专利名称：一种用于乳腺癌诊断的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分泌型差异人乳腺球蛋白质(hMAM)，特别是涉及一个缺失三个氨基酸的hMAM新的剪接体，一种用于乳腺癌诊断的基因。
背景技术：
现已发表的有关乳腺癌肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、铁蛋白、乳清蛋白、人绒毛膜促性腺激素、唾液酸转移酶、整合蛋白家族、CD44、尿激酶型纤溶酶原激活物、血栓致敏蛋白、p53基因及蛋白产物、c-erbB-2基因产物、降钙素、CA-549、CA-153、CK-20、BRCA1和BRCA2基因等。这些标志物分别存在于细胞、血液和体液中，对早期乳腺癌的诊断有一定的价值，但其特异性不强，不能用为确诊乳腺癌的指标，故难以应用这些肿瘤标志物建立乳腺癌的免疫诊断方法。2002年3月美国Coria生物技术公司用cDMA削减杂交和基因蕊片技术证实，hMAM是乳腺癌的特异高表达基因。由于乳腺组织供血丰富，乳腺癌癌细胞浸润血管并沿血路转移是乳腺癌转移的一种主要模式。故hMAM一经报告，国内外学者竞相利用逆转录聚合链式反应(RT-PCR)技术检测乳腺癌患者外周血hMAMmRNA的水平，探讨hMAM诊断乳腺癌的价值。不同的作者报导的hMAM在乳腺癌患者中的检出阳性率不同，平均为80％，在几乎所有的报导中，正常健康人外周血中均不能查出hMAM。亦有报告无症状的早期乳腺癌患者hMAM检出为阳性后，进一步的病理活检证实为I、II期乳腺癌患者。RT-PCR虽然为一种敏感的检测基因表达方法，但存在一定比例的假阳性和假阴性，此外，RT-PCR操作步骤多，又需要高性能的基因扩增仪，难以在乳腺癌普查中广泛应用。国际癌症研究资料表明，I、II、III期乳腺癌的5年生存率分别为80％、52％、42％和14％。这充分说明乳腺癌早期发现、早期诊断、早期治疗直接影响着治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有很高的特异性，不存在假阳性和假阴性的用于乳腺癌诊断的基因。
本发明一种用于乳腺癌诊断的基因，是一个缺失三个氨基酸的hMAM新的剪接体，它是从乳腺癌组织中利用差式筛选和cDNA末端扩增(RACE)及逆转录聚合链式反应RT-PCR技术，在上皮细胞中克隆出一个分子量10KD的分泌型差异人乳腺球蛋白质(hMAM)，它是一个缺少三个氨基酸的hMAM新的前接体，其基因序列如下1 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 61 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaat gtctaagact 121 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 181 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgagcaatta 241 atatatgaca gcagtctttg tgatttattt taa。
本发明一种用于乳腺癌诊断的基因，具有很高的特异性，不存在假阳性和假阴性，可用来建立新的特异性乳腺癌免疫诊断方法，以及以单克隆抗体为基础建立一种新的乳腺癌免疫显像诊断试剂。利用上述两种方法可以用来诊断早期乳腺癌、乳腺癌的转移、术前确定手术范围、术后检查复发。
具体实施例方式
本发明一种用于乳腺癌诊断的基因的制备方法是1)取乳腺癌手术患者的血清标本，差式筛选，cDA末端扩增扩和逆转录聚合链式反应RT-PCR克隆hMAM全长cDNA。
2)将其亚克隆入含EcoRI/SalI酶切位点的pGEX-1GST融合表达载体，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
3)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白电泳测定GST-hMAM蛋白表达水平。
4)GST亲和柱法纯化hMAM，即得到该基因。经西安第四军医大学测序分析，其基因序列如上所述。纯度达95％。
本发明一种用于乳腺癌诊断的基因诊断乳腺癌应用实例。诊断方法分别取已确诊的乳腺癌患者、确诊的非乳腺恶性肿瘤患者及正常人的血清标本各30例，经逆转录聚合链式反应RT-PCR克隆hMAM全长的cDNA，分别与本发明进行比较，检测基因表达的水平。
诊断结果表明1)非乳腺恶性肿瘤患者及正常人的血清标本中该基因均呈阴性，阴性率100％。
2)原发性乳腺，转移性乳腺癌患者的血清标本中该基因呈阳性，阳性率100％。
3)没有发现假阳性及假阴性的结果。
4)说明该基因在乳腺癌患者的组织中具有特异性的表达。
权利要求
1.一种用于乳腺癌诊断的基因，是从乳腺癌组织中利用差式筛选和cDNA末端扩增及逆转录聚合链式反应RT-PCR技术，在上皮细胞中克隆出的一个分子量10KD的分泌型差异人乳腺球蛋白质hMAM，其特征在于是一个缺失三个氨基酸的hMAM新的剪接体，基因序列如下1 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 61 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 121 gaatacaaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 181 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgagcaatta 241 atatatgaca gcagtctttg tgatttattt taa。
全文摘要
本发明提供一种用于乳腺癌诊断的基因，是从乳腺癌组织中利用差式筛选和cDNA末端扩增及逆转录聚合链式反应RT－PCR技术，在上皮细胞中克隆出的一个分子量10KD的分泌型差异人乳腺球蛋白质(hMAM)，是一个缺失三个氨基酸的hMAM新的剪接体。利用该基因可建立一种新的特异性乳腺癌免疫诊断方法，同时，以单克隆抗体为基础建立一种新的乳腺癌免疫显像诊断试剂。从而用于诊断早期乳腺癌，乳腺癌的转移，术前确定手术范围，术后检查复发。
文档编号C12P19/34GK1482252SQ0311722
公开日2004年3月17日 申请日期2003年1月23日 优先权日2003年1月23日
发明者赵利军 申请人:赵利军