专利名称：神经细胞提取物及其在间充质干细胞诱导分化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞提取物及应用技术，具体涉及人或动物神经细胞提取物及其在间充质干细胞诱导分化为神经细胞中的应用技术。
背景技术：
1997年以来，干细胞研究取得重要进展，研究发现人体间充质干细胞(MSC)可以被诱导分化为神经、肌肉、皮肤、软骨、脂肪、肌腱、肝脏、血液及组织类型的成熟细胞，扩增诱导后移植到体内和相应组织细胞良好整合，发挥特定的生物学功能，可以用来移植治疗多种疾病。上述研究结果提示，MSC扩增诱导分化而得的神经样细胞可以用来移植治疗老年性痴呆、帕金森、脑萎缩、外周神经损伤等神经系统疾病。目前这类疾病在临床上没有理想的治疗措施，干细胞和诱导分化后的神经样细胞移植将成为上述疾病治疗的最佳选择。
目前，人工提取的神经细胞提取物为小分子提取物，主要从腮腺等组织中提取，以注射方式应用于治疗神经性损伤方面。
近年来，对诱导MSC分化为神经细胞所用诱导试剂有了较多的研究，MSC可以在β-巯基乙醇，二甲基亚砜及维甲酸等抗氧化剂的诱导下分化为神经细胞，中国微侵袭神经外科杂志2004，9(2)实验研究报道“人骨髓间充质干细胞的体外培养及向神经细胞分化研究”结论阿魏酸钠具有诱导体外培养的人MSC向神经细胞分化的作用。现有技术研究方法及诱导试剂各不相同，应用效果不稳定，且未形成标准。
相关名词注释(1)于细胞是各种成熟细胞的起源细胞，根据来源及分化潜能的不同，分为胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES)和成体干细胞(dult stem cells，ASCs)两类。有潜在的扩增及诱导分化性能。
(2)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs简写为MSC)是目前研究较多的ASCs广泛存在于成人多种组织中，而且具有多向分化潜能，可以在体内外被诱导分化为多种类型、不同功能的成熟细胞。在体外能达到50次以上倍增而保持其多向分化的潜能性。
(3)DMEM与F12培养基细胞培养通用基础培养基。
(4)卵细胞提取物从人或动物卵细胞中提取，分子量大小正常不等的复杂混合物，含有多种促进、调控及诱导细胞生长分化因子。该项技术的技术方案记载在专利申请号为200410033182.9的专利申请中。
(5)神经细胞提取物，从人或动物神经细胞组织中提取的，分子量大小不等的复杂混合物，含有多种特异性促进、调控及诱导向神经细胞生长分化因子。
(6)干细胞诱导分化用天然化合物或细胞因子及等与干细胞在特定温度、湿度和二氧化碳条件下共同培养一定时间后，干细胞分化为成熟细胞。不同诱导因子和条件诱导后所得成熟细胞类型不同。
发明内容
本发明提供一种取材于人或动物体内神经细胞组织，经人工提取的、使分子量小于20万道尔顿(Da)的神经细胞提取物；本发明还提供该神经细胞提取物在体外MSC诱导分化为神经细胞中作为诱导剂的应用技术，本发明的神经细胞提取物在MSC诱导分化为神经细胞的应用中，显示出良好的诱导分化率，且效果好，重复性及稳定性好。
发明技术方案如下人或动物神经细胞提取物，主要包括以下方法提取神经细胞组织取材，如坐骨神经组织或脑组织，去除红细胞、被膜及结缔组织等非需要成份→细胞匀浆→细胞破碎→沉淀或过滤，取上清液→分离去除大于20万道尔顿(Da)以上分子量的物质→蛋白浓度测定，活性测定，除菌，冻存或制备成试剂分装。
具体方法为(1)取人或动物神经细胞组织，去除内存红细胞及被膜、结缔组织，剪碎备用；(2)在4℃以下，匀浆3-5次；(3)将匀浆液行细胞破碎至细胞完全破碎；(4)在1-4℃条件下，去处沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；(5)获得的上清液，截留分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的大分子物质，使获得的过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量小于20万道尔顿(Da)；(6)获得的过滤液蛋白含量测定，活性测定，除菌，冻存或无菌分装，此为本发明的神经细胞提取物。
步骤(1)的神经细胞组织剪碎后进行匀浆，也可以加入1-4倍生理盐水稀释后再匀浆；步骤(3)细胞破碎可以用化学或物理的方法，优选冻融，是置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于隔水42℃的条件下彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；步骤(5)的截留分离方法可以是高速离心、电泳、过滤膜过滤等方法，优选过滤膜在正压或负压条件下过滤截留，其目的是将大分子物质分离出来，保留分子量小于20万道尔顿(Da)的成份。过滤膜的选用要求能截留下分子量大于20万道尔顿(Da)的大分子物质。本发明的神经细胞提取物滤液用常规方法制成试剂，可粉剂或水剂。制成水剂时，蛋白质浓度大于4毫克/毫升为好，若水剂中蛋白浓度过低，在应用时为了满足蛋白浓度，相应的水容积增大，导致一定体积的培养液内的其它成份用量减少，不能满足培养液配比要求。不论是粉剂或水剂，应用时，根据活性单位要求取量即可。试剂应按生物制剂保存办法低温保存。
所述的人或动物神经细胞组织是直接从人或动物体取得的，动物又以哺乳动物为好。
本发明的神经细胞提取物的生产过程，最好在上述低温条件下进行，以减少活性损失，防止污染。细胞破碎应完全，可采用化学或物理方法，超声波等技术，冻融过程需反复进行至细胞完全破碎。蛋白质含量可因盐水加入的多少而变化，提取液中蛋白质浓度最好为1毫克以上/毫升，保证其它有效成份得以充分提取，制备成试剂时，可再浓缩或稀释到要求浓度，活性界定是在应用中以100毫升培养液含神经细胞提取物以蛋白质浓度表示，含蛋白质1毫克以上即表现有活性，为有效活性范围。冻存可以是-20℃，能较好地保持提取物的活性，积量后制备试剂。除菌方法以过滤法为好。
本发明所述的神经细胞提取物在MSC诱导分化中的应用，是将本发明的神经细胞提取物、基础培养基及条件培养液等与MSC共同培养，诱导其分化为神经样细胞，其应用可以是本发明的神经细胞提取物结合现有技术的应用，也可以是本发明的神经细胞提取物与其它试剂如基础培养基等共同制备成干细胞诱导分化试剂盒的应用。所述试剂盒的应用可以是主要由基础培养基和卵细胞提取物和/或神经细胞提取物制备的试剂盒中的应用。所述基础培养基以选自DMEM与F12的混合培养基为好。
应用有效量即活性条件以培养液总体积中含神经细胞提取物以蛋白质浓度表示，显示为蛋白质1％(毫克/毫升)以上即表现有活性，为有效活性范围，在1％-100％为更有效活性范围。在此活性范围内，诱导分化率达到60％以上。
经多次反复的实验，以人MSC为例，扩增培养15天，传代四次，将扩增后的MSC诱导分化为神经细胞，再培养15天，传代四次，诱导分化为神经细胞的诱导分化率达到本发明的应用效果，且重复性和稳定性好。诱导细胞鉴定结果形态学、神经细胞特异性抗原标志鉴定及神经递质分析等均符合神经细胞特征。
本发明的神经细胞提取物在MSC诱导分化为神经细胞的应用中，显示出良好的诱导分化率，在60％以上，适宜的应用，诱导分化率可达到95％以上。
所述人或动物神经细胞提取物所含成份及其含量目前尚未完全清楚，已有报导证实，神经细胞浆中含有潜在调节细胞生长与分化的因子，还含有丰富的蛋白质及相关因子，与其它培养基及相关因素共同为MSC诱导分化提供了理想的综合营养环境，表现为维持MSC生长的同时，诱导其向神经细胞分化。
现结合实施例对本发明作进一步阐述实施例1，神经细胞提取物的制备(1)取人或动物坐骨神经细胞组织，立即通过动脉和静脉灌生理盐水，最大限度地去除血管内存留的红细胞，剃出被膜、结缔组织、血管等非需要成份，剪碎，加入等量生理盐水备用；(2)组织匀浆或捣碎机在4℃条件下，1-3万转/分钟匀浆3-5次，每次1分钟；应注意匀浆机不宜过热，否则部分组织液失去活性；(3)将匀浆液置于-20℃冰箱冻存至完全冻结，一般24小时以上，然后在不高于42℃的条件下隔水彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；(4)在1-4℃的条件下自然沉降2-10小时，吸取上清液，用3-4层无菌纱布过滤，去处沉渣和蛋白絮状物，在4℃条件下，400-600g离心30分钟，取上清液；(5)用过滤膜在正压或负压条件下过滤获得的上清液，截留分子量大于20万道尔顿(Da)以上的大分子物质，使过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量小于20万道尔顿(Da)；(6)测定蛋白浓度为20毫克/毫升，应用活性测定符合，过滤法除菌，用无菌生理盐水稀释成蛋白浓度为10毫克/毫升，无菌分装，为水剂试剂。
实施例2，MSC诱导分化为神经细胞的应用试剂盒的应用，卵细胞提取物水剂，含蛋白10毫克/毫升，上述神经细胞提取物水剂含蛋白10毫克/毫升，制备每100毫升试剂盒，各组份独立包装用量(1)DMEM与F12混合培养基 80毫升(2)人体卵细胞提取物水剂 10毫升(3)神经细胞提取物水剂 10毫升试剂盒中可以有常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。
诱导培养方法1、间充质干细胞分离、纯化按常规方法从骨髓、脂肪等组织中分离获得单个核细胞，先进行细胞原代贴壁培养后用间充质干细胞的表面特异标志抗原进行正、负免疫筛选，获得纯间充质干细胞。若细胞数量足够，也可直接用分离获得的单个核细胞进行分离纯化。依据实验目的和细胞数量，先进行细胞扩增培养到所需数量或直接用本试剂进行诱导。
2、间充质干细胞贴壁培养将间充质干细胞用基础培养基稀释为1×105细胞/ml，按×104细胞/cm2密度接种到培养瓶(皿)中，按间充质干细胞体外扩增方法进行体外培养至细胞长满瓶壁，2/3以上细胞融合后进行诱导培养。间充质干细胞判定标准形态梭形，呈火焰状有规则排列生长。表面分子标志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。
3、诱导培养移出贴壁培养细胞后的培养液，用生理盐水洗1-2次，将上述量的细胞进行诱导，需试剂盒培养液总体积为10ML，设定活性蛋白质含量分别为50％，则取DMEM/F12培养基9ml，卵细胞提取物0.5毫升，神经细胞提取物0.5毫升，此10ML培养液中含两种细胞提取物蛋白质各5mg，活性蛋白质浓度分别为50％。将试剂盒培养液与细胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养，连续观察细胞生长状况。
4、诱导细胞鉴定(1)形态诱导前细胞呈长梭形，火焰状生长，有规则排列，细胞核大，胞浆成份相对少。培养3天左右，细胞逐渐变圆，然后伸出突起，形成多突起神经细胞样细胞。
(2)神经元细胞特异性抗原标志鉴定采用免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定。结果为神经元的特异标志物神经元特异性烯醇酶(NSE)、神经特异性核蛋白(NeuN)、中间神经丝(NFOm)、tau蛋白和一些微管蛋白(tubulin-β、MAP-2、TuJ-1)呈阳性反应。
(3)神经递质分析采用气/质谱分析，培养上清液中有多巴胺等神经递质产生。
(4)诱导率90％以上。
经多个实施例，培养液中分别取神经细胞提取物不同蛋白浓度如5％、10％、20％、35％、50％、75％、100％及150％作诱导培养，均获得较满意的效果，显示出良好的重复性和稳定性。本发明的技术方案不受实施例的限制。
权利要求
1.神经细胞提取物，主要包括以下方法制取(1)取人或动物神经细胞组织，去除红细胞、被膜及结缔组织，剪碎备用；(2)细胞匀浆；(3)将匀浆液行细胞破碎至细胞完全破碎；(4)沉淀或过滤，取上清液；(5)分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的物质；(6)蛋白浓度测定，活性测定，除菌，冻存或制备试剂无菌分装，此为本发明的神经细胞提取物。
2.根据权利要求1所述的神经细胞提取物，其特征在于，主要包括以下方法制取(1)取人或动物神经细胞组织，去除内存红细胞及被膜及结缔组织，剪碎备用；(2)在4℃以下，匀浆3-5次；(3)细胞破碎方法是冻融，将匀浆液置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于隔水42℃条件下彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，细胞完全破碎；(4)在1-4℃条件下，去除沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；(5)获得的上清液，分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的大分子物质，使获得的过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量小于20万道尔顿(Da)；(6)获得的过滤液蛋白含量测定，蛋白质浓度为1毫克以上/每毫升滤液，活性测定，除菌，冻存或制备试剂无菌分装。
3.根据权利要求1或2所述的神经细胞提取物，其特征在于，步骤(1)的神经细胞组织中加入1-4倍生理盐水稀释再匀浆。
4.根据权利要求1或2所述的神经细胞提取物，其特征在于，步骤(5)的分离方法是用过滤膜在正压或负压条件下过滤。
5.根据权利要求3所述的神经细胞提取物，其特征在于，步骤(5)的分离方法是用过滤膜在正压或负压条件下过滤。
6.根据权利要求1、2或5所述的神经细胞提取物，其特征在于，所述动物是哺乳动物。
7.权利要求1的神经细胞提取物在间充质干细胞诱导分化中的应用，是体外间充质干细胞诱导分化为神经细胞的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是在制备试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的应用是基础培养基选自DMEM与F12的混合培养基的试剂盒的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的应用是基础培养基和卵细胞提取物和/或神经细胞提取物制备的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及人或动物神经细胞提取物及其在体外间充质干细胞诱导分化为神经细胞中的应用，为间充质干细胞诱导技术提供了新的诱导试剂，是神经细胞组织→去除血细胞结缔组织及被膜等→细胞匀浆→细胞破碎→沉淀→取上清液→分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的物质→分装而得，本发明所述的应用可以是神经细胞提取物与现有技术有机结合的应用，也可以是制备为试剂盒的应用。在间充质干细胞诱导分化为神经细胞的应用中显示出良好的诱导分化率为90％以上。诱导分化的神经细胞可以用来移植治疗多种神经性疾病，在临床有很好的应用前景。
文档编号C12N5/06GK1570088SQ200410044418
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月10日 优先权日2004年5月10日
发明者潘兴华, 庞荣清, 李俊, 陆家海 申请人:成都军区昆明总医院, 潘兴华