表皮生长因子受体(egfr)基因测序检测方法

专利名称：表皮生长因子受体(egfr)基因测序检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基因的检测方法，更准确地说本发明涉及一种表皮生长因子受体基因检测分析方法。属于分子生物学技术领域。
背景技术：
关于表皮生长因子受体(EGFR)及其小分子抑制剂基因靶向药物吉非替尼(gefitinib)，表皮生长因子受体家族是细胞信号传导系统的门户蛋白，于1950年首次分离成功。现已知有四个亚型，即Erb-B-1，Erb-B-2，Erb-B-3和Erb-B-4.，目前最著名的是Erb-B-1和Erb-B-2亚型，它们分别由Her1和Her2原癌基因产生，Her1即是产生EGFR的功能基因，Her2是产生Neu(Cerb-B2)的功能基因。EGFR在细胞内外有三个功能域，即细胞膜外区、跨膜区和胞浆区，前者以表皮生长因子EGF和转化生长因子-α(TGFα)为配体，后者有酪氨酸激酶活性，与配体结合后发生自身磷酸化，从而启动细胞信号传导瀑布反应。
EGFR与癌的发生和生长关系密切a、跨膜区和胞浆区氨基酸序列与逆转录病毒癌基因v-erb-B同源；b、多数肿瘤细胞过度表达EGFR1和EGFR2，并与恶性程度呈正相关。
c、许多肿瘤也过度表达EGFR配体TGF-α，二者共同促进肿瘤增殖，因此美国政府FDA在2003年5月批准了美国阿斯力康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物-EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(gefifinib，商品名Iressa，ZD1839)上市，我国在2005年2月批准其上市。它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，从而抑制了该激酶的活性，抑制肿瘤的生长、增殖，却无明显的化疗副作用等不良影响。中国目前尚未有检测EGFR基因突变后进行吉非替尼治疗的文献报导，但分析中国非小细胞肺癌患者该基因突变率明显高于欧美白人和黑人，成为该药在我国疗效明显的主要因素。分子靶向药物的研制，是基于癌症是起因于细胞DNA结构和功能异常的病因发病机制的认识，旨在寻找其特异的基因发病环节和靶点而针对性的精确治疗，但在临床应用上却一波三折，脱离常规，如Gleevec是最初针对Abl融合基因靶点而设计的治疗慢性粒细胞白血病的药物，其疗效却未达到理想设计要求，但在难以化疗的胃肠道间质瘤的治疗方面表现出神奇疗效，后来认识到该药物的靶点也作用于GIST的c-kit基因，更多的临床应用发现Gleevec的疗效与GIST的c-kit基因蛋白产物CD117的免疫组化表达阳性有关，所以现在对胃肠道间质瘤事先检测CD117表达是否阳性，已成为Gleevec分子靶向药物治疗的常规。而Gefitinib最初是由日本人依据其表皮生长因子受体抑制剂的逻辑原理，应用于上皮性恶性肿瘤特别是大肠癌的EGFR基因分子靶点和其内含子CA重复序列多变性基因治疗，但在临床应用发现，它对上皮性恶性肿瘤治疗，以非小细胞肺癌的控制肿瘤生长、减痛、止咳、止喘等效果明显，以后由美国、加拿大和日本临床医师们组织了更精细的科学的临床应用调查，但基于其靶向药物的机理，必须要找出肺非小细胞肺癌在基因水平上特别是EGFR基因靶点的发病和治疗环节的对应关系，最终由《science》和《新英格兰杂志》前后刊文并得出了几乎一致的结论非小细胞肺癌的EGFR外显子18、19和21存在着突变和大片段缺失，因而表达异常活跃，促使肿瘤增生，而Gefitinib临床作用于EGFR胞浆内ATP功能区并阻断其促肿瘤增生的作用，诱导其凋亡。该报告由世界最权威杂志发布，获得世界肿瘤界公认，于是很快获美国FDA批准应用于临床，短短数月，该药通过EAP计划已积累了3万9千人的数据。
由于吉非替尼的疗效与EGFR基因突变有关，而日本和中国人的EGFR突变率高于欧美和黑人数十倍，《science》刊文报道欧美和黑人非小细胞肺癌EGFR突变率仅2％，而日本达28％，美国I NTACT大规模临床用药结果显示该药对欧美和黑人运用范围极其有限，与化疗药物相比无疗效差异，就美国两亿人口，0.7‰的肺癌发病率计算，每年新增肺癌不足10万人，其中2％的吉非替尼药敏率，该药适用人数不足500人/年，而亚洲有10倍于美国的人口和10倍于美国药敏率，每年至少5万以上的药物适用人群，如每人耗资1万美金，就达到5亿美金/年的额度，再加之检测各种肿瘤的EGFR基因人口会达10倍于肺癌的药敏人口，国外公司在亚洲，中国可能获取的利润空间十分惊人，可达300亿/年人民币元之巨。吉非替尼疗效与EGFR基因突变直接相关，因此预检基因突变实施个体化治疗能够更有针对性，《science》在2004年4月记载，执行EAP计划的125例非小细胞肺癌患者中，选择5例有疗效，4例无疗效者，经基因测序检测，全部5例有效者存在EGFR外显子突变(L858R 2239-2247Del 2240-2257Del 2238-2255Del)，而4例无效者无一例突变。体外培养的对吉非替尼50倍敏感的肺癌的细胞株H2355也存在着L858R突变。《新英格兰杂志》在同期刊文对275例服用吉非替尼的非小细胞肺癌病例临床应用分析，有25人有临床疗效，其中9人检测EGFR全长密码子，发现8例存在突变，突变方式和位点与《science》报导和基本相同，而7例未显疗效者无一例突变发生。另16例有疗效者因针刺标本未能获得DNA而放弃检测。另一方面，未进行基因检测而在欧美进行了2600例大范围的联合健择和紫杉醇和卡铂治疗晚期非小细胞肺癌的III期临床试验(INTACT2)被证明患者生存率无明显改善，原因在于欧美非小细胞肺癌病人存在大量EGFR突变阴性人群(95-98％)，所以绝大多数临床工作者提出，吉非替尼服药前需预检非小细胞肺癌组织的EGFR基因突变，如有突变则疗效超过无突变者100倍。应视突变存在与否实施个体化治疗，因为长达16个月以上的用药将会怡误病情，耗资巨大，且有一定的副作用。
《science》刊文记述了16位未接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌患者，基因测序显示了各种EGFR基因突变，其中15位是日本人，均为肺腺癌，10人为女性。因此认为，EGFR突变及与吉非替尼治疗反应性，在日本和美国人间存在巨大差异，提示分子病理发病机制与种族、性别和病理类型有着明显的关系。日本人报道101例服用吉非替尼的非小细胞肺癌患者20人有效，总的有效率为19.8％，远高于欧美和黑人11.8％的有效率，而中国人执行EAP计划统计的有效率为22.2％，经过基因检测已发现在亚洲人肺腺癌和女性人群中EGFR的突变率14％-57％不等，远高于欧美人平均2％的低突变率，而日本人对277例肺癌EGFR基因测序，发现111例(40％)存在基因突变，其中52例19外显子缺失，54例21和18外显子点突变，5例有复制和插入。
我国EGFR基因突变检测现状与其它EGFR检测方法分析国际权威杂志《science》刊文，明确指出用免疫组化方法检测EGFR表达水平与吉非替尼治疗非小细胞肺癌无关，目前尚未见有类似的国内外文献，肯定免疫组化和ELISA方法检测EGFR蛋白水平与吉非替尼疗效有关，因此，用基因测序方法检测EGFR18、19和21外显子全长的DNA序列，成为预测吉非替尼疗效的肯定的方法。现有技术存在的问题和缺点表皮生长因子受体基因测序检测分析技术是在2004年4月首先由美国PaezJG和Lynch TJ分别在《science》和《新英格兰杂志》发布的，他们均是采用的NCBI数据库EGFR20条外显子全长的DNA基因，以巢式PCR方法扩增EGFR106条基因短片段，以相同的基因测序方法和仪器类型得到检测结果。
主要是发现了检测出EGFR第18外显子、第19外显子和第21外显子发生上述基因突变(第21外显子2497位T＞G突变，2504位A＞T突变例外，由发明人独自首先发现)。
上述发现解释了吉非替尼和Tarciva治疗非小细胞肺癌有疗效和无疗效的分子靶点机制，但是上述技术存在若干问题1、设计了EGFR外显子106条短片段可以更全面地检测序列，不至遗漏EGFR外显子DNA全长，但不能实际应用于临床检测应用，否则仅一例病人的EGFR基因常规外显子检测耗时将达1个月以上，耗资更相当可观。故发明人设计了三个完整的外显子片断包括了部份内含子、剪切子，调控区，既可完整检测上述EGFR外显子所报道的全部病变位点和突变方式，也可使PCR程序更为优化，提高检出率，更可让该项检测进入实际应用。
2、Paez JG和Lynch TJ公布的EGFR外显子检测方法，主要反应欧美高加索人种和黑人的基因状态，但基因事件已公认存在人种、地域等差异性，发明人设计的EGFR第18、19和21外显子基因片段，可以逐个从碱基和氨基酸水平与观察分析中国人特有的该基因序列特征和突变特点，发明人发现的第21外显子T＞G突变和A＞T及852位密码子始插入G突变是国内外均未见报道的新的杂合性突变，用于分析中国人靶向药物治疗具有针对性。
3、Paez JG和Lynch TG的EGFR外显子检测项目，仅是2004年新发现的基因检测技术，主要是用于实验研究。2004年底日本人利用总RNA提取技术进行CDNA PCR扩增，将该技术应用于临床病理科的分子病理基因检测，但该技术人工地额外增添了RNA-DNA逆转录PCR环节，有可能对杂合性单链基因突变事件增加假阳性污染或假阴性漏检，并增加了检测的时间和经费，且缺乏临床基因病理申请和报告书样本以及技术操作规范。
4、国内各医疗机构、医院部门尚未设立该项临床基因病理检测项目，甚至未能检索到医学、生物学实验室的EGFR外显子检测报告或数据。

发明内容
本发明的目的在于针对上面所述的现有技术的不足，提供一种表皮生长因子受体基因检测分析方法。
本发明是采取以下的技术方案来实现的表皮生长因子受体(EGFR)基因测序检测方法(1)检测材料和对象各种途径获取的非小细胞癌的体细胞组织，肺癌的石蜡包埋组织的切片，肺癌晚期转移灶组织和血液中的癌细胞、肺癌胸水和穿刺细胞、痰细胞；(2)使用试剂和仪器V-gene公司、Roche公司DNA提取的市售试剂盒promega PCR纯化市售试剂盒ABI测序市售试剂盒仪器DNA定量仪 电泳仪 自动凝胶显像系统 PCR仪 冷冻离心机 基因测序仪 基因分析软件(3)检测流程①首先对检测材料进行病理学技术制片，观察，出具病理诊断报告，备案，判断是否为非小细胞肺癌并病理分类，选定病灶区域后取材切片纳入基因测序检测；②组织前处理及抽提DNA，每批组设立肺癌周围组织对照；③DNA定量仪检测样本质量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波长处吸光率接近零)；
④使用已设定的引物(EGFR外显子18、19和21全长DNA序列)进行PCR扩增(Touchdown技术)；⑤凝胶自显影电泳观察分析PCR效果⑥PCR产物纯化⑦PCR产物进行测序反应⑧使用基因测序仪进行EGFR基因的测序和分析；如阴性结果时做双向测序检测；⑨依据病理诊断，临床检查治疗情况和序列分析结果进行综合评估，完成EGFR病理基因测序报告；(4)观察指标依据美国国立医学图书馆(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公开序列(NM-005228)和mRNA的序列，确定EGFR第18、19和21外显子全长片断；①EGFR第18外显子片段长度为437bp，序列见后述主要观察核苷酸2155G＞A突变，即氨基酸G719s改变②EGFR第19外显子片断长度为411bp，序列见后述主要观察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I759del缺失现象其它核苷酸片段缺失、插入、重复等现象，如氨基酸L747-T751insS，L747-P753insS和L747-A750del等；③EGFR第21外显子，片段长度为399bp，序列见后述主要观察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R突变核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)其它核苷酸杂合突变等现象如氨基酸L861Q突变；核苷酸第2556位插入碱基G(Q852)首先确定EGFR第18、19和21外显子基因碱基序列及其突变位点根据美国国立图书馆(www.NCBI.NLM.NI H.gov)公开提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，参照美国ABI公司Celerar数据库相关基因文献和《(science》2004、304(5676)1457-1500，Epub EGFR全基因组文献，本发明选定需要测序的EGFR基因外显子如下Exon18EGFR18外显子序列 ccgtgtcctggcacccaagcccatgccgtggctgctggtccccctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG CTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttactcttt Exon19EGFR19外显子序列
acccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA ACA CTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagctgctctgctct Exon21EGFR21外显子序列 atgaccctgaattcggatgcagagcttcttcccatgatgatctgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC GGCCAAACAGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttt 对上述基因片段的观察突变位点主要包括三方面(1)已报道的突变位点Exon 18核苷酸第2155位 G＞A突变 (G719S)Exon19 核苷酸第2235-2249缺失 (E746-A750del)核苷酸第2236-2250缺失 (E746-A750del)核苷酸第2254-2277缺失 (S752-I759del)核苷酸缺失(L747-T751insS)核苷酸缺失(L747-P753insS)核苷酸缺失(L747-A750del)
Exon21 核苷酸第2573 T＞G突变(L858R)核苷酸突变(L861Q)(2)中国人新发现的突变位点Exon21 核苷酸第2497位T＞G(L833V)核苷酸第2504位A＞T(H835L)核苷酸第2556位插入碱基G (Q852)(3)由发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变位点(5)设计引物依据上述EGFR基因片段，确定了EGFR第18、19和21外显子，利用Oligo软件独立设计相应的引物，并参考优化的PCR条件和测序适应性分析，合成引物序列如下18外显子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’19外显子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’21外显子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’(6)、提取模板DNA新鲜组织V-gene公司DNA提取试剂盒固定和石蜡Roche公司DNA提取试剂盒血液和液体细胞Promega公司DNA提取试剂盒以上均按说明书指示方法操作，以凝胶电泳系统检测DNA模板和质量，然后用eppendorf核酸定量仪测定DNA浓度，选择dsDNA为测定目标，260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0的样本作为适用模板；(7)、PCR扩增和纯化对获取的符合条件DNA模板，以touch down技术扩增目的基因片段，反应体系如下PCR体系(总体系20μl)10×PCR Buffer(含15mM MgCl2×)2μl，HotStarTaq DNA Polymerase(QI AGEN公司)0.2μl ，5×Q-Solution 4μl ，dNTP mix(10mM of each)2μl ，Primer 1 1μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ，Distilled water8.8μl ；PCR条件置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，用TouchdownPCR，94℃变性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后于72℃延伸10min；PCR产物质量控制PCR反应产物要求条带单一，浓度30-100ngPCR酶应用QIAGEN公司HotStarTaq DNA Polymerase、ABI公司金牌酶及优质的国内外其它酶；PCR产物纯化A、过柱纯化上海生物工程公司纯化试剂盒
Promega公司PCR纯化试剂盒Qiagen公司PCR纯化试剂盒B、酒精/EDTA纯化产物纯化后凝胶显像电泳评估纯化质量，编号、存档(-80℃)C、测序反应及纯化因目前所知的EGFR第18、19和21外显子均为杂合突变、缺失，故将10um的正反向引物均稀释到1um，按下列体系添加反应物1ul BigDye(2.5X)+1.5 ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物+1ulPCR纯化产物+3.5ul ddH2O；(8)、测序结果分析和报告测序结果形成书面报告操作人和鉴报告人签字、注期，并附上原始测序电泳图、序列图交给临床或患方；(9)、档案处理登记所有检测对象均填写登记申请单，注明病史、病理诊断、复查HE切片；全部DNA模板，PCR纯化产物均编号-80度超低温保存备查。
EGFR基因外显子检测，主要的发明目的和要解决的任务如下(一)所有的非小细胞肺癌临床药物应用疗效分析表明吉非替尼和Tarciva显效者均有高达70％-90％的EGFR外显子突变率，而无效者相应的突变率几乎为零，所以临床用药前，预检EGFR基因突变存在与否是解决针对性个体化治疗的有效方法。
(二)EGFR基因外显子检测，必须由实验研究转化、开发可操作的临床应用性检测项目，国外Paez JG等设计的检测方法，采用28个EGFR全部外显子，设计了106对DNA碱基短片段，进行DNA双链正向和反向的检测，这在实验研究阶段进行系统而全面的探索是必要的，但进行临床检测将会形成天文数字的工作量和经费，经发明人研究，综合各方报道，已明确Exon18有G＞A突变(G719S)，Exon 19有E746-A750del，S752-I759del，L747-T751insS，L747-P753insS，L747-A750del。Exon 21有L858R、L861Q、2497位T＞G突变和2504A＞T突变，核苷酸第2556位插入碱基G(Q852)，发明人设计的外显子片段，包容了上述全部观察点，简缩成3对外显子片段；在单一链无阳性序列发现后再测量另一DNA链，首先使该项目临床病理检测在技术上可行。
本申请内容属于基因检测技术方法项目，其原理是1、治疗非小细胞肺癌的分子靶向药物是不同于传统化疗的里程碑式的发明，但有EGFR基因突变者用吉非替尼治疗70％-90％会有疗效，其效率高于EGFR基因突变阴性者100倍。
2、应用吉非替尼治疗非小细胞肺癌，国内外资产显示对亚洲人疗效最好，主要原因是亚洲人EGFR基因突变率在世界上最高。
3、该类药物2004年通过FDA申批，2005年3月即将进入中国，而国内在应用发明之前尚未有该项检测项目的研究临床应用。
4、中国人的EGFR基因有自身的特征，国人的类似基因突变检测项目反应中国特色。
发明应用对象和材料1、应用对象适用于非小细胞肺癌患者肿瘤体细胞的EGFR基因突变测序检测。
2、使用材料指离体的肿瘤新鲜组织、细胞、痰液、肿瘤蜡块，已固定组织，血液转移细胞、穿刺组织细胞、转移灶组织细胞等可检测材料。
工艺条件1、环境条件DNA模板提取PCR扩增和测序反应必须分区或分室操作，严防交叉污染，规范污染物处理。
2、人员条件相关操作人员须经《国家实验室认可制度》培训班培训合格，具有病理执业医师资格硕士研究生毕业以上，临床病理诊断从业三年以上，有分子病理实验基础。
3、硬件条件DNA分光光度定量仪，自动凝胶显像仪，测序级PCR扩增仪，电泳仪，冷冻离心机，高速离心机，DNA分析仪(基因测序仪)，宽带互联网。
4、软件条件具有熟练的分子生物和分子病理知识技能查阅NCBI和相关文献库会使用3100-AvantDate Collection 2.0软件运行测序仪会分析DNA sequencing analysis 5.1软件分析原始数据DNA seqScape软件自动比较基因突变DNA star seqman软件手工比较基因突变纳入标准1、病理诊断标准肺非小细胞癌肠腺癌脾癌乳腺癌前列腺癌肾细胞癌胰腺癌食道癌甲状腺癌头颈部癌2、观察基因突变纳入标准(1)目前已报道的8个突变位点和异常现象G719S E746-A750del S752-I759del L747-T751insS L747-P753insS L747-A750delL858R L861Q(2)发明人发现的以下突变位点Exon21T＞G(L833V)A＞T(H835L)核苷酸第2556位插入碱基G(Q852)(3)发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变和异常现象.
有益效果(一)EGFR基因突变测序检测可以明确预报分子靶向药物治疗非小细胞肺癌的良好疗效。
1、2004年《science》刊文在125例非小细胞肺癌患者中对吉非替尼治疗有效的5例全部存在EGFR外显子18、19和21的突变(100％)，而无效的4例患者无一例存在上述突变，在体外细胞培养实验中显示对吉非替尼抗癌疗效是50倍高敏感的非小细胞肺腺癌株H2355，也具有EGFR第21外显子的L858R突变。
2、同期《新英格兰杂志》刊文，在275例非小细胞肺癌病例，对选择9例有疗效者检测EGFR基因外显子18、19和21发现8例存在突变(88％)而7例治疗无效者无一例发生上述突变。
(二)EGFR基因突变检测对亚洲人更有效1、上述《science》和《新英格兰杂志》均报道了日本人的EGFR基因突变率为26％，而美国人和黑人相应突变率均只有2％，而两个大型的Iressa(易瑞沙)单药II期临床治疗非小细胞肺癌的国际大规模研究(IDEAL I和II)对亚洲女性腺癌更有效，而随后的国际更大型EAP计划中，日本108例和中国238例的疗效率分别是19.8％和22.2％，欧美人种的相应疗效率仅11.8％。227例日本人肺癌的EGFR基因突变率为40％，远高于欧美人种。
2、相反，近期的INTACT项目对2600例非小细胞肺癌未测EGFR基因突变和未作人种、地域的分组，仅作了吉非替尼与健择、顺铂、紫杉醇、卡铂联合用药，与非联合用药比较，未显示出吉非替尼单药疗效的差异性，有力说明不做这项基因检测盲目服药未见疗效。
(三)检测EGFR基因突变后再决定是否服药，可明显控制吉非替尼的不良副作用减少不必要的经济负担。
1、各种国内外文献均显示靶向药物吉非替尼治疗非小细胞肺癌比各种化疗药物毒副作用明显降低。一般仅有腹泻、皮疹、重症者可有间质性肺炎，如滥用也可致死，日本曾报道滥用该药有14例间质性肺炎死亡的病例。所以检测基因是否存在突变后用药可减少副作用。
2、吉非替尼国内尚未引进，更不能生产，用药者需耗昂贵的价格从国外购入($80元/颗)，因该药主要是对晚期肺癌减少胸痛、咳喘起控制病情急剧恶化的作用，故需长期服药达16-18个月，检测是否存在基因突变后用药，可减少国家和患者巨大的经济负担。
(四)本技术方法是实验技术转化应用到临床检测的重大创新1、无论是《science》和《新英格兰杂志》均是200多短片段进行巢式PCR EGFR全长基因组检测，这在实验科研方法是必须的，但在临床上是不能投入应用的，发明人设计了EGFR基因第18、19和21外显子有针对性的观察序列，使冗长繁琐的检测变致简洁、可观察到目前各国报道的全部突变位点，并结合了临床病理切片观察更具科学性。
2、发明人设计的基因观察序列片段，不仅可以观察已有的基因突变情况，还能检查出中国人特有的或未曾报道的EGFR突变方式，比如已经在一例男性肺腺癌体细胞发现EGFR基因第21外显子T＞G、A＞T杂合性突变，未见国内外资料报道。
3、病理基因检测项目在国外发达国家已经比较普遍应用于临床，除发明人所在单位外我国尚未见医疗机构有类似的临床应用项目进入常规诊疗服务。


图1是本发明的EGFR测序效果图
具体实施例方式一、取材核对患者姓名某某，病理号0406013，病理诊断为肺腺癌。取其肺癌标本蜡块，经常规切片HE染色后显微镜下观察，确保病灶癌组织区域结构清晰，无自溶、坏死和大片出血后切取10μm厚切片6片。
二、DNA的提取用Roche公司石蜡基因组DNA提取试剂盒，按说明提取DNA。
三、DNA质量鉴定先用eppendorf核酸定量仪测定提取后DNA浓度。(260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0)，然后在1％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，以JD-801凝胶电泳图象分析系统显示单一、明亮条带为合格模板。
四、PCR扩增1、引物的设计与合成根据NCBI相关文献提供的研究结果，确定EGFR目的基因片断(见上述)，利用genebank上提供的序列，通过Oligo软件设计引物，并进行测序适应性评估，由上海生物工程公司合成。序列为18外显子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外显子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’21外显子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC 3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’2、PCR反应体系(总体系20μl)10×PCR Buffer(含15mMMgCl2×)2μl，HotStarTaq DNA Polymerase(QIAGEN公司)0.2μ1，5×Q-Solution 4μl ，dNTP mix(10mM of each)2μl ，Primer 1 1μl ，Primer 2 1μl ，模板DNA 1μl ，Distilled water 8.8μl 。
3、PCR反应条件置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，用TouchdownPCR，94℃变性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后于72℃延伸10min。
4、PCR产物纯化用1.5％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，根据Promega公司提供的PCR纯化试剂盒，对PCR产物过柱纯化后，进行测序反应。
五、测序反应1、反应体系1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物(1pmol/ul)+1ulPCR纯化产物(3-10ng)+3.5ul ddH2O。(确保Bi gDye的终浓度为1X)2、测序PCR热循环条件96℃，10sec→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)×25个循环→60℃，4min→4℃保温3、测序反应后纯化
1)每管加入1μL 125mM EDTA到管底，再加入1μL 3M NaAc。
2)每管加入25μL 100％酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15min。
3)1600×g离心45min，马上倒置96孔ABI板，离心至185×g停止离心。
4)每管加入35μL 70％酒精，1650×g 4℃离心15min(JOUAN-BR4i)；马上倒置96孔板，离心至185×g停止离心。
5)重复第4步1次。
6)室温挥发净酒精，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA；7)样品在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min。
4、基因测序1)测序电泳前，在数据采集(Datecollection2.0)软件中选择正确的运行模块和分析模块。
2)样品制备，上样至3100-Avant遗传分析仪进行测序。
3)Datecollection软件自动进行数据处理和分析。
六、结果分析将测序结果用DNA sequencing analysis5.1自动分析原始测序数据，获取测序电泳图和序列。将样品序列用DNA star seqman与标准序列进行比对，观察样本基因序列观察样品是否存在突变或缺失等改变。
七、测序结果基因检测申请单及报告表省中医院病理科DNA基因测序申请单某某中医药大学附属医院联号 检测号G050035


注意1.取材或抽取不凝血后立即送病理科，不需固定，贴好标签。
2.检测结果需参考病理诊断咨询医师。
3.如对检测结果有疑问，请与病理科联系。
联号联号联号联号


江苏省中医院病理科DNA基因测序报告单某某中医药大学附属医院基因测序检测号G050035

注1.组织细胞基因测序结果需参考病理诊断评估。
2.测序结果可咨询临床和病理医师。
权利要求
1.表皮生长因子受体(EGFR)基因测序检测方法，它包括下列步骤(1)检测材料和对象各种途径获取的非小细胞癌的体细胞组织、肺癌的石蜡包埋组织的切片、肺癌晚期转移灶组织和血液中的癌细胞、肺癌胸水和穿刺细胞或痰细胞；(2)使用试剂和仪器DNA提取的试剂盒PCR纯化试剂盒ABI测序试剂盒仪器DNA 定量仪 电泳仪 自动凝胶显像系统 PCR仪 冷冻离心机 基因测序仪 基因分析软件(3)检测流程首先对检测材料进行病理学技术制片，观察，出具病理诊断报告；备案，判断是否为非小细胞肺癌并病理分类，选定病灶区域后取材切片纳入基因测序检测；组织前处理及抽提DNA，每批组设立肺癌周围组织对照；DNA定量仪检测样本质量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波长处吸光率接近零)；使用已设定的引物(EGFR外显子18、19和21全长DNA序列)进行PCR扩增；凝胶自显影电泳观察分析PCR效果；PCR产物纯化；PCR产物进行测序反应；使用基因测序仪进行EGFR基因的测序和分析；如阴性结果时做双向测序检测；依据病理诊断，临床检查治疗情况和序列分析结果进行综合评估；完成EGFR病理基因测序报告；(4)观察指标依据美国国立医学图书馆(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公开序列(NM-005228)和mRNA的序列，确定EGFR第18、19和21外显子全长片断；①EGFR第18外显子片段长度为437bp，主要观察核苷酸2155G＞A突变，即氨基酸G719s改变②EGFR第19外显子片断长度为411bp，主要观察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失现象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I 759del缺失现象其它核苷酸片段缺失、插入、重复现象，如氨基酸L747-T75linsS，L747-P753insS和L747-A750del；③EGFR第21外显子，片段长度为399bp，主要观察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R现象改变核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)核苷酸q852其它核苷酸杂合突变现象，如氨基酸L861Q改变；首先确定EGFR第18、19和21外显子基因碱基序列及其突变位点根据美国国立图书馆(www.NCB5.NLM.NIH.gov)公开提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，参照美国ABI公司Cerelar数据库相关基因文献和《science》2004、304(5676)1457-1500，Epub EGFR全基因组文献，本发明选定需要测序的EGFR基因外显子如下Exon18EGFR18外显子序列 cctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAA GTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttac Exon19EGFR19外显子序列 cagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT Exon21EGFR21显子序列 tgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCAC AAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcc 对上述基因片段的观察突变位点主要包括三方面(1)已报道的突变位点Exon18核苷酸第2155位 G＞A突变 (G719S)Exon19核苷酸第2235-2249缺失 (E746-A750del)核苷酸第2236-2250缺失 (E746-A75 0del)核苷酸第2254-2277缺失 (S752-I759del)核苷酸缺失(L747-T751insS)核苷酸缺失(L747-P753insS)核苷酸缺失(L747-A750del)Exon21核苷酸第2573 T＞G突变 (L858R)核苷酸突变(L861Q)(2)中国人的突变位点Exon21核苷酸第2497位 T＞G (L833V)核苷酸第2504位 A＞T (H835L)核苷酸第2556位插入碱基G (Q852)(3)由发明人发现的EGFR18、19和21外显子新突变位点(4)设计引物依据上述EGFR基因片段，确定了EGFR第18、19和21外显子，利用Oligo软件独立设计相应的引物，并参考优化的PCR条件和测序适应性分析，合成引物序列如下
18外显子 上游引物5’TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG 3’下游引物5’TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC 3’
19外显子 上游引物5’GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC 3’下游引物5’TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT 3’
21外显子 上游引物5’GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC3’下游引物5’CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT 3’(5)、提取模板DNA新鲜组织用DNA提取试剂盒固定和石蜡用DNA提取试剂盒血液和液体细胞用DNA提取试剂盒以上均按说明书指示方法操作，以凝胶电泳系统检测DNA模板和质量，然后用核酸定量仪测定DNA浓度，选择dsDNA为测定目标，260nm吸光率大于0.05以上(DNA含量大于2.0ug/ul)，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0的样本作为适用模板；(6)、PCR扩增和纯化对获取的符合条件DNA模板，以扩增目的基因片段，反应体系如下PCR体系(总体系20μl)10×PCR Buffer(含15mM MgCl2x)2μ1，HotStarTaq DNA Polymerase 0.2μl，5×Q-Solution 4μ1，dNTP mix(10mM of each)2μl，Primerl 1μl，Primer21μl，模板DNA 1μl，Distilled water 8.8μl；PCR条件置扩增仪中95℃预变性15min，用TouchdownPCR，94℃变性50sec，63℃-58℃退火1min(-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后于72℃延伸10min；PCR产物质量控制PCR反应产物要求条带单一，浓度30-100ng；PCR产物纯化A、过柱纯化分别使用纯化试剂盒和PCR纯化试剂盒B、酒精/EDTA纯化产物纯化后凝胶显像电泳评估纯化质量，编号、存档(-80℃)C、测序反应及纯化因目前所知的EGFR第18、19和21外显子均为杂合突变、缺失，故将10um的正反向引物均稀释到1um，按下列体系添加反应物1ul BigDye(2.5X)+1.5ul BigDye Seq Buffer(5X)+3ul引物+1ulPCR纯化产物+3.5ul ddH2O；(7)、测序结果分析和报告测序结果形成书面报告操作人和报告人签字、注期，并附上原始测序电泳图；(8)、档案处理登记所有检测对象均填写登记申请单，注明病史、病理诊断、复查HE切片；全部DNA模板，PCR纯化产物均编号-80度超低温保存备查。
全文摘要
本发明涉及一种表皮生长因子受体基因检测分析方法，属于分子生物学技术社会应用领域。本发明设计的EGFR第18、19和21外显子基因片段，可以逐个从碱基和氨基酸水平与观察分析中国人特有的该基因序列特征和突变特点，本发明人发现的第21外显子T＞G突变和A＞T及852位密码子始插入G突变是国内外均未见报道的新的杂合性突变，用于鉴定中国人靶向药物治疗，具有针对性。本发明提供了一种检测EGFR基因突变的检测方法，检测后再决定是否服药，可明显控制吉非替尼的不良副作用，减少不必要的经济负担，提示非小细胞肺癌分子靶向药物治疗的良好效果。
文档编号C12Q1/68GK1737162SQ200510038448
公开日2006年2月22日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者赖仁胜, 谢玲, 申龙树, 朱长乐 申请人:南京中医药大学附属医院(江苏省中医院), 赖仁胜, 谢玲