微生物数测定方法及微生物实验用培养基的制作方法

专利名称：微生物数测定方法及微生物实验用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物数测定方法及供该测定方法的微生物实验用培养基。
背景技术：
为了实现例如食品的卫生管理，要求测定食品中含有的微生物数。作为测定食品等检体中所含有的微生物数的方法，已知有氧电极法(DOX溶解氧电极法)(例如专利文献1、2)。通过氧电极法进行的微生物数的测定，按照以下步骤实施。
首先，将食品材料等检体添加到稀释液中(例如生理盐水等)，稀释至规定的浓度，从而调制检体液。此时，也可以进行所谓的消化(stomaching)处理，即将检体与稀释液一起粉碎、混合。这样，包含在检体中的微生物被萃取到检体液中。
将调制的检体液添加到规定的液体培养基中，并注入到测定用单元内。该测定用单元安装在测定装置上。
测定用单元在内侧具有氧电极。氧电极将液体培养基中的溶解氧浓度转换成电信号。测定装置测定由氧电极输出的电信号，并基于该电信号求出包含在液体培养基中的溶解氧浓度。该电信号通常采用氧电极输出的电流。并且，溶解氧浓度越高，该电流值越大。
液体培养基中的溶解氧浓度因微生物的代谢例如呼吸而发生变化。因而，来自氧电极的输出电流由于微生物的代谢而发生变化。
例如，图10中表示了采用细菌作为微生物针对不同液体培养基对应于测定时间的流失而测定的来自氧电极的输出电流的结果，所述液体培养基中添加有初期菌数105、104、103、102、101CFU/ml及“没有初期细菌”的检体液。测定开始时的电流值与初期细菌数没有关系，均相等。随着的时间的流失，由于液体培养基中细菌的代谢而消耗氧，电流值会降低。此时，电流值减少至接近零的规定阈值Ith或Ith以下所需的时间根据初期菌数而不同。即，初期菌数越多，所需时间越短。这是由于，液体培养基中的细菌数多，相应地氧的消耗量也多，从而溶解氧浓度会迅速地降低。
因此，对应于测定时间的流失测定氧电极输出的电流并求出输出电流减少至规定阈值Ith或Ith以下所需的时间，从而基于例如标准曲线，可以算出包含在液体培养基中的细菌等微生物的个体数。标准曲线由例如图10中所示的结果，即已知的初期菌数及与之对应的规定时间可以求出。
如上所述，对于氧电极法，初期菌数越多则可以越快地得到测定结果，即输出电流减少至规定阈值Ith或Ith以下所需的时间。具体来说，在初期菌数为105CFU/ml或其以上的情况测定的所需时间约为4小时或4小时以下。另一方面，例如对于以往的琼脂培养法，需要在培养基中进行12～48小时左右的细菌培养。因此，氧电极法是可以用非常短的时间进行微生物数测定的方法。
另外，琼脂培养法需要测定者以目视计数在培养基中生成的细菌的菌落数，但是氧电极法通过监控电信号就可以测定。因此，采用氧电极法容易实现测定的自动化、测定结果的数据基础化、测定系统的网络化。进而，氧电极法具有的优点还有通过测定自动化，可以排除测定结果因每个测定者的个人差异，不需要测定者学会专门的技术。
另外，与本发明相关的技术表示如下。
专利文献1特开2000-287699号公报专利文献2特开2001-252066号公报非专利文献青木智，《影响茶叶单离细胞的活性及稳定性的多酚吸附剂的效果》，茶叶技术研究，1980年，第58号，p.42-44发明内容测定微生物数时，检体中含有烯丙基硫或蒜素(包含在葱类中)这样的硫化物、儿茶素(包含在绿茶等中)这样的多酚等。另外，有时也含有乙酸、柠檬酸、抗坏血酸等。
硫化物会抑制作为微生物的细菌的增殖或者代谢。如果像这样的抑制细菌的增殖或者代谢的成分包含在检体中，则会影响细菌数的测定。这样的影响对于以往的琼脂培养法也是问题，但是特别是对于氧电极法等快速测定法的情况，其成为严重问题。其理由如下。
在琼脂培养法中，检体液和培养基以1∶20左右的比例混合。另一方面，在氧电极法等中，一般地检体液和培养基以1∶1左右的比例混合。因此，包含在氧电极法中使用的检体中的成分对测定的影响与琼脂培养法相比约为10倍左右。
并且，对于通过琼脂培养法的细菌数测定，细菌的培养至少需要24～48小时。因此，即使在检体液中含有抑制细菌的增殖或者代谢的成分，在培养过程中该成分由于挥发等而失活，对测定结果的影响小。另一方面，对于通过氧电极法的细菌数测定，细菌的培养时间(测定时间)比较短，因而多数情况是在该成分失活前测定就结束。从而，该成分对测定结果的影响大。
另外，对于通过氧电极法等快速测定法及琼脂培养法的细菌数测定的任意一种情况，如果检体中含有抑制细菌增殖或者代谢的成分，都会导致测定时间的长期化。特别是，对于通过氧电极法的细菌数测定，由于具有包含在培养基中的细菌数越多则可以越快地得到测定结果的特点，检体中含有抑制细菌增殖或者代谢的成分时，测定时间的长期化显著。
在通过氧电极法等快速测定法的细菌数测定中，硫化物会进一步降低来自电极的输出电流，从而影响测定。多酚也会降低该输出电流。
具体来说，对于氧电极法的情况，输出电流与测定开始时的培养基中的溶解氧量无关，自测定开始来自氧电极的输出电流就立刻开始降低。有时甚至直接达到阈值Ith。因而，针对含有硫化物、多酚等成分的检体通过氧电极法进行细菌数测定时，从测定开始时直到输出电流达到阈值Ith所需时间有时与初期菌数无关，并且该时间大致是一定的。对于这样的状况，由该所需时间算出液体培养基中的初期菌数是困难的。
本发明是为了解决上述的课题而进行的，其目的是，即使是检体中含有影响测定的成分的情况也可以减小该影响。
本发明的第1方案涉及的微生物数测定方法，其是测定包含在检体中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，向培养基中添加所述检体；步骤(b)，求出在所述步骤(a)中添加的所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有具有抑制所述微生物增殖或者代谢作用的成分，在实行所述步骤(b)时的所述培养基中含有吸附所述成分的吸附剂。
根据本发明的第1方案涉及的微生物数测定方法，由于具有抑制包含在检体中的微生物的增殖或者代谢作用的成分被吸附剂所吸附，因而该成分对步骤(b)的影响减小。具体来说，可以防止由于微生物的增殖或者代谢被抑制而使测定时间长期化，或者避免不能算出初期微生物数。
本发明的第2方案涉及的微生物数测定方法，其是第1方案所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流，从而求出所述微生物数。
根据本发明的第2方案涉及的微生物数测定方法，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第1方案涉及的微生物数测定方法。
本发明的第3方案涉及的微生物数测定方法，其是第1方案所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(a)中，所述检体被含有所述吸附剂的稀释液稀释后再添加到所述培养基中。
根据本发明的第3方案涉及的微生物数测定方法，由于抑制包含在检体中的微生物的增殖或者代谢的成分被稀释液中含有的吸附剂所吸附，因而可以避免抑制微生物的增殖或者代谢。
本发明的第4方案涉及的微生物数测定方法，其是第3方案所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流，从而求出所述微生物数。
根据本发明的第4方案涉及的微生物数测定方法，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第3方案涉及的微生物数测定方法。
本发明的第5方案涉及的微生物数测定方法，其是第1方案所述的微生物数测定方法，其中，在实行所述步骤(a)时的所述培养基中含有所述吸附剂。
根据本发明的第5方案涉及的微生物数测定方法，由于具有抑制包含在检体中的微生物的增殖或者代谢作用的成分被培养基中含有的吸附剂所吸附，因而可以避免抑制微生物的增殖或者代谢。
本发明的第6方案涉及的微生物数测定方法，其是第5方案所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流，从而求出所述微生物数。
根据本发明的第6方案涉及的微生物数测定方法，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第5方案涉及的微生物数测定方法。
本发明的第7方案涉及的微生物数测定方法，其是第1～6方案的任意一项所述的微生物数测定方法，其中，所述微生物为细菌，所述作用为静菌作用。
根据本发明的第7方案涉及的微生物数测定方法，由于对细菌具有静菌作用的成分被吸附剂所吸附，因而可以避免抑制细菌的增殖或者代谢。
本发明的第8方案涉及的微生物数测定方法，其是第7方案所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
根据本发明的第8方案涉及的微生物数测定方法，由于硫化物被吸附剂所吸附，因而可以避免由硫化物具有的静菌作用而引起对细菌的增殖或者代谢的抑制。特别是，在步骤(b)中采用氧电极法时，可以防止来自氧电极的输出电流因硫化物的影响而降低。从而即使对于由于含有硫化物而测定困难的检体也可以容易地采用氧电极法进行测定。
本发明的第9方案涉及的微生物数测定方法，其是第8方案所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
根据本发明的第9方案涉及的微生物数测定方法，由于钴酞菁四羧酸吸附硫化物，因而可以减少硫化物对步骤(b)的影响。
本发明的第10方案涉及的微生物数测定方法，其是测定包含在检体中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，向培养基中添加所述检体；步骤(b)，测定伴随着在所述培养基中培养的所述微生物的代谢而变动的可测定量，求出在所述步骤(a)中添加的所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有使所述步骤(b)中测定的所述可测定量的值降低的成分，在实行所述步骤(b)时的所述培养基中含有吸附所述成分的吸附剂。
根据本发明的第10方案涉及的微生物数测定方法，由于使可测定量的值降低的成分被吸附剂所吸附，因而可以减少该成分对步骤(b)的影响。具体来说，可以减少在步骤(b)中测定的可测定量的值降低。从而，避免不能算出初期微生物数。
本发明的第11方案涉及的微生物数测定方法，其是第10方案所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(a)中，所述检体被含有所述吸附剂的稀释液稀释后再添加到所述培养基中。
根据本发明的第11方案涉及的微生物数测定方法，由于包含在检体中的使可测定量的值降低的成分被稀释液中含有的吸附剂所吸附，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第12方案涉及的微生物数测定方法，其是第10方案所述的微生物数测定方法，其中，在实行所述步骤(a)时的所述培养基中含有所述吸附剂。
根据本发明的第12方案涉及的微生物数测定方法，由于包含在检体中的使可测定量的值降低的成分被培养基中含有的吸附剂所吸附，因而可以抑制对可测定量的影响。
本发明的第13方案涉及的微生物数测定方法，其是第10～12方案的任意一项所述的微生物数测定方法，其中，所述可测定量是在所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流。
根据本发明的第13方案涉及的微生物数测定方法，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第10～12方案的任意一项所述的微生物数测定方法。
本发明的第14方案涉及的微生物数测定方法，其是第13方案所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为多酚。
根据本发明的第14方案涉及的微生物数测定方法，多酚会使作为可测定量的电流值降低，但是由于其被吸附剂所吸附，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第15方案涉及的微生物数测定方法，其是第14方案所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠中的至少一种。
根据本发明的第15方案涉及的微生物数测定方法，由于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠吸附多酚，因而通过采用至少一种作为吸附剂可以减少步骤(b)中测定的可测定量的值降低。
本发明的第16方案涉及的微生物数测定方法，其是第13方案所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
根据本发明的第16方案涉及的微生物数测定方法，硫化物会使作为可测定量的电流值降低，但是由于其被吸附剂所吸附，因而可以其抑制对可测定量的影响。
本发明的第17方案涉及的微生物数测定方法，其是第16方案所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
根据本发明的第17方案涉及的微生物数测定方法，由于钴酞菁四羧酸吸附硫化物，因而可以减少步骤(b)中测定的可测定量的值降低。
本发明的第18方案涉及的微生物数测定方法，其是测定包含在检体(1)中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，使培养基(2)的营养成分及氧经过半透膜(3)向所述检体浸透；步骤(b)，在所述培养基侧测定伴随着所述微生物的代谢而变动的可测定量，求出在所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有使所述步骤(b)中测定的所述可测定量的值降低的成分，所述半透膜可以防止所述成分从所述检体向所述培养基透过。
根据本发明的第18方案涉及的微生物数测定方法，由于通过半透膜可以防止使可测定量的值降低的成分向培养基侧透过，因而可以减少该成分对步骤(b)中测定的可测定量的影响。具体来说，可以减少步骤(b)中测定的可测定量的值降低，从而避免不能算出初期微生物数。
本发明的第19方案涉及的微生物数测定方法，其是第18方案所述的微生物数测定方法，其中，所述可测定量是在所述培养基(2)中对应其中的含氧量而流通的电流。
根据本发明的第19方案涉及的微生物数测定方法，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第18方案涉及的微生物数测定方法。
本发明的第20方案涉及的微生物数测定方法，其是第19方案所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为多酚。
根据本发明的第20方案涉及的微生物数测定方法，多酚会使作为可测定量的电流值降低，但是由于通过半透膜可以防止其向培养基侧透过，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第21方案涉及的微生物数测定方法，其是第19方案所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
根据本发明的第21方案涉及的微生物数测定方法，硫化物会使作为可测定量的电流值降低，但是由于通过半透膜可以防止其向培养基侧透过，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第22方案涉及的微生物实验用培养基，其含有吸附剂，所述吸附剂吸附具有抑制微生物增殖或者代谢作用的成分。
根据本发明的第22方案涉及的微生物实验用培养基，由于具有抑制微生物的增殖或者代谢作用的成分被吸附剂所吸附，因而对微生物实验的影响减小。具体来说，例如在测定微生物数的时候，可以防止其测定时间长期化，或者避免不能算出初期微生物数。
本发明的第23方案涉及的微生物实验用培养基，其是第22方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述微生物为细菌，所述作用为静菌作用。
根据本发明的第23方案涉及的微生物实验用培养基，由于对细菌具有静菌作用的成分被吸附剂所吸附，因而可以避免抑制细菌的增殖或者代谢。
本发明的第24方案涉及的微生物实验用培养基，其是第23方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为硫化物。
根据本发明的第24方案涉及的微生物实验用培养基，由于硫化物被吸附剂所吸附，因而可以避免由硫化物具有的静菌作用而引起对细菌的增殖或者代谢的抑制。特别是，在采用氧电极法测定微生物数时，可以防止氧电极的输出电流因硫化物的影响而降低。从而即使对于由于含有硫化物而测定困难的检体也可以容易地采用氧电极法进行测定。
本发明的第25方案涉及的微生物实验用培养基，其是第24方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
根据本发明的第25方案涉及的微生物实验用培养基，由于钴酞菁四羧酸吸附硫化物，因而可以避免由硫化物具有的静菌作用而引起对细菌的增殖或者代谢的抑制。
本发明的第26方案涉及的微生物实验用培养基，其是在测定伴随着微生物的代谢而变动的可测定量时用于培养所述微生物的培养基，其含有吸附剂，所述吸附剂吸附使所述可测定量的值降低的成分。
根据本发明的第26方案涉及的微生物实验用培养基，由于使可测定量的值降低的成分被吸附剂所吸附，因而可以减少对微生物实验的影响。具体来说，可以减少可测定量的值的降低。
本发明的第27方案涉及的微生物实验用培养基，其是第26方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述可测定量是在所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流。
根据本发明的第27方案涉及的微生物实验用培养基，由于培养基中的含氧量随着微生物的代谢而变动，因而可以适用于第26方案涉及的微生物数测定方法。
本发明的第28方案涉及的微生物实验用培养基，其是第27方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为多酚。
根据本发明的第28方案涉及的微生物实验用培养基，多酚会使作为可测定量的电流值降低，但是由于其被吸附剂所吸附，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第29方案涉及的微生物实验用培养基，其是第28方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠中的至少一种。
根据本发明的第29方案涉及的微生物实验用培养基，由于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠吸附多酚，因而通过采用至少一种作为吸附剂可以减少可测定量的值降低。
本发明的第30方案涉及的微生物实验用培养基，其是第27方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为硫化物。
根据本发明的第30方案涉及的微生物实验用培养基，硫化物会使作为可测定量的电流值降低，但是由于其被吸附剂所吸附，因而可以抑制其对可测定量的影响。
本发明的第31方案涉及的微生物实验用培养基，其是第30方案所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
根据本发明的第31方案涉及的微生物实验用培养基，由于钴酞菁四羧酸吸附硫化物，因而可以减少可测定量的值降低。
本发明的第32方案涉及的微生物实验用培养基，其是第22～31方案的任意一项所述的微生物实验用培养基，其中，所述培养基为液体。
根据本发明的第32方案涉及的微生物实验用培养基，由于培养基是液体，因而电流的测定容易。
通过以下的详细说明和附图，本发明的目的、特征、局面和优点会更清楚。


图1是表示第1实施方式中说明的微生物数测定方法的流程图；图2是表示第2实施方式中说明的微生物数测定方法的流程图；图3是抽象表示第3实施方式中说明的测定用单元的截面图；图4是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图5是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图6是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图7是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图8是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图9是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图；图10是表示用氧电极法测定的输出电流的随时间变化的图。
具体实施例方式
作为实施本发明用的最佳方式，示出由氧电极法测定微生物数时应用本发明的例子。
1、第1实施方式对于第1实施方式涉及的微生物数测定方法，根据图1中所示的流程进行说明。采用含有抑制微生物增殖或代谢的成分的食品材料等作为该微生物数测定的对象即检体。具体来说，其为葱类或者干酪等食品材料，这些材料中含有作为抑制微生物增殖或代谢的成分的硫化物。
硫化物等成分作用于附着在食品材料等上的细菌，会抑制该细菌的增殖或者代谢。这样的所述成分对细菌的作用一般被理解为静菌作用。以下说明采用作为吸附硫化物的吸附剂的钴酞菁四羧酸来避免硫化物的静菌作用所引起的弊病的方式。
首先，准备含有钴酞菁四羧酸的稀释液(步骤101)。例如，可以通过以规定比例混合不含有吸附剂的普通稀释液(例如生理盐水)和钴酞菁四羧酸的溶液(步骤100)，从而准备含有吸附剂的稀释液。
随后，使用准备好的稀释液对检体进行消化处理，同时稀释至规定的浓度，从而调制检体液(步骤102)。通过该处理，检体内的细菌被萃取至检体液中。与此相伴，包含在检体中的硫化物也向稀释液扩散，但是其在稀释液中被钴酞菁四羧酸吸附。硫化物如果被吸附剂所吸附，则丧失其静菌作用。
接着，和以往的氧电极法同样地进行细菌数的测定。具体如下进行。首先，向生理盐水等液体培养基中添加检体液(步骤103)，再将其注入到在内侧具有氧电极的测定用单元中(步骤104)。随后，将该测定用单元安装在测定装置上。然后，开始测定细菌数(步骤105)。
在测定时测定用单元的氧电极将液体培养基中的溶解氧浓度转换成输出电流。输出电流可以理解为随着液体培养基中培养的细菌等微生物的代谢而变动的可测定量。随后，测定装置通过检测出该输出电流随时间的变化而测定包含在液体培养基中的细菌的初期菌数。
根据上述的微生物数测定方法，由于包含在检体中的硫化物被钴酞菁四羧酸吸附，因而可以减少该硫化物对由氧电极法进行的细菌数测定的影响。具体来说，可以防止因抑制细菌的增殖或者代谢而使测定时间变长，或者避免不能算出初期菌数。
在本实施方式中由氧电极法测定微生物数时所使用的液体培养基中也可以含有用于吸附硫化物的吸附剂。此时，由于没有被吸附剂吸附的硫化物的存在率进一步降低，因而可以进一步减少硫化物对通过氧电极法进行细菌数测定的影响。
另外，在本实施方式中，通过使用预先准备的含有吸附剂的稀释液(步骤100，101)进行检体液的调制，但是，也可以准备例如不含吸附剂的普通稀释液和吸附剂溶液，在调整检体液(步骤102)时分别将其添加到检体中。
再者，可以在检体稀释之前也可以在之后向稀释液添加吸附剂。对于任意一种情况，其结果均是在微生物数测定(步骤105)时添加了检体的液体培养基中含有吸附剂。
2、第2实施方式对于第2实施方式涉及的微生物数测定方法，根据图2中所示的流程进行说明。本实施方式中的所述微生物数测定的对象和第1实施方式是同样的。因而，作为具有静菌作用的成分采用硫化物，作为吸附该成分的吸附剂采用钴酞菁四羧酸。
首先，使用稀释液对检体进行消化处理，同时稀释至规定的浓度，从而调制检体液(步骤201)。通过该处理，检体内的细菌被萃取至检体液中。与此相伴，包含在检体中的硫化物也会向检体液扩散。
随后，准备含有钴酞菁四羧酸的液体培养基。例如，可以通过以规定比例混合不含有吸附剂的液体培养基(例如生理盐水)和钴酞菁四羧酸的溶液(步骤200)，从而准备含有吸附剂的液体培养基。
然后，向在步骤200中准备的液体培养基中添加调制好的检体液(步骤202)。此时，硫化物会向液体培养基中扩散，但是这些硫化物会被钴酞菁四羧酸吸附，丧失其静菌作用。
接着，将添加了检体液的液体培养基注入到在内侧具有氧电极的测定用单元中(步骤203)，并将该测定用单元安装在测定装置上。以后的操作和第1实施方式的步骤105同样地进行测定(步骤204)。由此测定包含在液体培养基中的细菌的初期菌数。
根据本实施方式涉及的微生物数测定方法，可以得到与第1实施方式中所示的微生物数测定方法所得到的效果同样的效果。
在本实施方式中进行消化处理时所使用的稀释液中也可以含有用于吸附硫化物的吸附剂。此时，由于没有被吸附剂吸附的硫化物的存在率进一步降低，因而可以进一步减少硫化物对通过氧电极法进行的细菌数测定的影响。
另外，在本实施方式中，向事先准备的含有吸附剂的液体培养基(步骤200)中添加了检体液(步骤202)，但是，例如也可以分别准备不含有吸附剂的普通液体培养基和吸附剂溶液，再依次向液体培养基中添加检体液及吸附剂溶液。向液体培养基中添加吸附剂可以是在添加检体之前也可以在之后添加吸附剂。对于任意一种情况，其结果均是在微生物数测定(步骤204)时添加了检体的液体培养基中含有吸附剂。
在上述的任意一个实施方式中，微生物数测定时采用氧电极法的情况下，可以防止氧电极的输出电流即可测定量因硫化物的影响而降低。也就是说，可以减少对微生物数测定的影响。从而，即使对于因含有硫化物而难以测定的检体，也可以采用氧电极法容易地进行测定。
可测定量降低这样的现象被认为是硫化物降低氧电极法的测定电流而引起的，尽管是氧饱和状态也会产生这种现象。
这样的现象也可以在通过氧电极法针对含多酚的检体进行微生物数测定时看到。对于多酚包括例如儿茶素。
该情况下，也可以通过用吸附剂吸附多酚来防止氧电极的输出电流即可测定量因多酚的影响而降低。对于吸附多酚的吸附剂可以采用例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠的至少一种。关于这些吸附剂吸附多酚的情况，在例如上述非专利文献1中已作介绍。
在以上的实施方式中，说明了将本发明应用于通过氧电极法进行的微生物数测定的例子。但是，本发明的应用并不限于此，可以广泛应用于使用培养基(含有稀释液)的所有微生物数测定方法例如快速测定法、琼脂培养法。
3、第3实施方式对第3实施方式涉及的微生物数测定方法进行说明。对于作为该微生物数测定的对象的检体，采用食品材料等，这些材料含有使随着微生物的代谢而变动的可测定量降低的成分。具体来说为绿茶等，在这些绿茶等材料中含有儿茶素等多酚作为使可测定量降低的成分。并且，在本实施方式中由于氧电极法被应用于微生物数的测定，因而可以采用对应于液体培养基中溶解氧浓度而变化的输出电流作为可测定量。
图3抽象地表示本实施方式涉及的用于微生物数测定的氧电极法测定装置上的测定用单元103。测定用单元103在内侧具有氧电极101，102和半透膜3。
氧电极101，102，一个是作用极，另一个是对极，并位于后述的管状半透膜3的外侧。并且在测定时氧电极将液体培养基中的溶解氧浓度变换为电流而输出。
与氧电极101，102连接的测定装置，通过检测出输出电流随时间的变化而测定包含在液体培养基中的微生物的初期微生物数。
半透膜3是例如一端可以开闭的管，检体液1从其一端注入管的内侧。检体液1例如和第1实施方式同样，通过使用稀释液对检体进行消化处理而得到。检体内的微生物被萃取到检体液1中，并且多酚也向检体液1中扩散。
将液体培养基2注入到测定用单元103内，并保证分别浸过管状半透膜3中用检体液1填充的部分的至少一部分和氧电极101，102。液体培养基2中含有营养成分及氧。
半透膜3可使液体培养基2中的营养成分及氧透过，但可阻止检体液1中的多酚透过。作为所述半透膜3可以采用透析用管，例如フナコシ株式会社制造的光谱/微孔毛细管电泳(CE)透析用管。透析用管通过采用100作为其截流分子量(MWCOMolecular Weight Cut Off)，从而可以阻止分子量大于100的分子透过。例如，作为多酚的例子的儿茶素，由于其分子量为290，因而不能透过该透析用管。另一方面，由于氧分子的分子量为32，因而可以透过该透析用管。
用具有这样的测定用单元103的测定装置测定微生物数时，可以如下理解。也就是说，通过使液体培养基2中的营养成分及氧经过半透膜3向检体液1渗透，并在培养基侧测定作为可测定量的输出电流，可以求出微生物的初期微生物数。
根据本实施方式涉及的微生物数测定方法，由于氧电极101，102几乎不和多酚接触，因而可以减少多酚对输出电流的影响。具体来说，减少了输出电流的降低，从而可以避免不能算出初期微生物数的情况。
图4分别针对存在半透膜3的情况和没有半透膜3的情况表示出在通过氧电极法进行的微生物数测定中测定的输出电流的结果。在此，采用截流分子量为100的上述透析用管作为半透膜3，采用儿茶素作为多酚。虚线所示的曲线表示没有半透膜的以往的微生物数测定方法的测定结果。实线所示的曲线表示应用了半透膜的本发明的微生物数测定方法的测定结果。
根据该测定结果，虽然截至到测定开始后200分钟没有看到因有无半透膜而引起的显著差异，但是在200分钟以后对于应用了半透膜的情况输出电流的降低减少了。从而，容易算出初期微生物数。
本实施方式涉及的微生物数测定方法也可以适用于检体液1中含有硫化物的情况。如第2实施方式中所陈述的，硫化物会使作为可测定量的输出电流降低。由于作为硫化物的烯丙基硫的分子量为114，因而通过采用例如上述截流分子量为100的透析用管作为半透膜3，可以阻止烯丙基硫向液体培养基侧透过。
这样，由于氧电极101，102几乎不和硫化物接触，因而可以减少硫化物对输出电流的影响。具体来说，减少了输出电流的降低，从而可以避免不能算出初期微生物数的情况。
实施例作为第1及第2实施方式的实施例，其表示本发明涉及的微生物数测定的具体实验结果。在本实验中选择成分中含有硫化物的代表性食品材料的洋葱、干葱、白葱、万能葱、干酪作为检体，对应于各检体通过氧电极法进行细菌数的测定。并且，使用钴酞菁四羧酸作为吸附硫化物的吸附剂。对于吸附剂的添加量，当检体为洋葱、干葱、白葱、万能葱时相对于每1个测定用单元(检体液1ml)，吸附剂的添加量为500μg，检体为干酪时相对于每1个测定用单元(检体液1ml)添加量为1mg。
图5～图9表示伴随着各自的测定时间的流失，氧电极的输出电流的变化。图5、图6、图7、图8、图9分别表示洋葱、干葱、白葱、万能葱、干酪的测定结果。并且各图(a)表示添加了检体的培养基不含有吸附剂的以往的细菌数测定方法的测定结果。各图(b)表示添加了检体的培养基中含有吸附硫化物的吸附剂的本发明涉及的微生物数测定方法的测定结果。
各图中分别表示出对初期菌数为105CFU/g的检体液测定2次的结果和对初期菌数为103CFU/g的检体液测定2次的结果。并且，初期菌数为105CFU/g的检体液所对应的测定结果用实线的曲线表示，而初期菌数为103CFU/g的检体液所对应的测定结果用虚线的曲线表示。另外，阈值Ith设定为300nA，用于测定直到氧电极的输出电流充分减少为止所需的时间。
以下基于测定结果，针对抑制作为吸附剂的效果的静菌作用和防止可测定量值降低，进行说明。
<抑制静菌作用>
根据图5～图7各自所示的测定结果，与不含有吸附剂的情况(图5(a)～图7(a))相比，培养基含有吸附剂的情况(图5(b)～图7(b))下电流达到阈值Ith所需的时间短。换言之，通过吸附剂而防止了测定时间的长期化。这被认为是，由于培养基含有吸附剂的情况下抑制了硫化物的静菌作用，因而与培养基不含有吸附剂的情况相比可以避免细菌的增殖或者代谢被抑制，并且氧的消耗量多。
(防止可测定量值降低>
根据图5(a)和图7(a)所示的测定结果，从测定开始直至输出电流的时间变化率大致恒定这段期间，输出电流虽没有达到阈值Ith，但已经显著降低到阈值Ith附近了。
另外，根据图8(a)和图9(a)所示的测定结果，在输出电流的时间变化率大致恒定之前，输出电流显著降低并到达阈值Ith。此时，由初期菌数为105CFU/g、103CFU/g的各曲线得到的所需时间大致相等，由对应的所需时间算出细菌数是非常困难的。
因此，如图5(b)、图7(b)、图8(b)和图9(b)所示，通过使用添加了吸附剂的培养基，可以减少输出电流的降低。据认为，这是由于在氧饱和状态，抑制了硫化物降低输出电流的现象。特别是在图8(b)和图9(b)中，通过减少输出电流的降低，由初期菌数为105CFU/g、103CFU/g的各曲线得到的所需时间存在差异。从而可以容易地由对应的所需时间算出细菌数。
以上详细地说明了本发明，但是上述的说明仅是所有方式中的例示，本发明并不限于此。可以理解为，在不超出本发明的范围可以想象出没有例示的无数变形例。
权利要求
1.微生物数测定方法，其是测定包含在检体中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，向培养基中添加所述检体；步骤(b)，求出在所述步骤(a)中添加的所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有具有抑制所述微生物增殖或者代谢作用的成分，在实行所述步骤(b)时的所述培养基中含有吸附所述成分的吸附剂。
2.根据权利要求1所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流，从而求出所述微生物数。
3.根据权利要求1所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(a)中，所述检体被含有所述吸附剂的稀释液稀释后再添加到所述培养基中。
4.根据权利要求3所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量流通的电流，从而求出所述微生物数。
5.根据权利要求1所述的微生物数测定方法，其中，在实行所述步骤(a)时的所述培养基中含有所述吸附剂。
6.根据权利要求5所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(b)中，测定所述培养基中对应其中的含氧量流通的电流，从而求出所述微生物数。
7.根据权利要求1～6的任意一项所述的微生物数测定方法，其中，所述微生物为细菌，所述作用为静菌作用。
8.根据权利要求7所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
9.根据权利要求8所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
10.微生物数测定方法，其是测定包含在检体中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，向培养基中添加所述检体；步骤(b)，测定伴随着在所述培养基中培养的所述微生物的代谢而变动的可测定量，求出在所述步骤(a)中添加的所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有使所述步骤(b)中测定的所述可测定量的值降低的成分，在实行所述步骤(b)时的所述培养基中含有吸附所述成分的吸附剂。
11.根据权利要求10所述的微生物数测定方法，其中，在所述步骤(a)中，所述检体被含有所述吸附剂的稀释液稀释后而添加到所述培养基中。
12.根据权利要求10所述的微生物数测定方法，其中，在实行所述步骤(a)时的所述培养基中含有所述吸附剂。
13.根据权利要求10～12的任意一项所述的微生物数测定方法，其中，所述可测定量是在所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流。
14.根据权利要求13所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为多酚。
15.根据权利要求14所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠中的至少一种。
16.根据权利要求13所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
17.根据权利要求16所述的微生物数测定方法，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
18.微生物数测定方法，其是测定包含在检体(1)中的微生物的个体数的微生物数测定方法，包括步骤(a)，使培养基(2)的营养成分及氧经过半透膜(3)向所述检体浸透；步骤(b)，在所述培养基侧测定伴随着所述微生物的代谢而变动的可测定量，求出在所述检体中所包含的所述微生物数；所述检体含有使所述步骤(b)中测定的所述可测定量的值降低的成分，所述半透膜可以防止所述成分从所述检体向所述培养基透过。
19.根据权利要求18所述的微生物数测定方法，其中，所述可测定量是在所述培养基(2)中对应其中的含氧量而流通的电流。
20.根据权利要求19所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为多酚。
21.根据权利要求19所述的微生物数测定方法，其中，所述成分为硫化物。
22.微生物实验用培养基，其含有吸附剂，所述吸附剂吸附具有抑制微生物增殖或者代谢作用的成分。
23.根据权利要求22所述的微生物实验用培养基，其中，所述微生物为细菌，所述作用为静菌作用。
24.根据权利要求23所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为硫化物。
25.根据权利要求24所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
26.微生物实验用培养基，其是在测定伴随着微生物的代谢而变动的可测定量时用于培养所述微生物的培养基，其含有吸附剂，所述吸附剂吸附使所述可测定量的值降低的成分。
27.根据权利要求26所述的微生物实验用培养基，其中，所述可测定量是在所述培养基中对应其中的含氧量而流通的电流。
28.根据权利要求27所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为多酚。
29.根据权利要求28所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、离子交换树脂、牛血清白蛋白(BSA)及异抗坏血酸钠中的至少一种。
30.根据权利要求27所述的微生物实验用培养基，其中，所述成分为硫化物。
31.根据权利要求30所述的微生物实验用培养基，其中，所述吸附剂为钴酞菁四羧酸。
32.根据权利要求22～31的任意一项所述的微生物实验用培养基，其特征在于，其为液体。
全文摘要
本发明涉及微生物数测定方法及供给于该测定方法的微生物实验用培养基。其目的是，即使检体中含有影响测定的成分也可以减小该影响。为了实现上述目的采用如下的步骤。准备含有钴酞菁四羧酸的稀释液(步骤101)。使用稀释液对检体进行消化处理，同时稀释至规定的浓度，从而调制检体液(步骤102)。借此，虽然包含在检体中的硫化物向稀释液扩散，但会被钴酞菁四羧酸吸附，丧失其静菌作用。接着，通过氧电极法进行细菌数的测定首先，向生理盐水等液体培养基中添加检体液(步骤103)，再将其注入到在内侧具有氧电极的测定用单元中(步骤104)。将该测定用单元安装在测定装置上后，开始测定细菌数(步骤105)。
文档编号C12Q1/06GK1798849SQ20048000179
公开日2006年7月5日 申请日期2004年11月9日 优先权日2003年12月1日
发明者福井直树, 赤松惠 申请人:大金工业株式会社