专利名称：工业化卵黄反应干燥培养基制备方法
技术领域：
本发明属于一种微生物检验培养基的制备方法，具体地说涉及一种工业化卵黄反应干燥培养基制备方法。
背景技术：
在微生物领域中，培养基因其制备方法的不同分为两大类干燥培养基和不可干燥培养基。干燥培养基制备工艺简单、使用方便、可工业化生产而被广泛应用。随着微生物技术的不断发展，许多不可干燥培养基已被研制成为干燥培养基。但目前含卵黄成分的培养基，由于含有遇热不稳定成分，无法制成干燥培养基，只能使用时临时配制。传统卵黄反应培养基的制备过程分为三步①培养基高温灭菌稳定成分，混合制备后高压灭菌，制成制剂A；②卵黄不稳定成分用无菌操作方法制成制剂B(卵黄混悬液)；③将制剂A和制剂B按无菌操作方法，在55℃左右混合制成所需要的卵黄反应完全培养基，此培养基一旦制成只能一次性使用，不能再次加热。从上述配制过程可以看出，由于卵黄中含有遇热不稳定成分，使得制备十分繁琐且难度大，温度和无菌操作不当，随时可能使实验失败。为此，英国Oxoid.Ltd.公司研制了“浓缩卵黄乳悬液”并申请了专利，英国的专利产品实际上是上述传统制备过程中的制剂B，并没有解决卵黄成分遇热不稳定的问题，仅是一个中间产品，卵黄反应培养基的制备过程还需将制剂A和制剂B混合，其操作同样复杂，无法实现卵黄反应培养基的工业化生产。由于卵黄反应培养基存在遇热不稳定、不能工业化生产的缺点，给检验带来极大不便，如成本高、制备复杂、准确性及重现性差等，国内许多检验人员一提到配制卵黄反应培养基就感到头疼。目前，美国、日本等许多发达国家的科研人员正在攻克这一技术难题，但至今尚未研制出卵黄反应干燥培养基。
发明内容本发明的目的在于提供一种可工业化生产、配制简单、使用方便、成本低的卵黄反应干燥培养基制备方法。
本发明的目的可通过如下技术措施来实现一种工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其步骤包括(一)卵黄有效成分的提取取20g鸡蛋黄，用200ml丙酮分三次提取，过滤，合并滤液；滤渣加入200ml乙醇分三次提取，过滤、合并滤液；分别蒸馏除去乙醇，得乙醇提取物；蒸馏除去丙酮，得丙酮提取物；(二)卵黄乳悬液的制取取上述乙醇提取物或其它卜r汕磷脂0.001-1g、上述丙酮提取物或其它中性脂肪0.001-1g，再加入TritonX类表面活性剂0.001-1g、有机胺衍生物类阳离子表面活性剂或聚乙二醇类表面活性剂0.001-1g、金属阳离子0.001-0.5g，将其混合，加入8-12ml 9％氯化钠水溶液研磨，使其乳化均匀，制成卵黄乳悬液，该卵黄乳悬液可替代传统方法制成的卵黄乳悬液，并可根据需要加入促进细菌生长的不同营养成分如糖、盐、胨、 维生素等；(三)称取厌氧鸡蛋琼脂，KG琼脂，Kranep氏琼脂，肝、小牛肉、鸡蛋琼脂，MYP琼脂(甘露糖卵黄多粘菌素琼脂)，TSC琼脂(胰蛋白胨-亚硫酸盐丝氨酸琼脂)，卵磷脂卵黄磷蛋白溶液，卵黄高盐琼脂，SFP琼脂或OPSP琼脂等各种具有卵黄反应的基础培养基或制剂A各成分，用上述制取的卵黄乳悬液按比例等量替代传统方法制成的卵黄乳悬液，与基础培养基成分混合(根据培养基的硬度需要，适量加入琼脂粉)，用NaHCO3或NaOH调整培养基PH值，在温度100±20℃干燥，然后粉碎、150μm±6.6μm过筛、分装，即制得各种卵黄反应干燥培养基。
上述除乙醇提取的卵黄有效成分外，其它甘油磷脂是指豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、缩醛磷脂、丝氨酸磷脂、神经鞘磷脂、溶血卵磷脂或溶血脑磷脂等。
上述除丙酮提取的卵黄有效成分外，其它中性脂肪是指三酰甘油脂，其中三酰甘油脂的R1、R2、R3包括C4～C9短链脂肪酸、C10～C15中链脂肪酸、C16～C19长链脂肪酸及C20以上超长链脂肪酸；饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸。
上述TritonX类表面活性剂是指TritonX-45、TritonX-100、TritonX-101、TritonX-102、TritonX-114、TritonX-155、TritonX-165、TritonX-200、TritonX-405或TritonX-805等。
上述有机胺衍生物类阳离子表面活性剂是指三辛胺、溴化三辛胺、氯化三辛胺、三异辛胺、氯化三辛基甲基铵、三辛基甲基氯化铵、三辛基庚烷铵、甲基三正辛胺、溴化乙基三甲铵、溴化辛基三甲铵、溴化四甲基铵、二羟基二乙基十八胺、氟化羟乙基三甲铵、溴化羟乙基三甲铵、碘化羟乙基三甲铵、碘化四甲铵、溴化癸基三甲铵、胆胺、三正己胺、三乙醇胺、二羟基乙基十二胺、月桂基二乙醇酰胺、二甲基十二胺、四丁基溴化铵、氯化甲基苄乙铵、溴化四丁基铵、四丁基硫酸氢铵、氯化羟乙基三甲铵、氯化二乙基苄铵、四丁基碘化铵、四庚基铵、氯化四丁基铵、氟化四丁基铵、四乙基溴化铵、氯化二甲基苄铵、月桂醇乙基铵、溴化苄基辛基二甲铵、胆碱、乙酰胆碱、柠檬酸二氢胆碱、葡萄糖酸胆碱、碳酸氢胆碱聚氧乙烯十二烷铵或氯化苄基二甲铵等；聚乙二醇类表面活性剂是指PEG-200、PEG-300、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG 1500、PEG-2000、PEG-3000、PEG-4000、PEG-5000、PEG-6000或PEG-8000等。
上述金属阳离子是指Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Cu+、Ag+、Al2+或Al3+等。
本发明提供的卵黄反应干燥培养基制备方法，使卵黄反应干燥培养基的工业化生产成为可能，检验人员实验时再不需要临时配制，只需取干粉加蒸馏水灭菌后，浇碟制成平板即可使用，并可二次加热反复使用，大大简化了实验过程，使用方便、成本低、实验结果误差小，从而使卵黄反应培养基的应用领域得到极大的拓展，可广泛用于食品检验、医院微生物检验、海关微生物检验、化妆品检验、药品检验、生物制品检验、兽医兽药部门的微生物检验以及农业、科研部门的微生物检验，尤具为特殊环境中的医疗、预防提供了快速的微生物检验方法，涉及领域非常广泛。
(四)
具体实施例方式
(四)鉴别对比实验1、以传统方法制备厌氧鸡蛋琼脂培养基平板；2、制作厌氧鸡蛋琼脂干燥培养基平板称取厌氧鸡蛋琼脂干燥培养基干粉6.8g，加100ml蒸馏水，溶解，10磅30分钟灭菌，浇碟制成平板，备用。
3、分别在两种平板上接种肉毒梭状芽胞杆菌，35℃厌氧培养，结果见表1表1两种培养基鉴别肉毒梭状芽胞杆菌的结果
实验结果表明肉毒梭状芽胞杆菌在两种厌氧鸡蛋琼脂平板上的鉴别效果一致。
需要说明的是MYP琼脂培养基传统配方中加入的制剂C多粘菌素B硫酸盐，可按传统制备方法于49±1℃时加入；因本发明卵黄反应有效成分经过调整，鉴别特异性增强，也可不加制剂C多粘菌素B硫酸盐。
(三)鉴别对比实验1、以传统方法制备MYP琼脂培养基平板；2、制作MYP琼脂干燥培养基平板称取MYP琼脂干燥培养基干粉5.9g，加100ml蒸馏水，10磅30分钟灭菌，浇碟制成平板，备用。
3、两种平板分别接种蜡样芽胞杆菌，32℃培养，结果见表2表2两种培养基鉴别蜡样芽胞杆菌的结果
实验结果表明蜡样芽胞杆菌在两种MYP琼脂平板上的鉴别效果一致。
3、两种平板分别接种产气荚膜梭状芽胞利菌，35-37℃厌氧培养，结果见表3表3两种培养基鉴别产气荚膜梭状芽胞杆菌的结果
实验结果表明产气荚膜梭状芽胞杆菌在两种厌氧鸡蛋琼脂平板上的鉴别效果一致。
3、两种平板分别接种金黄色匍萄球菌，在35℃培养，结果见表4
表4两种培养基鉴别金黄色葡萄球菌的结果
表5两种培养基平板的外观及物理性质的比较
*注以“+”的多少，表示平板的透明程度表4、5实验结果表明亚碲酸盐多粘菌素卵黄琼脂干燥培养基与亚碲酸盐多粘菌素卵黄琼脂培养基对金黄色葡萄球菌的鉴别效果一致，且干燥后培养基透明度优于传统方法制备的亚碲酸盐多粘菌素卵黄琼脂培养基平板，更有利于实验结果的观察。
权利要求
1.一种工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于它包括以下步骤(一)卵黄有效成分的提取取20g鸡蛋黄，用200ml丙酮分三次提取，过滤，合并滤液；滤渣加入200ml乙醇分三次提取，过滤、合并滤液；分别蒸馏除去乙醇，得乙醇提取物；蒸馏除去丙酮，得丙酮提取物；(二)卵黄乳悬液的制取取上述乙醇提取物或其它甘油磷脂0.001-1g、上述丙酮提取物或其它中性脂肪0.001-1g，再加入TritonX类表面活性剂0.001-1g、有机胺衍生物类阳离子表面活性剂或聚乙二醇类表面活性剂0.001-1g、金属阳离子0.001-0.5g，将其混合，加入8-12ml 9％氯化钠水溶液研磨，使其乳化均匀，制成卵黄乳悬液，该卵黄乳悬液可替代传统方法制成的卵黄乳悬液，并可根据需要加入促进细菌生长的不同营养成分如糖、盐、胨、 、维生素等；(三)称取厌氧鸡蛋琼脂，KG琼脂，Kranep氏琼脂，肝、小牛肉、鸡蛋琼脂，MYP琼脂，TSC琼脂，卵磷脂卵黄磷蛋白溶液，卵黄高盐琼脂，SFP琼脂或OPSP琼脂等各种具有卵黄反应的基础培养基或制剂A各成分，用上述制取的卵黄乳悬液按比例等量替代传统方法制成的卵黄乳悬液，与基础培养基成分混合，用NaHCO3或NaOH调整培养基PH值，在温度100±20℃干燥，然后粉碎、150μm±6.6μm过筛、分装，即制得各种卵黄反应干燥培养基。
2.根据权利要求1所述的工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于上述除乙醇提取的卵黄有效成分外，其它甘油磷脂是指豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、缩醛磷脂、丝氨酸磷脂、神经鞘磷脂、溶血卵磷脂或溶血脑磷脂等。
3.根据权利要求1所述的工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于上述除丙酮提取的卵黄有效成分外，其它中性脂肪是指三酰甘油脂，其中三酰甘油脂的R1、R2、R3包括C4～C9短链脂肪酸、C10～C15中链脂肪酸、C16～C19长链脂肪酸及C20以上超长链脂肪酸；饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸。
4.根据权利要求1所述的工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于上述TritonX类表面活性剂是指TritonX-45、TritonX-100、TritonX-101、TritonX-102、TritonX-114、TritonX-155、TritonX-165、TritonX-200、TritonX-405或TritonX-805等。
5.根据权利要求1所述的工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于上述有机胺衍生物类阳离子表面活性剂是指三辛胺、溴化三辛胺、氯化三辛胺、三异辛胺、氯化三辛基甲基铵、三辛基甲基氯化铵、三辛基庚烷铵、甲基三正辛胺、溴化乙基三甲铵、溴化辛基三甲铵、溴化四甲基铵、二羟基二乙基十八胺、氟化羟乙基三甲铵、溴化羟乙基三甲铵、碘化羟乙基三甲铵、碘化四甲铵、溴化癸基三甲铵、胆胺、三正己胺、三乙醇胺、二羟基乙基十二胺、月桂基二乙醇酰胺、二甲基十二胺、四丁基溴化铵、氯化甲基苄乙铵、溴化四丁基铵、四丁基硫酸氢铵、氯化羟乙基三甲铵、氯化二乙基苄铵、四丁基碘化铵、四庚基铵、氯化四丁基铵、氟化四丁基铵、四乙基溴化铵、氯化二甲基苄铵、月桂醇乙基铵、溴化苄基辛基二甲铵、胆碱、乙酰胆碱、柠檬酸二氢胆碱、葡萄糖酸胆碱、碳酸氢胆碱聚氧乙烯十二烷铵或氯化苄基二甲铵等；聚乙二醇类表面活性剂是指PEG-200、PEG-300、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG-1500、PEG-2000、PEG-3000、PEG-4000、PEG-5000、PEG-6000或PEG-8000等。
6.根据权利要求1所述的工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，其特征在于上述上述金属阳离子是指Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+、Cu+、Ag+、Al2+或Al3+等。
全文摘要
一种工业化卵黄反应干燥培养基的制备方法，它包括以下步骤用无水乙醇和丙酮提取卵黄有效成分或用其它甘油磷脂、中性脂肪与TritonX类表面活性剂、有机胺衍生物类阳离子表面活性剂或聚乙二醇类表面活性剂、金属阳离子混合，加入氯化钠水溶液研磨，使其乳化均匀，制取卵黄乳悬液；再称取具有卵黄反应的基础培养基或制剂A各成分与卵黄乳悬液混合，调整培养基pH值，再经干燥、粉碎、过筛、分装，即制得各种卵黄反应干燥培养基。该方法使卵黄反应干燥培养基的工业化生产成为可能，配制简单，简化了实验过程，使用方便、成本低、实验结果误差小，从而使卵黄反应培养基的应用领域得到极大的拓展。
文档编号C12Q1/04GK1414109SQ02141758
公开日2003年4月30日 申请日期2002年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者宋京都 申请人:宋京都