专利名称：D－型非天然氨基酸的制备新方法
技术领域：
本发明涉及非天然氨基酸的一种新的制备方法，特别是D-型非天然氨基酸的制备方法。
天然的L-氨基酸由于可以从天然提取或发酵直接得到，目前国内外均有大规模生产，产品生产能力大于需求量。非天然氨基酸，D-氨基酸及其衍生物广泛应用于医药等领域，它是合成新药如抗菌和抗病毒药物、食品添加剂如人工甜味剂、农药如杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间物，特别是作为半合成抗生素的侧链原料，D-型氨基酸更受到学术界与产业界的关注。D-氨基酸很难通过天然提取的方法制备，目前研究或产业化一般通过拆分的方法制备，拆分的方法有化学拆分、物理拆分及酶拆分。酶拆分的方法较为成熟、稳定但酶的价格太高，酶的用量大，生产周期长效率低，难以大规模化生产。化学拆分和物理拆分目前方法还不成熟。近年来国内外对D-氨基酸的需求逐步增加，研究新的方法进行D-氨基酸的规模化生产并降低成本具有巨大的市场前景和良好的社会经济效益。
本发明的目的是提供一种非天然氨基酸特别是D-氨基酸的制备新方法。该方法是应用化学合成技术，把廉价的天然的L-氨基酸通过重氮化反应再经过氨解、酶拆分的方法转变成非天然的D-氨基酸，该方法成本低、生产周期短，容易实现规模化生产。
我们的目的是这样实现的把L-氨基酸在一定温度、酸性环境、有卤素离子存在的情况下与亚硝酸钠进行重氮化反应得到大量的α-D-卤代酸及少量的α-L-卤代酸，卤代酸再用氨水或液氨进行氨解得到大量的D-氨基酸及少量的L-氨基酸，通过水和乙醇(或甲醇)重结晶可得到占初品30-80％的纯D-氨基酸及20-70％的含有少量L-氨基酸的D-氨基酸(以下简称不纯物)，把不纯物用常规化学方法进行氨基乙酰或氯乙酰化，得到酰化氨基酸，酰化氨基酸用酶拆分，用常规化学手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-氨基酸纯品，从而提高收率，该方法与常规酶拆分方法相比酶的用量大大降低，效率也大大提高。
本发明所述的L-氨基酸是指L-丙氨酸(alanine)、L-缬氨酸(valine)、L-亮氨酸(leucine)、L-异亮氨酸(isoleucine)、L-苯丙氨酸(phenylalanine)、L-半胱氨酸(cysteine)、L-苏氨酸(threonine)、L-蛋氨酸(methionine)、L丝氨酸(serine)、L-脯氨酸(proline)、L-酪氨酸(tyrosine)、L-色氨酸(tryptophan)、L-天冬氨酸(aspartic acid)、L-谷氨酸(glutamic acid)、L-赖氨酸(lysine)、L-精氨酸(arginine)、L-组氨酸(histidine)、L-谷氨酰胺(glutamine)、L-天冬酰胺(asparagine)中的任意一种。本发明进行重氮化反应的温度是-30℃--50℃，其中最佳反应温是-5℃--15℃；本发明把α-D-卤代酸用氨水或液氨进行氨解的温度是-5℃--100℃，其中最佳反应温是0℃--75℃。本发明所述的酸性环境是指重氮化反应进行时要用到酸，酸可以是无机酸或有机酸，常用的是无机酸，主要是硫酸、硝酸或氢卤酸，其用量为L-氨基酸摩尔量的1-10倍，最佳为2-5倍。本发明所述亚硝酸钠的用量为L-氨基酸摩尔量的1-5倍，最佳为1-3倍。本发明所用的卤素离子为氟、氯、溴、碘离子中的一种单独或几种共同使用，通常使用其无机盐如钠盐、钾盐、锂盐或直接使用氢卤酸如盐酸、氢溴酸，其用量为L-氨基酸摩尔量的1-10倍，最佳为2-5倍。重氮化反应进行时可适当加入催化剂如氯化亚铜等。重氮化反应形成的α-D-卤代酸可以用有机溶剂萃取出来，有机溶剂可以用乙酸乙酯、乙谜等所有疏水性溶剂。本发明氨解用氨水或液氨，其用量为α-D-卤代酸重量的2-20倍，最佳为3-10倍。本发明所用的酶为酰化酶或蛋白酶，酰化酶具体可用猪腰酰化酶及黄曲酰化酶，I型II型均可，蛋白酶主要枯草杆菌蛋白酶，酶用量为酰化氨基酸的1-10％，最佳为1-5％；用蛋白酶时把酰化氨基酸先形成甲酯后进行拆分。
本发明实施例如下实施例一在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2molL-丙氨酸，加入1000ml水及10mol氢溴酸，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加3mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--8℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙酸乙酯萃取出形成的D-溴丙酸，蒸干乙酸乙酯后加入5倍量的氨水在60℃密封氨解10小时得到初品D-丙氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，收率48％，另有30％的含有少量L-氨基酸的D-氨基酸(以下简称不纯物)用乙酸酐进行乙酰化后，加入酰化物总量3％的猪腰酰化酶I进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-氨基酸纯品，总收率80％。HPLC检测含量99％，旋光-14--16℃(C＝2，5N HCl)。
实施例二在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-谷氨酸，加入500ml水及12mol氢溴酸，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加2.4mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-溴代戊二酸，蒸干乙醚后加入3倍量的氨水在60℃密封氨解10小时得到初品D-谷氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，收率53％，另有30％的不纯物用乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量5％的猪腰酰化酶II进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-氨基酸纯品，总收率90％，HPLC检测含量99％，旋光-31--33℃(C＝2，5N HCl)。
实施例三在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-天冬酸，加入1500ml水及20mol氢溴酸，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加2.2mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙酸乙酯萃取出形成的D-α-溴丁二酸，蒸干乙醚后加入10倍量的氨水在25℃密封氨解72小时得到初品D-天冬酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，收率32％，另有50％的不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量2％的黄曲酰化酶II进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-天冬酸纯品，总收率80％，HPLC检测含量99％，旋光-24.4--26.4℃(C＝2，5N HCl)。
实施例四在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-丝氨酸，加入2000ml水及6mol盐酸，加入2mol氯化亚酮，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加6mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-氯代-4-羟基丁酸，蒸干乙醚后加入15倍量的氨水在60℃密封氨解10小时得到初品D-丝氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，另有不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量2％的黄曲酰化酶I进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-丝氨酸纯品，总收率90％，HPLC检测含量99％，旋光-14--16℃(C＝2，5N HCl)。
实施例五
在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-亮氨酸，加入3000ml水及6mol硫酸，加入11mol溴化钠，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加3mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-溴代酸中间体，蒸干乙醚后加入10倍量的氨水在60℃密封氨解10小时得到初品D-亮氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，把不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量2％的黄曲酰化酶II进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-亮氨酸纯品，总收率80％，HPLC检测含量99％，旋光-15--17℃(C＝2，5N HCl)。
实施例六在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-苯丙氨酸，加入3000ml水及5mol硫酸，加入10mol溴化钠，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加3mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-溴代酸中间体，蒸干乙醚后加入10倍量的氨水在60℃密封氨解5小时得到初品D-苯丙氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，把不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量2％的猪腰酰化酶I进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-苯丙氨酸纯品，总收率80％，HPLC检测含量99％，旋光+3.5--5.5℃(C＝2，5N HCl)。
实施例七在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-组氨酸，加入3000ml水及5mol硫酸，加入14mol溴化钠，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加2.4mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-溴代酸中间体，蒸干乙醚后加入10倍量的氨水在60℃密封氨解5小时得到初品D-苯丙氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，把不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，加入酰化物总量6％的猪腰酰化酶I进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-组氨酸纯品，总收率95％，HPLC检测含量99％，旋光-11--13℃(C＝2，5N HCl)。
实施例八在5000ml园底玻璃烧瓶中加入2mol L-色氨酸，加入3000ml水及5mol硫酸，加入14mol溴化钠，冷却到0℃，搅拌下慢慢滴加2.4mol亚硝酸钠的水溶液，滴加过程维持反应温度0--10℃，加完后在室温搅拌1小时，用乙醚萃取出形成的D-α-溴代酸中间体，蒸干乙醚后加入10倍量的氨水在60℃密封氨解5小时得到初品D-色氨酸，初品用水及醇重结晶后得到纯品，把不纯物用氯乙酐氯进行乙酰化后，再进行甲酯化后加入酰化物总量4％的枯草杆菌蛋白酶进行拆分，用常规氨基酸分离手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-色氨酸纯品，总收率95％，，HPLC检测含量99％，旋光-2.1--3.5℃(C＝2，5N HCl)。
权利要求
1.一种非天然氨基酸特别是D-氨基酸的制备新方法，应用化学合成技术，把L-氨基酸在一定温度、酸性环境、有卤素离子存在的情况下与亚硝酸钠进行重氮化反应得到α-D-卤代酸，卤代酸再用氨水或液氨进行氨解得到大量的D-氨基酸及少量的L-氨基酸，通过水和乙醇(或甲醇)重结晶可得到占初品30-80％的纯D-氨基酸及20-70％的含有少量L-氨基酸的D-氨基酸(以下简称不纯物)，把不纯物用常规化学方法进行氨基乙酰或氯乙酰化，得到酰化氨基酸，酰化氨基酸用酶拆分，用常规化学手段分离可以完全去除L-氨基酸，又能得到一批D-氨基酸纯品，从而提高收率。
2.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，L-氨基酸是指L-丙氨酸(alanine)、L-缬氨酸(valine)、L-亮氨酸(leucine)、L-异亮氨酸(isoleucine)、L-苯丙氨酸(phenylalanine)、L-半胱氨酸(cysteine)、L-苏氨酸(threonine)、L-蛋氨酸(methionine)、L-丝氨酸(serine)、L-脯氨酸(proline)、L-酪氨酸(tyrosine)、L-色氨酸(tryptophan)、L-天冬氨酸(aspartic acid)、L-谷氨酸(glutamic acid)、L-赖氨酸(lysine)、L-精氨酸(arginine)、L-组氨酸(histidine)、L-谷氨酰胺(glutamine)、L-天冬酰胺(asparagine)中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，进行重氮化反应的温度是-30℃--50℃，其中最佳反应温是-5℃--15℃；本发明把α-D-卤代酸用氨水或液氨进行氨解的温度是-5℃--100℃，其中最佳反应温是0℃--75℃。
4.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，酸性环境是指重氮化反应进行时要用到酸，酸可以是无机酸或有机酸，常用的是无机酸，主要是硫酸、硝酸或氢卤酸，其用量为L-氨基酸摩尔量的1-10倍，最佳为2-5倍。
5.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，亚硝酸钠的用量为L-氨基酸摩尔量的1-5倍，最佳为1-3倍。
6.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，所用的卤素离子为氟、氯、溴、碘离子中的一种单独或几种共同使用，通常使用其无机盐如钠盐、钾盐、锂盐或直接使用氢卤酸如盐酸、氢溴酸，其用量为L-氨基酸摩尔量的1-10倍，最佳为2-5倍。
7.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，氨解用氨水或液氨，其用量为α-D-卤代酸重量的2-20倍，最佳为3-10倍。
8.根据权利要求1所述的D-氨基酸的制备新方法，其特征在于，酶为酰化酶或蛋白酶，酰化酶具体可用猪腰酰化酶及黄曲酰化酶，I型II型均可，蛋白酶主要枯草杆菌蛋白酶，酶用量为酰化氨基酸的1-10％，最佳为1-5％；用蛋白酶时把酰化氨基酸先形成甲酯后进行拆分。
全文摘要
本发明提供一种非天然氨基酸特别是D－氨基酸的制备新方法。该方法是应用化学合成技术，把廉价的天然的L－氨基酸通过重氮化反应再经过氨解、酶拆分的方法转变成非天然的D－氨基酸，该方法成本低、生产周期短，容易实现规模化生产。
文档编号C12P13/00GK1827588SQ20051002043
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月3日 优先权日2005年3月3日
发明者袁明龙, 袁明伟, 杜碧林, 朱延新, 郑玲 申请人:四川琢新生物材料研究有限公司