专利名称：细胞微阵列芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片及其制备方法，尤其为细胞微阵列芯片及其制备方法。
细胞微阵列芯片是生物芯片中的一种，生物芯片主要指在固体基片上组装的生物活性物质(包括核酸、蛋白质、细胞及微小组织等)构成的微阵列，以实现对化合物(包括药物)、蛋白质、核酸、细胞以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的筛选或检测。生物芯片的主要特点包括(1)可在一个较小的固体基片上组装大量的(102～106种)生物活性物质，获取的信息量大，效率高，消耗的生物试剂少，可节约大量的试剂费用，成本低；(2)采用了微细加工技术，可以通过提高集成度，降低单个芯片的制备成本，实现大批量生产；(3)结合微机械技术(MEMS)，可把生物样品的预处理，提取，扩增，反应，以及信息检测相集成，制备成微型、全自动化、无污染、可用于微量试样检测的高度集成的智能化生物芯片。
生物芯片在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义。传统生物检测所采用的方法包含一系列繁杂的步骤，尤其在大规模化合物筛选方面费时、费力、成本高，不能满足大规模高通量药物筛查的需要。在对传统方法进行改进的过程中，以细胞芯片为代表的生物芯片技术应运而生。这一技术的成熟和应用将为新药的开发和鉴定、食品和环境等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供强有力的手段。
多孔检测板(如96孔板)是现行普遍使用的一种用于医药、生化检测和筛选的常规器具。在药物检测和筛选时分别把不同效应的细胞株放置或固定于不同的孔洞之中，通过加入不同的化学物，或化合物组合，或生化试剂，观察不同效应细胞对于化学/生物物质的反应，进行快速药物筛选。其上的96个反应池彼此隔离，根据用户需要可任意选用反应池的个数。这是现行普遍使用的一种用于药物研究和开发的方法。为了提高药物筛选的效率，人们通过微加工技术，在硅，玻璃，塑料等基片上制造密度更高，孔径更小的检测板，把不同的细胞固化于空洞之中，并在检测空洞中制备电极等微型检测探头。但这种方法仍需要逐个地把不同单个细胞株分配到各个空洞之中，不能批量化和标准化制备，制备过程仍较复杂，成本较高，也不便于同时快速连续操作，更不便于同时对试样中多组分的连续快速检测，而且空洞中不同细胞处于不同的周期状态，给药物的筛选造成了许多困难。本发明所提出的细胞微阵列芯片能够批量化地制备同一种细胞微阵列芯片，能通过控制细胞的培养条件使芯片上的所有细胞处于同一细胞周期，这对药物筛选很重要；同时可进行多信息量和多参数的检测；小型化；成本低；无污染。
本发明的目的就是针对目前药物研究和开发中常规器具存在的不足之处，提出一种新的细胞微阵列芯片及其制备方法。该细胞微阵列芯片可标准化和批量化生产，可对大量化合物分子进行多项生物活性指标连续快速分析，试样和试剂消耗量小，操作简易可行。
为实现上述目的，本发明所提出的细胞微阵列芯片，它由细胞芯片裸片、封装盖板和底板构成，细胞芯片裸片上密集排列若干微小通孔，细胞芯片裸片封装于盖板和底板之间。封装盖板形式之一是该封装盖板面对芯片裸片的一面上布有微流体沟槽，该微流体沟槽正好将芯片裸片上的微小孔连通起来，并设置一对液体的输入和输出端口；封装盖板形式之二在硬质板材(如玻璃、塑料等)上打若干通孔，通孔的数目与芯片裸片上微小孔的数目相等，且各通孔的位置与裸片上微小孔的位置能一一对应，并在此盖板上覆盖保护膜。底板形式之一是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应；底板形式之二是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应，且在底板上设置有微电极阵列，微电极阵列与芯片裸片阵列一一对应；底板形式之三也是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应，且在底板上设置传感器阵列(声传感器或热传感器或化学传感器阵列)，并使传感器阵列与芯片裸片阵列一一对应。
此外，为了防止细胞芯片裸片受环境不良影响，在裸片的单面或双面覆盖防护膜。该防护膜采用高分子材料或玻璃纤维或布等多孔网状材料制成，此防护膜一方面可以防止裸片受到环境影响，另一方面此防护膜可以使营养液能渗透进去，而细胞从裸片中不能出来；为实现上述目的，本发明给出的细胞微阵列芯片的制备方法包括以下内容，
一、芯片裸片的制备，1.芯片裸片形式一的制备，1)制模制备有微细柱状阵列的模具；2)注塑将高分子材料(如硅橡胶、纤维素、塑料、导电高分子蛋白等)注入模具中，脱模后形成一内部分布有大量平行密集排列的微小空心管道的块体高分子材料，微小空心管道内部可以是全空的，也可以是网状多孔填充物；3)引入细胞株并培养应用微量点样方法或其它微量分配方法，将不同细胞株引入不同的管道，并在适当的条件下培养，使之生长，直至在块体材料内所有的管道中长满所需的细胞；4)切片应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切或削成薄片；5)覆盖防护膜在裸片的单面或双面覆盖防护膜，该防护膜采用高分子材料或玻璃纤维或布等多孔网状材料制成，此防护膜一方面可以防止裸片受到环境影响，另一方面此防护膜可以使营养液能渗透进去，而细胞从裸片中不能出来；2.芯片裸片形式二的制备，1)细胞引入向空心微管道(如中空纤维管道)中引入不同的细胞；2)细胞培养在不同的培养液和条件下，使各空心微管道中长满所需的细胞；3)诸管道排列定位、注塑用一个注模把不同管道拉紧并排布成二维阵列，用高分子材料注入模具中，制备成内部分布有大量空心微管道阵列的块体材料；4)切片应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切或水削成薄片；5)覆盖防护膜在裸片的一面或双面覆盖防护膜，该防护膜或采用高分子材料或玻璃纤维或布等多孔网状膜，此防护膜一方面可以防止裸片受到不良环境的影响，另一方面此防护膜不影响裸片的正常使用，即营养液能渗透进去，而细胞从裸片中不能出来；二、封装盖板的制备1.盖板形式一的制备，采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材面向芯片裸片的一侧面加工成有供液体流动的微流体沟槽，并设置一对液体的输入和输出端口。
2.盖板形式二的制备，采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材(如玻璃、塑料等)上打若干通孔，通孔的数目与芯片裸片上微小孔的数目相等，且各通孔的位置与裸片上微小孔的位置能一一对应，并在此盖板上覆盖保护膜。
三、底板的制备1.底板形式一的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板。
2.底板形式二的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置有微电极阵列，微电极阵列与芯片裸片阵列一一对应。
3.底板形式三的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置传感器阵列(声传感器或热传感器或化学传感器阵列)，并使传感器阵列与芯片裸片阵列一一对应。
四、封装将上述芯片裸片形式中的任一种与盖板形式中的任一种以及底板形式中的任一种进行组合封装成为一体，就能得到某种细胞芯片的结构形式，通过三种部件的各种组合封装即得到不同结构形式的细胞芯片，以满足不同检测方法(如光学方法、电化学方法、传感器方法)检测的需要。
本发明优点是所提出的细胞微阵列芯片可在同一块芯片上同时进行一种药物对于不同细胞作用的定性或定量分析，所得结果可以用光、电、热、声、或化学等方法进行检测。例如可用普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜、CCD观察或表面激元共振(SPR)，表面干涉反射(RIFS)等光学、电流和电位等电学技术，或者热敏电阻、石英晶振等方法来观察细胞或微生物的状态并给出结果，也可用其它标记的或非标记的方法检测。从而大大提高工作效率，减少试剂用量，真正做到快速、适时、准确、自动化和无污染的药物筛选及其药物检测。
另外，各细胞或微生物反应位点上所进行的微反应可以通过电、光、声、或热等物理方法进行加速和调控，例如，可以在各微孔通道内分别设置微电极，通过调控电场来控制通道上的微反应；通过控制电流的大小和方向，使所需的反应物快速聚集或分散，或改变其它物理化学环境，从而改变细胞或微生物与药物的作用，提高检测灵敏度或缩短检测时间。本发明所给出的细胞微阵列芯片包括动物细胞、植物细胞及微生物微阵列芯片。它可用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选，传统药物的现代化研究，以及基因组或cDNA文库的筛选，新基因的发现和基因功能的研究，蛋白质组学的研究等。本发明将大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的描述
图1本发明提出的细胞芯片裸片示意图。
图2本发明提出的细胞芯片封装盖板之一示意图。
图3本发明提出的微流体型细胞芯片示意图。
图4本发明提出的细胞芯片封装盖板之二示意图。
图5本发明提出的多孔型细胞芯片示意图。
图6本发明提出的内部含有大量长满细胞管道阵列的块体材料示意图。
图7本发明提出的制备细胞芯片裸片的方法示意图。
图8本发明提出的细胞芯片底板示意图。
以上附图中，
图1为本发明提出的一种细胞芯片的裸片示意图它是由许多微小细胞通孔1密集排列的细胞芯片裸片2，芯片裸片上的小通孔中分别固定不同的细胞。
图2为本发明提出的一种细胞芯片封装盖板其表面可有微流体通道的盖板3，该盖板上设置有微流体沟槽4，当盖板以有微流体沟槽一面盖在与
图1对应的细胞芯片裸片上时，盖板上的微流体沟槽正好将细胞芯片裸片上的微通孔联起来，使细胞芯片裸片上的细胞微通孔位点通过微流体沟槽通道连结成一封闭的具有微流体输入端口5和输出端口6的细胞芯片。
图3为与图2对应的微流体型细胞芯片，药液可以通过微流体管道的输入口5直接加入到不同的细胞株中，其中7为底板。
图4为本发明提出的另外一种细胞芯片封装盖板，盖板上具有与
图1对应的细胞芯片裸片上的微孔相对应的注液通孔，其中8为细胞芯片通孔，9为封装多孔型盖板。
图5为与图4对应的多孔型细胞芯片，药液可以通过注液通孔分别直接加入不同的细胞株中，其中7为底板，2为细胞芯片裸片，9为封装多孔型盖板，10为保护膜。
图6为本发明提出的内部分布有大量平行细小空心管道11的块体材料12，在各个微小管道内生长和固化了不同的细胞。
图7为本发明提出的制备细胞芯片裸片的方法通过快速切片机将与图6对应的块体材料12沿垂直于微小管道的方向上切成薄片，即制成了细胞芯片的裸片，其中13为刀具。
图8为本发明提出的设置有微电极阵列或传感器阵列14的细胞芯片底板。
以下结合几个具体实施例进一步说明本发明实施例一细胞微阵列芯片的制备。
1.细胞芯片裸片(一)的制备1)首先利用机械加工方法(如线切割加工，切削加工等工艺)或LIGA工艺，体硅加工工艺，注塑加工工艺等或应用其他方法制备一个具有微细柱状阵列的模具，每个柱状的尺寸为100um×100um。
2)应用注塑工艺将一种硅橡胶的原料注入金属模具中，脱模后形成一内部分布有大量平行密集排列的微小空心管道的块体硅橡胶材料，微小空心管道内部可以是全空的，也可以是网状多孔填充物。
3)其中不同管道中可灌注不同的适合该细胞株培养的营养液，使管道内部适合于细胞生长。
4)应用微量点样方法或其它微量分配方法，将不同细胞株引入不同的孔道，在适当的条件(如营养液在管道内流动，在二氧化碳、氧气等一定比例混合气体)培养，使之生长，直至在块体材料内所有的管道中长满了所需的细胞。
(如附图6所示)5)应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切成薄片，(如附图7所示)即制得所需的细胞芯片裸片(如附
图1所示)。
6)采用高分子材料或玻璃纤维或布等多孔材料制成的网状膜依附在在成型裸片的一面或双面，覆盖此防护膜一方面可以防止裸片受到环境影响，另一方面此防护膜能保证裸片的正常使用，即营养液能渗透进去，而细胞从裸片中不能出来，并要求此防护膜与裸片(固体微芯片基片)表面接触性好，有一定弹性，不容易在接触基片界面上引起反应溶液泄漏。
2.细胞芯片裸片(二)的制备1)首先利用若干中空纤维管道，在不同的中空纤维管道中引入不同的细胞。
2)在不同的培养液和条件下使各中空纤维管道中长满所需的细胞。
3)用一个注模把不同管道拉紧并排布成二维阵列，用高分子材料注入模具中，制备成内部分布有大量中空管道阵列的块体材料。
4)应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切成薄片，即制得所需的细胞微阵列芯片裸片。
5)采用高分子材料或玻璃纤维或布等多孔材料制成的网状防护膜依附在成型裸片的单面或双面，覆盖此防护膜，一方面可以防止裸片受到环境的不良影响，另一方面此防护膜能保证裸片的正常使用，即营养液能渗透进去，而细胞从裸片中不能出来，并要求此防护膜与裸片(固体微芯片基片)表面接触性好，有一定弹性，不容易在接触基片界面上引起反应溶液泄漏。
3.封装盖板(一)的制备采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材面向芯片裸片的一侧面加工成有供液体流动的微流体沟槽，并设置一对液体的输入和输出端口。(如附图2所示)4.封装盖板(二)的制备采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材(如玻璃、塑料等)上打若干通孔，通孔的数目与芯片裸片上微小孔的数目相等，且各通孔的位置与裸片上微小孔的位置能一一对应，并在此盖板上覆盖保护膜。
5、底板(一)的制备采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板。
6、底板(二)的制备采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置有微电极阵列，微电极阵列与芯片裸片阵列一一对应。
7、底板(三)的制备采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置传感器阵列(声传感器或热传感器或化学传感器阵列)，并使传感器阵列与芯片裸片阵列一一对应。
8、封装将上述芯片裸片形式中的任一种与盖板形式中的任一种以及底板形式中的任一种进行组合封装成为一体，就能得到某种细胞芯片的结构形式，通过三种部件的各种组合封装成不同结构形式的，尺寸为2cm×2cm的细胞微阵列芯片，以满足不同检测方法(如光学方法、电化学方法、传感器方法)检测的需要。实施例二基因组DNA或cDNA文库芯片制备多管道块体硅橡胶材料的制备方法同实施例一，在管道内灌注供大肠杆菌生长的LB液体培养剂，将携带不同大小基因或cDNA片段的大肠杆菌引入不同的孔道，使之在培养箱中生长，直至在块体材料内不同的管道中长满携带不同大小基因或cDNA片段的大肠杆菌，将该块体材料沿垂直于微小管道的方向切成薄片；最后用布有微流体如沟槽通道或多孔的硬质板材进行封装，构成基因组DNA或cDNA文库芯片。实施例三不同细胞周期的细胞芯片多管道块体硅橡胶材料的制备方法同实施例一，在平行的微小管道内引入同一种细胞株，但在不同的管道内灌注不同的液体培养剂，通过控制培养液的化学组分，气体成分以及温度、压力等物理参数，控制不同管道中细胞的生长状态、营养状态、细胞周期，以及耐药性，从而可制备在同一芯片上获得不同状态的相同细胞株阵列。该芯片可用于研究化学药品对细胞的作用。
权利要求
1.细胞微阵列芯片，它由细胞芯片裸片、封装盖板和底板构成，细胞芯片裸片上密集排列若干微小通孔，细胞芯片裸片封装于盖板和底板之间。
2.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于细胞芯片裸片的单面或双面覆盖有防护膜。
3.根据权利要求2所述的细胞微阵列芯片，其特征在于防护膜采用高分子材料或玻璃纤维布等多孔网状材料制成。
4.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于所述封装盖板面对芯片裸片的一面上布有微流体沟槽，该微流体沟槽正好将芯片裸片上的微小孔连通起来，并设置一对液体的输入和输出端口。
5.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于所述封装盖板在硬质板材上设置若干通孔，通孔的数目与芯片裸片上微小孔的数目相等，且各通孔的位置与裸片上微小孔的位置能一一对应，并在此盖板上覆盖保护膜。
6.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于所述的底板是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应。
7.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于所述的底板是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应，且在底板上设置有微电极阵列，微电极阵列与芯片裸片阵列一一对应。
8.根据权利要求1所述的细胞微阵列芯片，其特征在于所述的底板是采用硬质材料制成，其大小与芯片裸片大小相应，且在底板上设置传感器阵列(声传感器阵列或热传感器阵列或化学传感器阵列)，并使传感器阵列与芯片裸片阵列一一对应。
9.细胞微阵列芯片制备方法，其特征在于该制备方法包括以下内容(1)芯片裸片的制备，A、芯片裸片形式一的制备，a)制模制备有微细柱状阵列的模具；b)注塑将高分子材料(如硅橡胶、纤维素、塑料、导电高分子蛋白等)注入模具中，脱模后形成一内部分布有大量平行密集排列的微小空心管道的块体高分子材料，微小空心管道内部可以是全空的，也可以是网状多孔填充物；c)引入细胞株并培养应用微量点样方法或其它微量分配方法，将不同细胞株引入不同的管道，并在适当的条件下培养，使之生长，直至在块体材料内所有的管道中长满所需的细胞；d)切片应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切或削成薄片；e)覆盖防护膜在裸片的单面或双面覆盖多孔网状防护膜；B、芯片裸片形式二的制备，a)细胞引入向空心微管道(如中空纤维管道)中引入不同的细胞；b)细胞培养在不同的培养液和条件下，使各空心微管道中长满所需的细胞；c)诸管道排列定位、注塑用一个注模把不同管道拉紧并排布成二维阵列，用高分子材料注入模具中，制备成内部分布有大量空心微管阵列的块体材料；d)切片应用快速切片机械，将块体材料沿垂直于微小管道的方向切或削成薄片，即制得所需的细胞微阵列芯片裸片；e)覆盖防护膜在裸片的单面或双面覆盖多孔网状防护膜；(2)封装盖板的制备，A、盖板形式一的制备采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材面向芯片裸片的一侧面加工成有供液体流动的微流体沟槽，并设置一对液体的输入和输出端口；B、盖板形式二的制备采用机械钻孔、激光打孔、化学腐蚀等加工工艺在硬质板材(如玻璃、塑料等)上打若干通孔，通孔的数目与芯片裸片上微小孔的数目相等，且各通孔的位置与裸片上微小孔的位置一一对应，并在此盖板上覆盖保护膜；(3)底板的制备，A.底板形式一的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板；B.底板形式二的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置微电极阵列，微电极阵列与芯片裸片阵列一一对应；C.底板形式三的制备，采用硬质材料制成大小与芯片裸片大小相应的底板，并在底板上设置传感器阵列，并使传感器阵列与芯片裸片阵列一一对应；(4)封装将上述芯片裸片形式中的任一种与盖板形式中的任一种以及底板形式中的任一种进行组合封装成为一体，就能得到某种细胞芯片的结构形式，通过三种部件的各种组合封装即得到不同结构形式的细胞芯片，以满足不同检测方法(如光学方法、电化学方法、传感器方法)检测的需要。
全文摘要
本发明涉及细胞微阵列及其制备方法。该细胞微阵列芯片由芯片裸片、封装盖板和底板层迭封装而成,在芯片裸片上的微小通孔中植入细胞株,通过在封装盖板上设置微流体沟槽或设置注液通孔,向裸片上的细胞株加入药液。此外,在底板上设置相应微电极阵列或传感器阵列,使该细胞微阵列芯片可适用于光学、电化学、传感器等不同检测方法。本发明提出的细胞微阵列芯片可以进行标准化和批量化制备,并且可以严格控制芯片上细胞株的状态(如细胞周期等)。本发明的细胞微阵列芯片可用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选,传统药物的现代化研究,以及基因组或cDNA文库的筛选,新基因的发现和基因功能的研究,蛋白质组学的研究等。
文档编号C12Q1/68GK1330154SQ0012206
公开日2002年1月9日 申请日期2000年8月15日 优先权日2000年6月27日
发明者陆祖宏, 朱纪军, 唐祖明, 朱毅, 陈劲松, 赵雨杰, 何农跃, 刘全俊, 程璐 申请人:南京益来基因医学有限公司