus基因转基因受体水稻品种(感病)牡丹江8号(MDJ8) 16.2 无转基因T1代家系Rb1110.5 有218.3 无
3 14.0 无4 0.4 有5 1.4 有6 16.3 无7 16.7 无8 4.8 有9 0.6 有1021.0 无1116.2 无1210.9 无131.0 有1413.2 无150.6 有Rb161 17.6 无无2 1.6 有有Rb171 16.9 无2 0.2 有3 16.2 无4 12.5 无5 0.6 有Rb181 0.7 有有2 18.2 无无3 0.2 有有4 0.6 有有Rb221 16.7 无无2 0.6 有有3 0.2 有有4 1.3 有有5 1.0 有有6 0.7 有有7 18.1 无无8 2.0 有有9 1.2 有有101.4 有有实施例四Xa26(t)基因结构分析1.总RNA的抽提总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。
2.RT-PCR分析将接种白叶枯病菌生理小种PXO61的明恢63叶片和未接种白叶枯病菌的明恢63叶片用于RT-PCR分析。RT-PCR以两步法进行(Zhou等，2002，Science inChina 45449-467)。首先，将用于反转录的总RNA用无RNA酶活性的DNA酶I处理，去除总RNA中可能污染的DNA；将总RNA在65℃处理10分钟，灭活DNA酶I；将RNA在72℃变性5分钟，然后加入Oligo-dT15、dNTP、反转录酶等，在42℃反转录90分钟。第二步，取1微升反转录产物作PCR扩增。PCR扩增引物为对于RKa基因RKaL和RKaR，RKa2L和RKa22R(表3)对于RKb基因RKbL和RKbR，RKb2R和RKb/3’race-2(表3)对于RKc基因RKcL和RKcR(表3)表3.用于PCR、RT-PCR和RACE分析的引物引物名称 引物序列(5’-3’)RKaLCTGGCTCTGTCCCATCAAATRKaRGCTGAAAGCAAAAGCTCCAARKa2L CTGCATGGTCAGATACCAAAAGRKa22R TACGGGATCATGCTACTCGARKbLGGCTTGCAAACTTTGGACATRKbRGCTTCCCTTGTTCTGAGTGCRKb2R CAGTCCACCACATGGACAAGRKb/3’race-2 TGGTCAAATACCGGAAGGAGRKbL/3’race-1 CCATCCCAAACTACTTGGCTAadaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCOligo-dT17-adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)17RKcLTGTTTCGAGTGGCATACAGCRKcRATGAGCCGAGCAATGATACCRaceATCAACCGGCARKb/5’-race-A1 GCGTGTCCATACCTCCAAGT
RKb/5’-race-A2 CCAATCTTGATGCCATCTCCRKb/5’-race-S1 CGTAGAACTGGGAGGCTGAARKb/5’-race-S2 CCGCCCCAGTTAAGTTATTG3.基因末端序列分析采用大连TaKaRa公司的5’Full RACE Core Set试剂盒和3’RACE Core Set试剂盒，通过5’-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，确定Xa26(t)基因的5’和3’末端序列。
进行3’-RACE的反转录和做RT-PCR的反转录条件一样，只是用Oligo-dT17-adaptor代替Oligo-dT15。反转录完成后，进行两轮扩增。第一轮扩增引物是RKbL/3’race-1和adaptor；第二轮扩增引物是RKb/3’race-2和adaptor。然后通过电泳回收目标大小的片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega Corporation)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。
采用SuperscriptTMII反转录酶(美国Life Technologies公司)进行5’-RACE的反转录反应；用于反转录的特异性引物Race(表3)的磷酸化采用T4polynucleotide kinase(美国MBI Fermentas公司)，反应按试剂说明书进行。磷酸化后的引物用10mol/LNH4AC-乙醇沉淀，纯化。以后的操作按TaKaRa公司提供的试剂盒说明书进行。进行5’-RACE第一轮扩增的引物是RKb/5’-race-A1和Kb/5’-race-S1；第二轮扩增引物是RKb/5’-race-A2和RKb/5’-race-S2。
4.基因内含子的确定采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)软件对包含Xa26(t)基因区段的基因组DNA的分析发现在编码激酶结构域的区段存在一个内含子，采用跨越该区段的引物RKb2R和RKb/3’race-2扩增基因组DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物比从基因组中扩增出的产物小(图8)，这说明该区段确实存在一个内含子。将RT-PCR产物克隆、测序、与基因组DNA比较，确定内含子长105bp以及该内含子的剪切位点(图9)。采用Xa26(t)基因区段的其它引物进行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，没有再发现其它内含子的存在。
5.基因结构分析Xa26(t)基因的5’端位于基因起始密码子上游48bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的1494bp)处，3’端位于终止密码子下游166bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5124bp)处。该基因由两个外显子和一个内含子组成(图10)。内含子靠近基因的3’端，长105bp，位于编码蛋白激酶的结构域内(序列表SEQID NO1所示序列的4477-4581bp)。Xa26(t)基因的全长编码序列是3312bp，被插入的内含子分为两段，分别长2935bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的1542-4476bp)和377bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的4582-4958bp)。对水稻抗白叶枯病近等基因系IRBB3中与明恢63的Xa26(t)基因区段同源的片段进行测序分析，发现IRBB3中携带有与Xa26(t)序列完全相同的基因。
实施例五Xa26(t)基因的产物和特征根据Xa26(t)基因的结构特征和对该基因表达序列的分析，以及结合BLAST分析，可以确定这个基因编码一种受体激酶类膜蛋白质(图11)。这个膜蛋白质的胞外的结构域由26个LRR组成，其保守结构特征为L/I/VXXL/MXXLXXL/I/VXL/VXXNXL/FXGXI/L/VPXX(其中X代表任意氨基酸残基)。该保守结构特征与已知的LRR-蛋白激酶类蛋白质的LRR结构基本相同(Torii和Clark，2000，InKeris M，Walker J C and Callow J A.Plant ProteinKinases，Advances in Botanical Research.Academics Press)。与上述LRR的保守结构特征相比，在Xa26(t)基因编码的26个LRR中，第1个LRR不完整，第6、11和17个LRR中间多一个氨基酸残基，第8和第15个LRR分别在末端多出一个和两个氨基酸残基。
Xa26(t)基因编码的膜蛋白质的细胞内结构域是一个类似于蛋白激酶结构，它具有蛋白激酶的保守的结构域(图11)。
实施例六Xa26(t)基因在叶片组织中呈组成型表达模式，但具有不同组织表达特异性Xa26(t)基因在没有接种的叶片中和接种的叶片都表达，接种之后没有发现明显地表达增强，这说明该基因不受病原菌侵染的诱导(图8)。但Xa26(t)基因在不同组织中表达有差异(图12)。该基因在苗期的叶片中表达最强，在分蘖期的叶片中表达略差，在成株期的的叶片中能检测到Xa26(t)基因的表达(图8)。另外，在分蘖期的根和和苗期的叶鞘中也都检测到Xa26(t)基因的表达。但在花期茎和灌浆期穗中未检测到Xa26(t)基因的表达(图12)。
术语定义本说明书、权利要求书和其它有关该专利申请文字材料中使用的术语的定义如下术语“植物”包括整个植株、植物的组织(如叶、茎、根等)、植物种子、细胞和其后代。本文中的植物主要是指可以用于转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。
“抗病基因”是指编码能够在植物细胞或植物组织中激发防卫反应的多肽的基因。抗病的植物表现出较短或很短的菌斑，感病的植物菌斑很长。
“防卫反应”是由寄主(如植物)产生的特异性、抵抗侵染因子或病原体存在的防卫反应。
“功能等同的亚片段”是指分离的DNA片段的一部分或亚序列，其中无论这些片段或亚序列是否编码活性蛋白质，都保留改变基因表达或产生一定表型的能力。如所述片段可用于嵌合基因的设计或反义抑制等。
“基因”是指表达特定蛋白的DNA片段，包括所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指同自然界中发现的一样具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，包括在自然界中未发现在一起的调节序列和编码序列组成的基因。因此，嵌合基因可以包括得自不同来源的调节序列和编码序列，或得自同一来源、但排列方式不同于天然形式的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中于天然位置的天然基因。“外源基因”是指不是在所述寄主生物体中发现的、而是通过基因转移被引入所述寄主生物体中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序被引入基因组中的基因。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之中或下游(3’非编码序列)影响所连接的编码序列转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。这种序列可以是天然的或是非天然的。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
“病原体”是指其侵染到活植物组织的细胞周围或细胞中激发病害反应的生物或侵染性因子。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。启动子序列包括邻近的上游元件和更远的上游元件，后者通常被称作“增强子”。因为增强子是刺激启动子活性的DNA序列，可以是所述启动子的固有元件，或是插入的以提高启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部衍生白天然基因，或可以由衍生自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的DNA区段。本领域技术人员会理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或不同细胞类型中表达，或指导基因在不同发育阶段表达，或对不同环境条件应答而指导基因表达。引起基因在大多数时间、大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。另外，由于在大多数情况下尚未完全确定调节序列的实际边界，因此某些变异的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
“内含子”是基因中不编码蛋白质序列的间插序列。虽然这种序列被转录成RNA，但随后被剪切去掉。该术语也用于被切下的RNA序列。“外显子”是基因中被转录且存在于成熟的信使RNA中的序列，但不必是编码最终基因产物的序列的一部分。
“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。通常，聚腺苷酸化信号的特征在于影响聚腺苷酸序列段添加至mRNA前体3’端。Ingelbrech等，1989，Plant Cell 1671-680例举了不同3’非编码序列的应用。
本文中的“表达”是指功能性终产物的产生。基因的表达或过量表达涉及该基因的转录和所述mRNA翻译成前体蛋白或成熟蛋白。
“转化”是指将核酸片段转移到寄主生物体的基因组中，并形成稳定的遗传。带有所述转化核酸片段的寄主生物体被称为“转基因”生物。水稻、玉米和其它单子叶植物的优选细胞转化方法是应用加速粒子或“基因枪”转化技术(Klein等，1987，Nature 32770-73；美国专利第4,945,050号)，或采用合适的含所述转基因的Ti质粒的农杆菌介导的方法(Ishida等，1996，Nature Biotech.14745-750)。
“表达构件”是指所分离的DNA片段单独使用，或与载体和其它的亚片段结合使用所形成的新的DNA片段。如果使用载体，载体的选择决定于将来转化寄主植物的方法。“表达构件”和“重组表达构件”在本文中通用。
“PCR”或“聚合酶链式反应”是用于合成大量特定DNA区段的技术，由一系列重复的循环组成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常由连续的三个步骤构成一个循环将双链DNA于高温(如95℃)下变性，将两种与靶区段的3’边界互补的引物于低温(如55℃)下退火然后在中温(如72℃)下延伸。
水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)序列表Organization Applicant----------------------Street狮子山街City武汉State湖北省Country中国PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-87397735EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn<110>OrganizationName华中农业大学Application Project-------------------<120>Title水稻抗白叶枯病基因Xa26(t)<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate2002-10-27Sequence--------<213>OrganismName水稻(Oryza sativa)<400>PreSequenceString1aaaaatggcc atgggtccac acgcagtgag atgaatgcta gatctcacga gaaaaaagaa60atacatctca ggggttgtga tgtactggat aatttgctcg tcatattaac cattagctta120ctctagttga tgtgggcatg gatggagccg gcagccggcg atcctattta acctgcttaa180ctacacaatc gttgctggga gacggcaaaa atgcgcgctt ttggagctca aaatggttag240ataatcaaac gccgcaactg attgctccag atattttcat ggtctctaaa agaaaaaaca300gaaccgtgca agatgccatt ttagaaaaca actggatccg agatattgac atctcccgta360tcactgaggc atatcaactc caacagtatg tccacctttg gagaatgatc agagacatga420ggccgctcaa cgaaagctac gatagaatcc gatggaatat cacagcaaat ggacagtact480ttgcaaaatc ggccaatcgg ctacagttcc ttttggctgc gaaatccgtc ttctaccagt540caatttggaa ggcctgggcg cctccgaagt gcaaattctt ctcctggttg gtcactcaaa600acagagtatg cacggcagac agactggaaa aaagaggatg gcaaaaccaa aagacttgcc660cactctgcta catcgtcgat gagtcggcct tacatctcct ggccaaatgc agactcacaa720agaggatatg gacggaaatt caaagatgga ccgggactga cctccaaatg gacaattggg780aaaattgtca ctcggtcgaa caatggtgga ccctcgtagc ggagtcccca agcaccccac840gcaagcctct caggactcta gtgattctaa tctcatggga aatctggtgc aaacgaaacg900caagaatatt ctgcaacaat gcgtctgcgc cgtcctcaat tctagcaaaa atcaaggagg960aaggaagagc atgggtcaaa gcagaggctg caaccttgca agagtttgga atcttgggag1020atatcgccta attcctgctt tttttttcct tttcttttgc gggttattct tgtttaccgt1080cttttttgtc taaccctgta tatgtatatg gctcgttata attttttcta ttaatatata1140caaggcaaag ctattgtctt tccttaaaaa aaaaactaca caatcgttgc tgttctaacc1200accaaatcaa caaaagagta aggccgttgc cgtcagtgag tgtatggctg atgacggagc1260gacacagcta tcatatctag cgtgtcgtgc acaccgcgat ctgctgaata tatattttgt1320gatgtcttta ttttccagcg tttacctagt agtgctgtca aatatttatg accggaagga1380gtatcattta agtttctttc gctttctgag agcaacagtc aaggtcgtcc tacatgtcga1440taaagcaaac tagcactact gtgctaaata aagctcaact tgatcgtcac tgtgaagtat1500gatgcatact cttgctgcca atgcatcaca cacaaccaga catggctctt gttcgattgc1560
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权利要求
1.赋予植物Xa26(t)基因介导的对白叶枯病菌抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示序列，或者与SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亚片段。
2.权利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全长的Xa26(t)基因，该基因编码的蛋白质包含富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域和蛋白激酶结构域，其氨基酸序列如附图11所示。
3.包含与合适调节序列连接的权利要求1的基因编码区DNA片段。
4.权利要求1中的DNA片段，其中的基因编码区与其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因经过修饰改造。
5.权利要求1中的DNA片段，其中的启动子序列是组织特异性的，但在叶片中呈组成型表达；该启动子可以和异源基因连接，调节异源基因的表达。
6.基因组中包含权利要求1、2、3、4、5中的DNA片段的转基因植物和转基因植物种子的应用。
7.一种增加植物对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)抗性的方法，该方法包括将权利要求1的DNA片段转入植物体或将权利要求1中基因区段的DMA片段连接上合适的启动子转入植物体或将权利要求1的DNA片段和其它的DNA片段组成嵌合基因转入植物或将权利要求1的DMA片段经过修饰改造后转入植物体，增加植物对病原菌的抗性。
8.权利要求7的方法，其中所述启动子是组织特异性的启动子或组成型表达的启动子。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一种DNA片断的分离克隆和应用。所述的DNA片断能够赋予植物抵抗由白叶枯病原菌引起的病害。将该片段与其内源调节序列直接转入植物体，或者将该片段和合适的调节序列连接后转入植物体，转基因植物可以产生抗病基因介导的对多种病原菌的防卫反应。将该DNA片段和其它基因的DNA片段重组有可能使植物产生更强和更广的抗病性。
文档编号C12N15/11GK1493692SQ0213921
公开日2004年5月5日 申请日期2002年10月28日 优先权日2002年10月28日
发明者王石平, 孙新立, 曹应龙, 杨之芬, 张启发 申请人:华中农业大学