对大肠杆菌o174型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法

专利名称：对大肠杆菌o174型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌O174型(Escherichia coli O174)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O174型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O174型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术：
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and Shigella Oantigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]发明内容本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1、orf4、orf5基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O174型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O174型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O174型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O174型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O174型。
本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长5668个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为orf1，wzx，wzy，orf4，orf5的5个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf1、orf4、orf5基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的805至2076碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的2057至3196碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5基因以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O174型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O174型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O174型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O174，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O174的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O174型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O174型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的jumpstart序列设计上游引物(wl-10985-ATTGGTAGCTGTAAGCCAAGGGCGGTAGCGT-3)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(wl-22115-CACTGCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG-3)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O174型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O174型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到5个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对痢大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O174组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O174的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O174的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长5668个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为orf1，wzx，wzy，orf4，orf5，的5个基因组成，都位于jumpstart序列和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O174型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原都是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ IDNO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O174型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O174型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O174型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O174型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O174型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O174型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O174型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2通过PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O174型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的jumpstart序列设计上游引物(wl-1098，5-ATTGGTAGCTGTAAGCCAAGGGCGGTAGCGT-3)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(wl-2211，5-CACTGCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG-3)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3构建O-抗原基因簇文库首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇文库。
实施例4对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O174型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O174型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到5个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf3和orf2是大肠杆菌O174中仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf2编码的蛋白与Yersinia enterocolitica的O-抗原转移酶有27％的序列一致性，49％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf2为wzx。orf3编码的蛋白与Bacillus cereus ATCC10987的O-抗原聚合酶有24％的一致性，46％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf3为wzy。
orf1、orf4，orf5三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有25-38％的序列一致性和50-57％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这三个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值很高，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O174的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这三个基因暂命名为orf1、orf4，orf5。
实施例6特异基因的筛选。
针对大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O174组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
实施例7引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O174的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O174的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本发明O174的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
当分子探针核苷酸序列与靶DNA序列同源性大于85％时，可以准确的将目的序列杂交出来。在低严谨性的Southern杂交中要求两者的同源性大于65％(《分子克隆实验指南》第三版，第509页，低严谨性杂交)。本发明中的特异核苷酸序列在Genebank中的同源性搜索显示没有同源性大于65％的其他基因存在。所以在杂交实验中，本发明中的特异核苷酸序列作为分子探针将只能对目的细菌得出阳性结果。Southern杂交法对于分子探针的长度并没有严格要求，本发明中的特异核苷酸序列中从20bp或以上的寡核苷酸到整个序列都可以在杂交中应用。在一项Southern实验中，利用沙门氏菌的相关特异基因(1000bp以上)做分子探针，成功的分辨出该细菌(Liu D，Verma NK，RomanaLK，Reeves PR.，1991 Relationships among the rfb regions of Salmonellaserovars A，B，and D.J Bacteriol.173(15)4814-4819.)，很多本领域的实验都表明1000-2000bp左右的基因序列可以用做分子探针。基因芯片与Southern杂交法的原理一样，在选用分子探针的要求上也相似，所以本发明中的特异核苷酸序列以及其中的寡核苷酸片段都可以在杂交反应中作为分子探针检测该目的细菌，包括Southern、基因芯片等多种杂交的常规方法。
根据本发明的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。
表1列出了大肠杆菌O174型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O174型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O174型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第12组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O174型中筛选到对大肠杆菌O174型的O-抗原高度特异的基因三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O174型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O174型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O174型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构，共由5个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是jumpstart序列和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>天津生物芯片技术有限责任公司<120>对大肠杆菌O174型的O抗原特异的核苷酸<130>对大肠杆菌O174型的O抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>5668<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1ccttttgcat tggtagctgt aagccaaggg cggtagcgta aacatttgag aggaattaat60gagtacagtt acactcgtta taactagttg cggtagattt gaattattag aaaaaacaat 120atcttctctt gtaaataggt acccatttac agagaagatc ataattgagg attctggtaa 180tgtaaaagtt ataaacaaaa taaaagaaaa atatgatagg gattttacaa tcttaataaa 240tgaaaaaaac attggacaaa ttaaaagcat cgataaggca tatagtttag tcactaccga 300atatatattc cattgtgaag atgattggca tttctataga gacggattca tagaagattc 360attagatata ttgaaagagt atagacacat ttcaatggta tcacttagag attggctaaa 420tgatgtatcg atcaattgtc atatggaaag atccacgctc ttacaaacgg gaaatggaac 480aagatttttc atgttaaaac ccaaaaatgg tgatggctgg ggagggtatt cgttcaaccc 540
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*只在大肠杆菌O174型中得到正确的一条带表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号该组中含有的菌株 来源1、野生型大肠杆菌O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20， IMVSaO21，O22，O23，O24，O59，O3，O112、野生型大肠杆菌O25，O26，O27，O28，O174，O30，O32，O31，O33，O35，O36，O37， IMVSaO38，O40，O41，O42，O43，O39，O593、野生型大肠杆菌O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O64，O734、野生型大肠杆菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O96，O955、野生型大肠杆菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，IMVSaO102，O103，O104，O105，O106，O100，O1516、野生型大肠杆菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O1287、野生型大肠杆菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSaO138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O1458、野生型大肠杆菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166 b9、野生型大肠杆菌O168，O169，O170，O171，O172，O173，O155，O124 eD1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12 d10、野生型大肠杆菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、野生型大肠杆菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v4)，F5(v7)，F6，FX变，FY变，DS，DR， d12、第9组菌株加上大肠杆菌标准菌株O174IMVS*为了检测的方便，我们将每13-19个菌分为一组，总共12组a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVSd.中国预防医学科学院流行病学研究所表3大肠杆菌O174型O抗原基因结构图
orf1 orf4orf5G+C％ 30.9 26.826.9 28.334.1 O174 O antigen gene cluster表4大肠杆菌O174型O抗原基因簇基因位置orf1的起始CCTTTTGCAT TGGTAGCTGT AAGCCAAGGG CGGTAGCGTA AACATTTGAG AGGAATTAAT60GAGTACAGTT ACACTCGTTA TAACTAGTTG CGGTAGATTT GAATTATTAG AAAAAACAAT 120ATCTTCTCTT GTAAATAGGT ACCCATTTAC AGAGAAGATC ATAATTGAGG ATTCTGGTAA 180TGTAAAAGTT ATAAACAAAA TAAAAGAAAA ATATGATAGG GATTTTACAA TCTTAATAAA 240TGAAAAAAAC ATTGGACAAA TTAAAAGCAT CGATAAGGCA TATAGTTTAG TCACTACCGA 300ATATATATTC CATTGTGAAG ATGATTGGCA TTTCTATAGA GACGGATTCA TAGAAGATTC 360ATTAGATATA TTGAAAGAGT ATAGACACAT TTCAATGGTA TCACTTAGAG ATTGGCTAAA 420TGATGTATCG ATCAATTGTC ATATGGAAAG ATCCACGCTC TTACAAACGG GAAATGGAAC 480AAGATTTTTC ATGTTAAAAC CCAAAAATGG TGATGGCTGG GGAGGGTATT CGTTCAACCC 540GGGGCTGAGA CGACTTCAAG ATTATAAAGA AATAATCGGA CAATTTTCAA AAGTAGGGCA 600TGAAAAAAAT ATAAGTTTAT ATTTTTTAGA AAAAGGAATG AATATGGCGC TATTAGAATC 660TTCAGCTGTT GAGCACATAG GTTGGAATCA CCATATATTG AGTAAAAATA ATCCTCAAGA 720AAGATTTTAT TTGCTTAAAA AATATTTACC AAAGGAAGTA ACTAATGTGC TCAAGATAAT 780orf1的终止wzx的起始TTATAGAAAA ATTGCTGGGT GATTATGAAA TATCTTTTTA TTTGGTCTCT TACTCCCAAA 840TTATATGAAT TAAGCCTTAA TCTTTCTATC GGGATAGCTC TTATAAATTA TCTAGGACCT 900GTAGAACAAG GTAAAATAGG TTTTTTAATT AATTTATGCA CATTAATGAG TTTTCTTACC 960ACGCTTGGAA TTGGGCCTGT ATATTCTAAT TTTGTTAGTC GTTCAAATAA TGAAAGATTA 1020ATATCCAATA AATTTAAGGA GAATGTTACA TTAAGGTTTT TAGGTTATAT TTTGTTTCTT 1080CTGGTTTCAC TTTTATTTCT ATTCTTCTTT AAAAGGGGGT TGATATATTT ATCAATACCA 1140TTTTTAATAG GGAAATTATT TTTCAGTTTT GATATATATT ATAACCTCAT TGAAGGTAAG 1200GCTGGATTTA AAAATTATGC AATTTCAAAA TTTATATCTT TGACATGTAT AAATGTATTT 1260CGGTTATATT GTATATATGC ACAATTAGAT ATATATTGGG TTGCGTTTTC ATTCTTTTTG 1320ACTGATTTCT TGACATTTTT TGTGTATTTT TTGTTATTTG ACAAATTTAA GTATTTCGGT 1380TTTAAATTTG ATTACAAAAA ATCATTAATT ATATTTAAGA TAAACTATAA GTTAGCATTA 1440TCTACAATAG TTGTAAGTCT CTTTACTCAG CTGGATATAG TAATGATCGG AACTATGCTT 1500GGAGATAAAG CTGCAGGTGA GTATTATGCA TCAACTAGAC TCGCTACTCC TTTAGTTTTT 1560ATATCAACAA TTATTATAAG CACTTTTTTT TCAAAACTTT CTAGAAACTG GGTTGTTAAT 1620AAAAAAGAAT ATTATGAACT TTTAGCTTTC ATTAGTGGAA GTATAATTTT TTCGTATTCA 1680GCAATTGTAC TCATTATTTT TATATTTGGA AACGATATAT TTTTCTTGTT TTTCAGTTCA 1740GAATATAAAG CCTCTTATGA TTTATTCTTA ATCCATATTG TAGGTTTGAT TTTTGTACTT 1800TTAGGCCCGC TTACTGGGAA GCATTTAATA ATTAAAAAAG ATTATGGGGC AGAACTTAGC 1860AAAACCTTAT TGGCAGCAAT TGTTAATATA GCCTTAACTT CCATTGCAGT GTTAAAATAT 1920GAAAATCTTA ACTTAGTGGC CGTTAGTACA TTAATAAGTT ATATGATTGC TAATTTTGGT 1980TACTTTATAG TAAAAAAAGA TTGGCTATTA ATCAAAGCTA TATTGAATGG TGTTAATCCC 2040wzy起始 wzx的终止
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以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长5668个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于其包括命名为orf1、wzx、wzy、orf4、orf5的5个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因是转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf1、orf4、orf5基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的805至2076碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的2057至3196碱基的核苷酸；
4.按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5基因以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
7.权利要求1所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O174型的O-抗原以及制备细菌疫苗中的应用。
8.按照权利要求1所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
9.权利要求1所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O174型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O174型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O174，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O174的灵敏度。
10.根据权利要求9所述的对大肠杆菌O174型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O174型，离心收集细胞；用pH值为8.0的500ul 50mM Tris-HCl和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1；上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O174型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O174型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的Jumpstart序列设计上游引物为wl-10985-ATTGGTAGCTGTAAGCCAAGGGCGGTAGCGT-3，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物为wl-22115-CACTGCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG-3；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇的混合溶液抽提一次，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾；此混合物经等体积氯仿∶异戊醇的混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul，氯仿∶异戊醇的混合体积比例为24∶1；其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的pH值为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O174型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O174型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orffinder发现基因，找到5个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对痢大肠杆菌O174型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O174组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O174型的O-抗原都是高度特异的。(7)引物灵敏度的检测购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用；将10μl大肠杆菌O174的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的891至908碱基的核苷酸和1529至1546碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1479至1498碱基的核苷酸和1861至1878碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2421至2439碱基的核苷酸和3160至3179碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2512至2529碱基的核苷酸和2944至2961碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在3对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O174的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
全文摘要
本发明提供一种对大肠杆菌O174型(Escherichiacoli O174)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O174型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长5668个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O174型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O174型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定大肠杆菌O174型的方法。
文档编号C12N15/31GK1660876SQ20041009411
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者王磊, 孔庆科, 冯露 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司