专利名称：离子液体溶胶－凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法。
背景技术：
溶胶-凝胶包埋法是迄今应用最普遍的固定化酶的方法，利用这种方法可在低温下对有机硅烷化物水解、聚合形成网络状的膜，制得的含酶凝胶膜具有物理刚性，化学惰性和可忽略的溶涨性等优点。目前已报道的溶胶-凝胶膜固定酶的生物传感器主要集中在凝胶/聚合物的体系。B.A.Gregg，A.Heller，在J.Phys.Chem.，1991，95，5976中公开了一种电极表面用长链双环交联聚4-乙烯基吡啶并同时固定化酶的方法，所得酶凝胶能牢固固定于电极表面并有较快的响应，但是在聚合物的交联过程中会造成酶的失活。在Analysis 1992，20，543中，Lev公开了一种以表面活性剂搀杂到溶胶中制备了一种无开裂的溶胶-凝胶膜。但是表面活性剂会破坏膜中酶的活性进而影响生物传感器的性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法。
本发明选用了一种新型固定化酶载体-离子液体溶胶-凝胶。由于1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼是一种粘稠的导电性离子液体，具有超分子结构，它成功的避免了传统溶胶-凝胶载体容易干裂、溶涨的缺点；同时由于离子液体良好的生物相容性及模板作用，固定化酶具有良好的生物活性而且使得其与被检测物的接触更容易。
本发明离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的制备方法，其主要步骤为a)将1-2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2-4毫升四乙氧基硅，1-2毫升水和0.05-0.1毫升0.1mol L-1的盐酸在室温下混合，磁力搅拌3小时，室温下放置1-2小时，得到溶胶A；b)将1-3毫克的酶，加入50微升0.05mol L-1的pH＝6-7的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；c)将溶胶A和溶液B按照体积比1∶1-2.5混合均匀，涂覆到电极表面，于0-4℃下放置24-48小时，得生物传感器。
上述步骤c中涂覆电极之前也可以先在电极表面滴涂10微升浓度为7.5-15毫克/毫升的二茂铁乙醇溶液，放置至干后再滴涂混合液。
所述酶是辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和/或多酚氧化酶。
本发明采用的电极为本领域公知的基底电极。
本发明制备的生物传感器响应快，使用寿命长，适合于检测各种酶底物。
具体实施例方式
实施例1 制备辣根过氧化物酶传感器先在基底电极表面先滴加10微升7.5毫克/毫升的二茂铁的乙醇溶液，放置10分钟；再将1毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2毫升四乙氧基硅，1毫升水和0.05毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置1小时；另将1毫克的辣根过氧化物酶加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶1的比例混合均匀，用微量注射器移取该混合液10微升滴涂到上述基底电极表面，然后再在4℃下放置24小时，即制得辣根过氧化物酶传感器，可用于水相中检测过氧化氢。该生物传感器平衡时间在5分钟以内；相应时间为15秒；线形范围为2×10-5-2×10-4mol L-1；检测限为1×10-6mol L-1；稳定性，2个月以上。
实施例2 制备葡萄糖氧化酶传感器2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，4毫升四乙氧基硅，2毫升水和0.1毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置2小时；另将3毫克的葡萄糖氧化酶，加入50微升0.05mol L-1的pH6的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶2.5的比例混合均匀，用微量注射器移取该混合液5微升滴涂到基底电极表面，然后再在0℃下放置36小时，即制得葡萄糖氧化酶传感器，可用于水相中检测葡萄糖。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；响应时间为15秒；稳定性，2个月以上。
实施例3 制备多酚氧化酶传感器将1.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，3毫升四乙氧基硅，1.5毫升水和0.075毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置1.5小时；另将1毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶中的一种，加入50微升0.05mol L-1的pH7的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶2的比例混合均匀，用微量注射器移取该混合液10微升滴涂到基底电极表面，然后再在4℃下放置24小时，即制得多酚氧化酶生物传感器，可用于水相中测定苯酚，儿茶酚等物质。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；响应时间为15秒；稳定性，1个月以上。
实施例4 制备葡萄糖氧化酶传感器先在基底电极表面先滴涂15微升15毫克/毫升的二茂铁的乙醇溶液，放置10分钟；再将2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，4毫升四乙氧基硅，2毫升水和0.1毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置1小时；另将2毫克的葡萄糖氧化酶，加入50微升0.05mol L-1的pH6的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶2.5的比例混合均匀，用微量注射器移取溶胶A和溶液B的混合液5微升滴涂到基底电极表面，然后于4℃下放置48小时，即制得葡萄糖氧化酶传感器，可用于水相中检测葡萄糖。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；响应时间为14秒；稳定性，1个月以上。
实施例5 制备辣根过氧化物酶传感器先在基底电极表面先滴涂15微升10毫克/毫升的二茂铁的乙醇溶液，放置至干燥；再将1.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2毫升四乙氧基硅，1毫升水和0.05毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置1小时；另将1.2毫克的辣根过氧化物酶加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶1.5的比例混合均匀，用微量注射器移取该混合液10微升滴涂到上述基底电极表面，然后再在4℃下放置48小时，即制得辣根过氧化物酶传感器，可用于水相中检测过氧化氢。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；相应时间为15秒；稳定性，2个月以上。
实施例6 制备多酚氧化酶传感器先在基底电极表面先滴涂7.5微升12毫克/毫升的二茂铁的乙醇溶液，放置至干燥；将1.5毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，3毫升四乙氧基硅，1.5毫升水和0.075毫升0.1mol L-1的盐酸于室温下混合，磁力搅拌3小时，即得到均相溶胶A，然后室温下放置1.5小时；另将1毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶中的一种，加入50微升0.05mol L-1的pH6.86的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；然后将溶胶A和溶液B按照1∶1.5的比例混合均匀，用微量注射器移取该混合液10微升滴涂到基底电极表面，然后再在4℃下放置30小时，即制得多酚氧化酶生物传感器，可用于水相中测定苯酚，儿茶酚等物质。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；响应时间为16秒；稳定性，1个月以上。
权利要求
1.一种离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法，其主要步骤为a)将1-2毫升1-丁基，3-甲基咪唑四氟化硼，2-4毫升四乙氧基硅，1-2毫升水和0.05-0.1毫升0.1mol L-1的盐酸在室温下混合，磁力搅拌3小时，室温下放置1-2小时，得到溶胶A；b)将1-3毫克的酶，加入50微升0.05mol L-1的pH＝6-7的磷酸缓冲溶液中混合均匀得溶液B；c)将溶胶A和溶液B按照体积比1∶1-2.5混合均匀，涂覆到电极表面，于0-4℃下放置24-48小时，得生物传感器。
2.如权利要求1所述的离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法，其特征在于，步骤c中涂覆电极之前先在电极表面涂覆10微升二茂铁乙醇溶液，放置至干后再滴涂混合液。
3.如权利要求1所述的离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法，其特征在于，所述二茂铁乙醇溶液浓度为7.5-15毫克/毫升。
4.如权利要求1所述的离子液体溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或多酚氧化酶。
全文摘要
一种离子液体溶胶－凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法，其主要步骤为将1－2毫升1－丁基，3－甲基咪唑四氟化硼，2－4毫升四乙氧基硅，1－2毫升水和0.05－0.1毫升0.1mol L
文档编号C12Q1/26GK1661043SQ200410011340
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者刘洋, 王美佳, 李迪, 李景虹 申请人:中国科学院长春应用化学研究所