专利名称：用螺旋藻同源重组和表达人体基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种螺旋藻基因工程新技术，用以获取同源重组和稳定表达人体基因的螺旋藻转化子。
背景技术：
迄今，螺旋藻的分子遗传背景尚不清楚，国内外仅先后从螺旋藻中克隆出藻蓝蛋白、八氢番茄红素合成酶等近10个基因，对螺旋藻基因组的序列和结构知之甚少。在目前不了解螺旋藻基因组结构和遗传背景的情况下，如果去设计一个概念化的外源基因转化螺旋藻的方法是不可操作的。研究者必须通过某一个具体的外源基因构建出能与螺旋藻匹配、相容和重组的表达质粒，采用有效的转化方法，去创建螺旋藻的重组和表达体系。这是螺旋藻基因工程的难点。
螺旋藻基因工程的另一个难点是其没有内源质粒，目前难以采用穿梭质粒等基因工程方法进行外源基因的重组与表达。
TRAIL基因是人体肿瘤凋亡因子基因，它是1995年由Wiley克隆和命名的，属于肿瘤坏死因子基因家族中的一个新成员。肿瘤坏死因子对肿瘤细胞具有强烈的致死作用、但其没有选择性，即对人体正常细胞同样具有强烈的致死作用，故在临床上难以应用。TRAIL能够诱导各种肿瘤细胞快速调亡，而对人体正常细胞无毒副作用，因而是一种具有重大临床应用前景的治癌新药。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在人体基因重组表达载体序列中连接螺旋藻同源片段，用以定点插入和整合到螺旋藻基因组中表达的方法。
螺旋藻具有原核光合特性，选择与之匹配的高效调控元件是一重要关键技术，申请人采用高等植物叶绿体光合基因调控元件，因为叶绿体是真核细胞中的核外基因组，兼备原核与真核的特性，一则能与螺旋藻的原核和光合特性匹配，同时又可与重组人体基因匹配。叶绿体基因的转录单位通常是多顺反子、基因排列方式、调控方式、GC碱基对含量以及翻译所偏爱的密码子与原核细胞相接近。叶绿体光合基因的启动子既包含有相当于原核的-10盒(TATACT)和-35盒(TTGACA)，同时在这两个盒之间还存在着一个类似真核的TATA盒(TATATA)序列结构。叶绿体光合基因启动子不仅能表达原核基因，同时也能表达真核基因。这将会极大地拓宽螺旋藻基因重组和表达体系的功能。
螺旋藻若采用一般常规的质粒转化方法，如电击转化，化学转化、超声波转化等都存在在极大的困难。因为这些常规的转化方法必须首先制备螺旋藻的单细胞原生质体作为转化受体，即把螺旋藻丝体分离成单细胞，并要把细胞壁全部去除干净，使细胞裸露而形成原生质体。目前，这一技术在国内外尚无成功先例，或是去壁不完全，或是去壁对细胞的损伤太大，或是原生质体丧失再生能力。本发明避开了这一技术难点，不需要制备单细胞原生质体，而采用适合的轰击参数，直接用基因枪转化螺旋藻丝体。
本发明可以通过以下方式来实现，均为无菌操作1、螺旋藻抗性标记基因的重组质粒构建(1)用氯霉素乙酰转移酶CAT基因作为螺旋藻的抗性基因，SalI酶切含有CAT基因表达盒的质粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含叶绿体光合基因表达盒的质粒，回收含有光合基因启动子和终止子片段；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质粒(I)。
2、含目的基因的抗性重组运载质粒构建(1)EcoRI酶切TRAIL基因文库质粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其为TRAIL基因不含编码膜结合部分的片段；(2)XbaI酶切重组质粒(I)；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得含目的基因的抗性重组表达质粒(II)。
3、螺旋藻同源片段的重组质粒构建(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的质粒，回收同源片段(2)PstI酶切质粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ调控序列和前146个氨基酸编码序列，在这个编码区中插入一个多克隆酶切位点；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质粒(III)。
4、含目的基因重组表达载体构建(1)SalI、HindIII双酶切重组质粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位点的片段；(2)SalI酶切重组质粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA连接酶连接以上的两个片段后，获得含目的基因的TRAIL的重组表达载体、～7000bp，其含的重组基因与元、部件为ST、CAT表达盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
5、基因枪转化(1)取对数生长期的无菌螺旋藻，接种于含双抗的无菌培养液中，经20～28h培养，接种到1.5～2.5％琼脂固体培养基平板上；(2)采用适合的轰击参数可裂膜800～1200psi，真空度24～28inHg，轰击距离5～8cm，将金粉包裹的重组表达载体用基因枪轰击和转化平板上的螺旋藻体，然后转入无抗生素的液体培养液中培养5～10天。
6 螺旋藻转化子的抗性传代筛选用分别含有40～400μg/ml氯霉素从低浓度到高浓度连续多轮抗性传代筛选，每轮持续20天以上，直至杀灭所有未转化的螺旋藻，仅存螺旋藻转化子藻体；将转化子转入无氯霉素的培养液中恢复培养，以获得螺旋藻转化子种群培养物；对螺旋藻转化子跟踪进行Southern blot和Westernblot检测，必需确证TRAIL阳性电泳杂交带。
本发明创建的螺旋藻表达体系具有其独特的优势。螺旋藻兼备微生物和高等植物的优点，即其基因组为原核型，遗传背景比较简单，便于进行基因分析和外源DNA检测；其细胞壁呈革兰氏阴性，由肽聚糖组成，有利于外源基因导入；其对光能的转化率高达18％，生长速率大，是一种罕见的蛋白质高效表达和合成体系，有利于外源基因的表达；同时，其营养价值很高，适于食用，有利于生产可食化的基因药物。本发明把TRAIL基因重组到螺旋藻中进行表达，对开拓螺旋藻基因工程制药具有重要的创新意义。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述。
1、螺旋藻抗性标记基因的重组质粒构建螺旋藻对氯霉素敏感，氯毒素乙酰转移酶CAT基因适于作为螺旋藻转化子的抗性筛选基因。(1)SalI酶切含有CAT基因表达盒的质粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含叶绿体光合基因表达盒的质粒，回收含有光合基因启动子和终止子片段；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质粒(I)。
2、含目的基因的抗性重组运载质粒构建TRAIL是一种膜蛋白，其一个末端序列插入膜内。申请人所需TRAIL基因是不含编码膜结合部分的功能片段，表达产物呈可溶性(1)EcoRI酶切TRAIL基因文库质粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其为TRAIL基因不含编码膜结合部分的片段；(2)XbaI酶切重组质粒(I)；(3)将获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得含目的基因的抗性重组表达质粒(II)。
3、螺旋藻同源片段的重组质粒构建ST是螺旋藻的随机同源片段(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的质粒，回收同源片段(2)PstI酶切质粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ调控序列和前146个氨基酸编码序列，在这个编码区中插入一个多克隆酶切位点；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质粒(III)。
4、含目的基因重组表达载体构建(1)SalI、HindIII双酶切重组质粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位点的片段；(2)SalI酶切重组质粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA连接酶连接以上的两个片段后，获得含目的基因的TRAIL的重组表达载体、～7000bp，其含的重组基因与元、部件为ST、CAT表达盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
5、基因枪转化(1)宿主螺旋藻的处理。取对数生长期的无菌螺旋藻，接种于含双抗的无菌培养液中，经24h培养，接种到2％琼脂固体培养基平板上；(2)采用适合的轰击参数可裂膜1000psi，真空度26inHg，轰击距离6cm，将金粉包裹的重组表达载体用基因枪轰击和转化平板上的螺旋藻体，然后转入无抗生素的液体培养液中培养7天。
6 螺旋藻转化子的抗性传代筛选用分别含有40～400μg/ml氯霉素的Zarrouk培养液对上述螺旋藻进行连续多轮抗性传代筛选，直至获得转化子(1)用低浓度氯霉素，在28C和光照条件下进行第一轮抗性传代筛选；(2)20天后，将螺旋藻用中等浓度氯霉素的培养液中进行第二轮抗性传代筛选；(3)20天后，再将螺旋藻用高浓度氯霉素的培养液中进行第三轮抗性传代筛选，直至杀灭所有未转化的螺旋藻，而仅存螺旋藻转化子藻体；(4)将转化子转入无氯霉素的培养液中恢复培养，以获得螺旋藻转化子种群培养物；(5)对螺旋藻转化子跟踪进行Southern blot和Western blot检测，必需确证TRAIL阳性电泳杂交带。
权利要求
1.用螺旋藻同源重组和表达人体基因的方法，其特征在于(1)螺旋藻抗性标记基因的重组质粒构建；(2)含目的基因的抗性重组运载质粒构建；(3)螺旋藻同源片段的重组质粒构建；(4)含目的基因重组表达载体构建；(5)基因枪转化；(6)螺旋藻转化子的抗性传代筛选。
2.依权利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻抗性标记基因的重组质粒构建包括以下步骤(1)SalI酶切含有CAT基因表达盒的质粒，回收CAT基因片段；(2)EcoRI酶切含叶绿体光合基因表达盒的质粒，回收含有光合基因启动子和终止子片段；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质粒(I)。
3.依权利要求1所述的方法，其特征在于含目的基因的抗性重组运载质粒构建包括以下步骤(1)EcoRI酶切TRAIL基因文库质粒PBaCPAV-TRAIL，回收～600bp小片段，其为TRAIL基因不含编码膜结合部分的片段；(2)XbaI酶切重组质粒(I)；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得含目的基因的抗性重组表达质粒(II)。
4.依权利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻同源片段的重组质粒构建包括以下步骤(1)SalI、PstI酶切含有螺旋藻同源片段的质粒，回收同源片段(2)PstI酶切质粒PUC19，回收2686bp的大片段，其含β一半乳糖苷酶基因LacZ调控序列和前146个氨基酸编码序列，在这个编码区中插入一个多克隆酶切位点；(3)将以上获得的片段用T4DNA连接酶连接后，获得重组质(III)。
5.依权利要求1所述的方法，其特征在于含目的基因重组表达载体构建包括以下步骤(1)SalI、HindIII双酶切重组质粒(III)，回收含有同源片段和多克隆酶切位点的片段；(2)SalI酶切重组质粒(II)，回收大片段；(3)用T4DNA连接酶连接以上的两个片段后，获得含目的基因的TRAIL的重组表达载体、～7000bp，其含的重组基因与元、部件为ST、CAT表达盒、psbApro-TRAIL-psbAter。
6.依权利要求1所述的方法，其特征在于基因枪转化包括以下步骤(1)取对数生长期的无菌螺旋藻，接种于含双抗的无菌培养液中，经20～28h培养，接种到1.5～2.5％琼脂固体培养基平板上；(2)将金粉包裹的重组表达载体用基因枪轰击和转化平板上的螺旋藻体，然后转入无抗生素的液体培养液中培养5～10天。
7.依权利要求1所述的方法，其特征在于螺旋藻转化子的抗性传代筛选包括以下步骤(1)用分别含有40～400μg/ml氯霉素从低浓度到高浓度连续多轮抗性传代筛选，每轮持续20天以上，直至杀灭所有未转化的螺旋藻，仅存螺旋藻转化子藻体；(2)将转化子转入无氯霉素的培养液中恢复培养，以获得螺旋藻转化子种群培养物。
8.依权利要求6所述的方法，其特征在于基因枪轰击参数可裂膜800～1200psi，真空度24～28inHg，轰击距离5～8cm。
9.依权利要求7所述的方法，其特征在于抗性传代筛选所得螺旋藻转化子跟踪进行Southern blot和Western blot检测，必需确证TRAIL阳性电泳杂交带。
全文摘要
本发明涉及一种用基因枪把克隆和构建的人体肿瘤凋亡因子TRAIL基因表达载体同源重组到螺旋藻基因组中进行稳定表达的方法。重组TRAIL表达载体的特征性元部件包括抗性标记基因表达盒CAT、叶绿体光合基因启动子和终止子、螺旋藻同源片段、不含编码膜结合部分的TRAIL基因片段等，这个表达系统兼备原核和真核的特征。设定合适的轰击参数，用基因枪把重组表达载体直接导入螺旋藻丝体，并经多轮浓度递增的氯霉素抗性连续传代筛选和分子生物学检测确证，得到TRAIL基因的螺旋藻转化子。本发明适用于用螺旋藻重组与表达人体基因，也适用于重组与表达其它原核和真核基因，这对螺旋藻的深度开发具有重要价值。
文档编号C12N15/63GK1528902SQ20031011171
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月2日 优先权日2003年10月2日
发明者钱凯先, 王勇, 苏中亮, 曾文辉, 李江平, 王宏 申请人:广东梅县梅雁蓝藻有限公司