乙酰胆碱酯酶分析的制作方法

专利名称：乙酰胆碱酯酶分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测人类乙酰胆碱酯酶(AChE)的基于唾液的分析方法。
背景技术：
胆碱酯酶(ChE)是一组水解胆碱酯的相关酶的统称。机体中存在两种胆碱酯酶，它们的酶学特性，生理功能以及在机体中的分布都不同。第一种是乙酰胆碱酯酶(也称为真正的胆碱酯酶)，它特异性降解乙酰胆碱，在红细胞(血红细胞)、神经组织、肌肉等等中大量存在，并且其分布与这些生理功能相关。另一种胆碱酯酶是丁基胆碱酯酶(也称为假胆碱酯酶)，它作用于胆碱，如苯甲酰胆碱和丁基胆碱，在血清和肝脏中大量存在，在肝脏中生成，据认为其生理作用很有可能与神经肌肉系统有关。
真胆碱酯酶和假胆碱酯酶都负责水解由神经末稍释放的乙酰胆碱(ACh)，这种乙酰胆碱是该神经末稍去极化，从而在下一个传导事件中再极化所必需的。这种快速去极化和再极化的过程沿着具有电兴奋能力的膜传递，从而传递神经冲动。
目前在临床实验室检查中常测的胆碱酯酶是血清中的胆碱酯酶。这种酶是糖蛋白，分子量约340,000，由4个相同的亚基组成。每一亚基由574个氨基酸组成，包含9个天冬氨酸偶联型糖链。临床上，如果测出此酶活性降低，对于确定肝脏疾病(尤其是慢性肝实质疾病，如肝硬化和慢性肝炎)中肝实质的功能损伤的程度有重要意义。由于血清胆碱酯酶由肝实质细胞生成，其减少可指示肝细胞的慢性功能减退。此外，在基于有机磷的农业化学品或氨基甲酸酯类杀虫剂所致的中毒病例中，可观察到胆碱酯酶活性的急剧降低，对这种酶活性的检测是这些情况中必不可少的。此外，在肾病综合征中，可观察到此酶活性的显著升高。
过去，胆碱酯酶通过多种方法进行测量，包括硫代胆碱法，其中以合成的乙酰硫代胆碱、丙酰硫代胆碱、和丁基硫代胆碱为底物，用SH分析试剂进行染色来测定被胆碱酯酶释放的硫代胆碱；紫外线(UV)法，其中利用苯甲酰胆碱作为底物，直接测定底物对紫外线吸收的减少；pH比色法，其中利用pH指示剂测量由胆碱酯酶产生的有机酸；酶法(胆碱氧化酶法)，其中以苯甲酰胆碱为底物，以胆碱氧化酶和过氧化物酶为协作酶，利用显色系统测量胆碱特异性降解期间由胆碱酯酶产生的过氧化氢。
上述所有方法都基于对人体血液(可参见2002年10月8日公开的美国专利6461831)或眼内液体(可参见1997年1月21日公开的美国专利5595883)中胆碱酯酶活性的研究。所有方法都是侵入性方法，给受试者带来明显不便和负担。由于对人体胆碱酯酶活性的研究必需从受试者体内采血，很多被怀疑由氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起中毒的人不愿意参与检测胆碱酯酶活性变化的检测项目。此外，利用基于血液的方法来检测人体中胆碱酯酶活性的检测项目，由于所涉及的费用问题，只能按一定的时间表进行，如一个月一次或半年一次。由于必需由训练有素的人员来采血并完成实验室检测，这意味着受试者必需亲自前往医疗机构。如果受试者是按日支付工资的工人，这就意味着他们得终止工作并损失一大笔维持生计的收入。因此，需要有一种简单的、费用较低的、属于普通民众支付能力以内的程序，在这样的程序中，普通民众可以在任何时间自行完成上述检测，而无需训练有素人员的指导。如果是非侵入性的方法当然更好。
我们现在发现，唾液可以取代血液而用于检测人体中的胆碱酯酶活性。具体地，本发明涉及在得自人类的唾液中检测乙酰胆碱酯酶，因此本发明避免了从受试者采血的繁琐过程。
对农业化肥的不适当使用或处理，使农场以及公共卫生工作者处于化学中毒的危险之下。在作物收获之前，为了保护作物不受病虫害的侵害而不加选择地使用杀虫剂，有可能残留大量化学品，危害公众健康。在发展中国家，环保型耕作花费较高，故不是很多见，环保培养的食物仅限于供应较高等级的社会阶层。因此，需要开发一种便于用户使用、又为用户所能承受的快速检测检验试剂盒，用于检测化学品中毒。本发明可以提供试剂盒，用于检测被怀疑由氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起中毒的人体内胆碱酯酶活性的改变。

发明内容
本发明的一个目标是提供一种新的诊断试验，其用于早期检测人体中乙酰胆碱酯酶活性的升高或降低，该试验克服了现有方法中存在的上述限制。
相应地，本发明从最广泛的意义上提供了一种基于唾液的早期检测人体中乙酰胆碱酯酶活性改变的方法。
为了实现上述目标，使用Ellman的方法对人的唾液进行微观分析来检测乙酰胆碱酯酶的活性。将光密度的变化定义为相对于未处理的对照人群的平均酶水平而言，酶量的增加或减少。
本发明的方法优选应用于检测氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品中毒的人体内乙酰胆碱酯酶活性的改变。
本发明的第二个目标是开发一种检测试剂盒，作为早期检测在大量频繁应用氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品的工作场所工作的工人的氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品中毒的检测试剂盒。这种试剂盒也可以由那些因食用了带有高水平的残留杀虫剂的收获作物而可能受到影响的普通公众来使用，所述高水平的残留杀虫剂是由于未受过良好教育的农民在收获前不加选择地使用杀虫剂造成的。
为了实现第二个目标，本发明提供了一种包含6种成分的试剂盒，并使用上述微观分析方法检测未经离心的人类唾液中乙酰胆碱酯酶活性的改变。通过将检测中得到的色度与标准比色图谱进行比较，从而对酶活性的改变进行评分。
具体实施例方式
在本实验中，用Ellman的方法，通过宏观分析和微观分析，来检测人的唾液中的乙酰胆碱酯酶活性。
实施例1 酶活性的宏观分析宏观分析针对12例受试者进行，其中6例男性，6例女性。这些受试者是根据Moss等(1994)的方法选出的。所有12例受试者均为健康成年人，且都不存在使他们的体内胆碱酯酶水平改变的危险例如，长期暴露于应用杀虫剂的环境，有急性感染和影响心脏、肺、肾、脑或内分泌系统的慢性疾病，遗传病，有精神病症状或近期内接受过任何手术治疗。
从12例受试者获得唾液样品，用滤纸除去气泡和残渣如痰。将12例唾液样品置于冰盒中冷藏保存。用塑料吸头将样品转移至塑料小瓶中，4℃以8,000rpm离心10分钟。与此同时，制备pH 6.8的磷酸钾缓冲液。该缓冲液的组成为0.4735g Na2HPO4在50ml蒸馏水中的溶液，0.454g KH2PO4在50ml蒸馏水中的溶液。底物为4℃保存的碘化乙酰胆碱溶液，用0.0375g碘化乙酰胆碱，5ml丙酮和45ml磷酸钾缓冲液来制备。将底物溶液在一个瓶子中混合，将该瓶子用铝箔包裹，以绝对避免见光。之后，用0.0065g 5，5-二硫基二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和50ml磷酸钾缓冲液制备偶联剂，即Ellman氏溶液。将容纳了这种Ellman氏溶液的试剂瓶也用铝箔包裹，以避免见光。
对12例唾液样品如下处理从每一份样品中用吸头取出约333μl，转移至1ml试管(curvette)中。然后，加入约333μl碘化乙酰胆碱(底物)的丙酮缓冲液。再在每个试管(curvette)中加入约333μl DTNB。此外，用333μl底物，333μl DTNB和333μl磷酸缓冲液制备不含唾液的空白对照。该空白对照的光密度为0.08。将12个试管(curvette)在室温(25℃)保温30分钟。30分钟后，通过目测以及通过410nm的分光光度测量，对由DTNB产生的发色团的强度进行评分。记录每一试管(curvette)的光密度。结果见表1。
实施例2 酶活性的微观分析用微观分析样品重复上述实验。实验方法与对乙酰胆碱酯酶进行宏观分析的方法一样，但用量不同。钾缓冲液、底物和DTNB分别的用量不是333μl，而是50μl。从原来的12例受试者获得唾液样品。首先，将50μl磷酸缓冲液加入50μl底物和50μl DTNB中，并置于微量滴定板的一个孔中，从而制备空白对照。该空白对照的光密度为0.08。将50μl底物和50μl DTNB用移液管转移至上述微量滴定板的另外12个孔中。然后，每孔加入50μl已经离心处理的唾液，室温(25℃)保温30分钟。30分钟后，用免疫分析读取仪(reader)以410nm波长读取光密度。结果见表3。通过这种方法发现，所有12例样品的光密度都与空白对照的相似。
用未经离心的唾液重复上述实验。收集唾液，在微量离心管中4℃保存，静置1小时使之沉淀。应注意，胆碱酯酶是相对较稳定的酶，在冷冻或0-5℃都可保存数周(Wilkinson，1976)。1小时后，再次将50μl的底物、DTNB和唾液加入微量滴定板的各个孔中。用免疫分析读取仪以410nm波长读取光密度。结果见表4。
结果结果表明，经离心处理的人类唾液通过宏观分析含有显著量的乙酰胆碱酯酶，未经离心处理的唾液通过微观分析含有显著量的乙酰胆碱酯酶。对宏观分析(表2)和微观分析(表5)进行T-检验，得到统计学结果。将男性和女性受试者的结果汇总，得出宏观分析的平均光密度为0.15±0.04，而微观分析的为0.34±0.19。根据T-检验的结果也可以得出结论，即唾液中的乙酰胆碱酯酶活性在不同性别之间不存在显著性差异，因为宏观分析(表2)和微观分析(表5)都是p＞0.05。
结果还表明，在不经离心处理的情况下，即使是50μl这样小量的唾液，也能检测出显著量的乙酰胆碱酯酶活性。出现这样的情况，部分是由于胆碱酯酶分子量较高，为2-12×106道尔顿(Wilkinson，1976)。因此，即使是这样小的量，也可以通过离心将乙酰胆碱酯酶沉降下来。此外，尽管乙酰胆碱酯酶是可溶性酶，但大多数这种酶蛋白粘附在颗粒性物质上，因此，在测定胆碱酯酶活性之前，很难使匀浆物澄清到理想状态(Wilkinson，1976)。
通过比较宏观分析和微观分析的光密度，结果发现，未经离心的唾液通过微观分析测出的光密度比离心后的唾液通过宏观分析测出的光密度更强。较深的黄色产生较大的光密度读数，这反映出较高的乙酰胆碱酯酶活性。这与Moss等(1994)的结果一致。因此检测人类唾液中乙酰胆碱酯酶活性最好是用未经离心的唾液通过微观分析来进行。
表1 宏观分析测得的不同性别受试者的乙酰胆碱酯酶水平

表2 男性和女性受试者中乙酰胆碱酯酶水平的比较

表3 离心后的唾液通过微观分析测出的乙酰胆碱酯酶水平

表4 未经离心的唾液通过微观分析测出的乙酰胆碱酯酶水平

表5 男性和女性受试者的未经离心的唾液中乙酰胆碱酯酶活性的比较

试剂盒的开发本发明还开发了一种检测试剂盒，用于检测被怀疑氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品中毒的人体内乙酰胆碱酯酶的活性。本发明的检测试剂盒包括6种成分。每一种成分分别装在不同的容器中，例如黑色试剂瓶中，如下瓶A磷酸钾缓冲液10ml瓶B丙酮1ml瓶C碘化乙酰胆碱7.5mg瓶D磷酸钾缓冲液9ml瓶E磷酸钾缓冲液10ml瓶FDTNB 1.3mgA B C D E F

缓冲液 丙酮 ACTH 缓冲液 缓冲液 DTNB10ml 1ml 7.5mg9ml 10ml 1.3mg按照本发明制备的检测试剂盒基本上由以下物质组成磷酸钾缓冲液(0.05M，pH 6.8)，碘化乙酰胆碱底物以及作为偶联剂的5，5-二硫基二(2-硝基苯甲酸)。这种检测试剂盒可以按照以下方案加以应用(a)瓶A是匀浆缓冲液
(b)将B倾入C中并通过混合而彻底溶解C(c)将D倾入C并充分混合(d)将E倾入F并充分混合使物质溶解(e)工作溶液是溶液A，C和F(f)通过吐至洁净纸杯中的方式来采集新鲜唾液(g)将50μl唾液加入eppendorf试管中，向其上层添加溶液A，将体积补足0.5ml(h)用pasteur移液管在微量滴定板的每一孔中滴入一滴步骤(g)的唾液(8-10份重复)(i)在前2孔中滴入一滴溶液C(j)在这两孔中滴入一滴溶液F(k)室温保温30分钟(l)通过将试验中得到的颜色与试剂盒中提供的比色图表进行比较，从而目测评分(m)如果反应中所得黄色浅于比色图表中的色度，则认为唾液中的乙酰胆碱酯酶水平较低，该受试者应被选出，以便接受更为全面的检查。
唾液样品中乙酰胆碱酯酶水平较低表明，受试者可能有氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起的中毒。该受试者可能要去医院接受更具有确诊意义的检查，确定已经发生的中毒的程度。
为了确保试剂盒正常工作，可以在试剂盒中包括插页形式或标签形式的说明书，其中包括所使用的成分的量，以及指导如何将试剂混合的说明。
本发明以上述实施方案的形式进行了描述，但本领域技术人员应能认识到，在不背离本发明精神的前提下，可以进行各种修改，替换，删除，和改变。相应地，本发明的范围由以下权利要求，包括它们的等价形式加以限定。
参考文献本说明书引用了以下公开文献，它们都引入本文作为参考1.Ammon，R.(1933).Die fermentative Spaltung des Acetylcholine.Pflugers Archive Ges Physiology 233286-291.
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权利要求
1.一种分析唾液样品中的乙酰胆碱酯酶的方法，该方法包括(a)从受试者获取唾液样品；(b)将该样品与碘化乙酰胆碱的丙酮缓冲溶液混合；(c)向步骤(b)所得溶液中加入5，5-二硫基二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；(d)将步骤(c)所述物质在室温保温30分钟；(e)目测评分由DTNB生成的颜色的强度；和(f)将步骤(e)所得颜色与比色图表进行比较。
2.权利要求1的方法，其中由DTNB生成的颜色的强度用分光光度计在410nm处评定。
3.权利要求1的方法的用途，用于检测受试者由氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起的中毒，该方法包括(a)从受试者获取唾液样品；(b)将该样品与碘化乙酰胆碱的丙酮缓冲溶液混合；(c)向步骤(b)所得溶液中加入5，5-二硫基二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；(d)将步骤(c)所述物质在室温保温30分钟；(e)目测评分由DTNB生成的颜色的强度；和(f)将步骤(e)所得颜色与比色图表进行比较。
4.权利要求3的用途，其中由DTNB生成的颜色的强度用分光光度计在410nm处评定。
5.用于通过权利要求1的方法分析唾液样品中乙酰胆碱酯酶的试剂盒，所述试剂盒包含以下成分瓶A磷酸钾缓冲液10ml瓶B丙酮1ml瓶C碘化乙酰胆碱7.5mg瓶D磷酸钾缓冲液9ml瓶E磷酸钾缓冲液10ml瓶FDTNB 1.3mg其特征在于，所用的检测试剂盒如下(a)瓶A是匀浆缓冲液(b)将B倾入C中并通过混合而彻底溶解C(c)将D倾入C并充分混合(d)将E倾入F并充分混合使物质溶解(e)工作溶液是溶液A，C和F(f)通过吐至洁净纸杯中的方式来采集新鲜唾液(g)将50μl唾液加入eppendorf试管中，向其上层添加溶液A，将体积补足0.5ml(h)用pasteur移液管在微量滴定板的每一孔中滴入一滴步骤(g)的唾液(8-10份重复)(i)在前2孔中滴入一滴溶液C(j)在这两孔中滴入一滴溶液F(k)室温保温30分钟(1)通过将试验中得到的颜色与比色图表进行比较，从而目测评分。
6.权利要求5的试剂盒的用途，用于检测受试者由氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起的中毒。
全文摘要
本发明提供了分析唾液样品中乙酰胆碱酯酶的方法。本发明的方法可以用于检测患者由氨基甲酸酯类杀虫剂或基于有机磷的农业化学品引起的中毒。本发明还提供了应用本发明方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/46GK1508262SQ20031012066
公开日2004年6月30日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者李汉林, 纳兹尼·W·阿迈德, 阿普杜拉·A·加尼, W 阿迈德, 拉 A 加尼 申请人:医学研究院