专利名称：具有丙烯酸降解活性的红平红球菌lg12及使用其除去丙烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种具有丙烯酸降解活性和抗丙烯酸性的新型菌株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)LG12，以及使用该菌株从包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。
背景技术：
由现有技术可知，降解丙烯酸的微生物包括如假单胞菌(Pseudomonas sp.)的细菌和如地霉(Geotrichum sp.)、木霉(Trichodermasp.)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)和丝衣菌(Byssochlamys sp.)的霉菌。公知细菌在相对简单的环境中生长，并容易培养细菌，但是不能在例如高于10g/L(1wt％)的高丙烯酸浓度下生长。例如，假单胞菌在大于1.5g/L的丙烯酸浓度下显示出生长抑制(Shanker，R.，Arch.Microbiol.，154192，1990；Bringmann & Kuhn，Water Research，14231，1980)。
公知霉菌在相对高的丙烯酸浓度中生长。例如，地霉和木霉在10天内降解1wt％的丙烯酸(Heena Dave，Biotechnology letters，18963，1996)。另外，公知皱褶假丝酵母在4天内降解2wt％的丙烯酸(Hasegawa，J.，J.Ferment.Technol.，60591，1992)，丝衣菌在14天内降解7wt％的丙烯酸(Kazuhiro Takamizawa，Appl.Microbiol.Biotech.，40196，1993)。采用这些霉菌降解丙烯酸的缺点在于，其需要相对长的降解时间、菌株生长的复杂条件和长的培养时间。另一缺点在于，因为没有建立霉菌的转化方法，所以不易制备霉菌的重组菌株。
同时，红球菌(Rhodococcus sp.)是革兰氏阳性菌，且属于诺卡菌形放线菌(nocardioform Actinomycetes)。在现有技术中，红球菌用于将如丙烯腈的腈化合物转化为如丙烯酸的酸。例如，美国专利第5,135,858号公开了使用紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1将如丙烯腈的腈化合物转化为如丙烯酸的酸的方法。但是，丙烯酸聚集在培养基中，不能被紫红红球菌J-1降解。因此，还未得知可降解丙烯酸的红球菌(Rhodococcus sp.)微生物。
发明内容
技术问题因此，仍存在对这样一种微生物的需求该微生物需要如细菌一样的简单的生长条件，快速生长，具有抗丙烯酸性，并且能快速降解丙烯酸。因此，本发明人作出努力，以发现能够使用丙烯酸为碳源降解丙烯酸，结果发现了属于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的菌株，其既便在高浓度丙烯酸下也能生长，并且可以迅速降解丙烯酸，从而完成本发明。
技术方案因此，本发明的一个目的是提供一种属于红平红球菌的菌株，其具有丙烯酸降解活性，并且抗高浓度丙烯酸。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述菌株从包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。
为实现上述目的，在一个技术方案中，本发明提供一种具有丙烯酸降解活性的抗丙烯酸红平红球菌菌株。在本发明中，该菌株的保藏编号为KCTC 18102P。
属于红平红球菌的菌株的本发明微生物具有抗丙烯酸性，并且具有降解丙烯酸的活性。与属于例如大肠杆菌(Escherichia sp.)、假单胞菌、杆状菌(Bacillus sp.)和念球菌(Candida sp.)的其它种的微生物相比，本发明菌株具有非常高的丙烯酸降解活性。另外，本发明菌株具有抗丙烯酸性，并且即使在高浓度丙烯酸中也能生长。本发明菌株甚至可在小于5wt％的丙烯酸浓度下生长，优选1～4wt％下生长。
此处使用的术语“丙烯酸降解活性”意为该菌株能在包含丙烯酸的培养基中使用丙烯酸作为碳源，同化或异化丙烯酸，从而降低培养基中丙烯酸的浓度。
在另一技术方案中，本发明提供一种从包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，该方法包含如下步骤将红平红球菌菌株或其培养液与包含丙烯酸的污染物混和；以及培养该混合物。
在本发明方法中，除丙烯酸包含在培养基中外，菌株的培养条件与本技术领域公知的条件相同。任何包含丙烯酸的污染物可用作包含丙烯酸的污染物。包含丙烯酸的污染物的例子包括丙烯酸本身、以及包含丙烯酸的溶液、污水、废水等从下面的详细描述和所附权利要求中，本发明的上述和其它特征、以及实施方案将会更加显而易见。
图1显示根据本发明分离的12HPL菌株的扫描电子显微镜照片。
图2显示通过寻找与根据本发明分离的12HPL菌株的16S rRNA的1,454bp核苷酸序列的同源性而获得的系统树。
图3显示各包含1wt％、2wt％和4wt％丙烯酸的培养基中，本发明的红平红球菌LG12菌株的丙烯酸降解活性。
图4显示向本发明的红平红球菌LG12菌株的培养基中加入丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸后，各酸的残余量的测试结果。
具体实施例方式
下文将通过实施例更详细地描述本发明。但是，应该能够理解，这些实施例仅仅是说明的目的，其不意味着限制本发明的范围。
实施例1使用丙烯酸作为碳源从土壤中分离微生物收集韩国全罗北道井邑市公路附近的土壤，并在室温下干燥24小时。1.0g干燥的土壤样品加入到含5ml的丙烯酸(2mM)的20ml液体培养基(见表1和2；在下述过程也是相同的)的50ml挡板烧瓶(baffle flask)中，并在200rpm、30℃的振荡培养箱中培养3天。然后，1ml的培养液加入到20ml的新制的液体培养基中，在上述相同的条件下培养。这一过程重复三次，然后，培养物涂覆在LB平板培养基上，并在30℃培养。完成培养后，使用丙烯酸作为碳源的新型菌株从LB平板培养基的菌落中分离出来，并命名为“2HPL”。
包含丙烯酸的液体培养基的组成
痕量金属溶液和维生素溶液的组成
丙烯酸加入到液体培养基时，用氢氧化钙(Ca(OH)2)中和培养基，并在引入前通过0.22mm的滤膜过滤。
实施例2鉴别分离的12HPL菌株在本实施例中，实施例1分离的12HPL菌株用电子显微镜和分子生物法鉴别。
(1)电子显微镜的的形态学特性首先将12HPL菌株涂覆在LB平板培养基上，并在30℃下培养3天。然后，用扫描电子显微镜观察培养物的形态特征(图1)。图1显示12HPL菌株的扫描电子显微镜照片。如图1所示，12HPL菌株具有现有技术中公知的通常在红球菌(Rhodococcus sp.)中可观察到的长圆柱形的特征。
(2)通过与16S rRNA核苷酸序列同源性比较的分类首先，使用Wizard基因DNA纯化试剂盒(Promega公司，商品目录号A1120)，从12HPL菌株中分离染色体。然后，通过使用分离的染色体作为模板、具有引物HK12(序列识别号1)和HK13(序列识别号2)的PCR扩增16S rRNA(Qiong Cheng，J.Bacteriol.，1824744，2000)。PCR反应在如下条件下进行加入HK12引物，在95℃预变性5min，各包括95℃变性1min、50℃退火1min和72℃聚合1分30秒的10次循环，然后，加入HK13引物，在上述相同的条件下进行30次循环。向PCR反应混合物中加入200mM dNTP、1.5mM MgCl2、10ml 10x缓冲液、50ng模板DNA、5单位Taq聚合酶、0.1单位pfu聚合酶、20pmole的各引物，和加入水以使最终体积为100ml。
获得的16S rRNA PCR产物插入到pGEM T-easy载体(Promega公司)中，然后测定从重组pGEM T-easy载体得到的16S rDNA的1,454bp核苷酸序列。然后，使用Clustal XTM程序分析1,454bp核苷酸序列的系统树(图2)。图2显示通过本发明的12HPL菌株与16S rRNA的1,454bp核苷酸序列之间的同源性探究获得的系统树。如图2所示，确定在本发明中分离的12HPL菌株与红平红球菌菌株具有大于99％的同源性。
形态学特征的电子显微镜分析结果和通过与16S rRNA的同源性探究的系统分类表明，本发明的12HPL菌株是属于红平红球菌的新型菌株，可同化丙烯酸，并具有抗丙烯酸性。结果，发明的12HPL菌株命名为红平红球菌LG12(Rhodococcus erythropolis LG12)，于2004年5月19日在国际保藏单位韩国典型培养物保藏中心(KCTC)以保藏编号KCTC 18102P保藏。
实施例3测定红平红球菌LG12的丙烯酸降解活性在本实施例中，与其它多种微生物相比较，分析红平红球菌LG12的丙烯酸降解活性。
在LB平板培养基上培养的各微生物菌落在3ml的YEPD液体培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中接种并培养。将0.3ml获得培养物加入到包含3ml YEPD液体培养基的15ml一次性试管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振荡培养箱中培养2天。然后，将丙烯酸加入到培养基中，使得最后的浓度为1％，1天后，用高效液相色谱(HPLC)(Waters公司)分析残留的丙烯酸浓度。液相色谱中的流动相为水和乙腈的7∶3的混合物，溶剂的流速为1ml/min，使用Capcel PAK C18柱子，在210nm下检测。微生物的丙烯酸降解活性的分析结果如下表3所示。
在表3中，相对于以本发明的红平红球菌LG12菌株的丙烯酸降解活性为100％，显示了各种微生物菌株的丙烯酸降解活性。如表3所示，不仅与如假单胞菌、念球菌、大肠杆菌和杆状菌的属于其它属的微生物相比，甚至与红球菌属的其它种相比，红平红球菌LG12菌株都具有非常高的丙烯酸降解活性。
红平红球菌LG12与其它多种菌株的丙烯酸降解活性
实施例4测定红平红球菌LG12的丙烯酸降解活性在本实施例中，在各种条件下测定红平红球菌LG12的丙烯酸降解活性。
首先，使本发明的红平红球菌LG12菌株在YEPD固体培养基上生长，以获得单菌落。将该菌落加入到包含3ml YEPD液体培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)的15ml培养管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振荡培养箱(Jeio技术有限公司)中培养1～2天。当培养基的OD600达到30时，将丙烯酸加入到培养基中，以使最终的浓度为1wt％、2wt％和4wt％，继续培养，同时在各反应时间分析残留的丙烯酸量。
另外，为检测丙烯酸对菌株的丙烯酸降解活性的诱导效应，当在YEPD液体培养基中培养的过程中，菌株的生长达到OD600为15时，将丙烯酸加入到培养基中，以使最终的浓度为0.1wt％。然后，继续培养，直到菌株的生长达到OD600为30。在该培养过程中，其它条件与上述相同。以实施例3相同的方式使用HPLC进行丙烯酸的分析(图3)。
图3显示在各包含1wt％、2wt％和4wt％的丙烯酸的培养基中红平红球菌LG12的丙烯酸降解活性。如图3所示，作为在菌株培养期间加入丙烯酸的结果，本发明的菌株显示出增加丙烯酸降解的诱导效应，甚至对4wt％的丙烯酸具有抗酸性，并能在大约4天内降解4wt％的丙烯酸。
实施例5检验红平红球菌LG12对丙烯酸降解活性的特异性在本实施例中，研究本发明的红平红球菌LG12菌株是否在各化合物中特定地降解丙烯酸。
使发明的红平红球菌LG12菌株在YEPD固体培养基上生长，以获得单菌落。然后，该单菌落接种到包含3ml的YEPD液体培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)的15ml的培养管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振荡培养箱(Jeio技术有限公司)中培养，直到OD600达到30。然后，分别将丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸加入到培养基中，以使最终的浓度为0.5wt％。加入后，在一定间隔测定残留化合物的浓度。采用实施例3相同的方法，使用HPLC测定上述化合物的浓度(图4)。
图4显示向本发明的红平红球菌LG12菌株的培养液中加入丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸后，各酸的残余量。由图4可知，在具有相似化学结构的化合物中，丙烯酸的残留量特定地且明显地被降低。这一结果表明，本发明的红平红球菌LG12菌株特定地降解丙烯酸。
尽管已参考具体特点描述本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，本说明书只是优选的实施方案，其不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求和其等同物所限定。
工业应用性如上所述，根据本发明的红平红球菌LG12菌株不仅具有丙烯酸降解活性，而且具有抗高浓度丙烯酸性，因此可用于有效地从包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸。
序列表<110>LG化学株式会社(LG CHEM，LID.)<120>具有丙烯酸降解活性的红平红球菌LG12及使用其除去丙烯酸的方法<130>IP06-1033-XC15<140>PCT/KR2005/003063<141>2005-09-15<150>KR 10-2004-0073916<151>2004-09-15<160>2<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>正向引物<400>1gagtttgatc ctggctcag 19<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2taccttgtta cgactt 1权利要求
1.一种具有丙烯酸降解活性的抗丙烯酸红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)菌株。
2.如权利要求1所述的抗丙烯酸红平红球菌菌株，其中所述菌株的保藏编号为KCTC 18102P。
3.如权利要求1所述的抗丙烯酸红平红球菌菌株，其中所述菌株能在1～5wt％的丙烯酸浓度下生长。
4.一种从含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，该方法包括以下步骤将含丙烯酸的污染物与权利要求1～3任意一项所述的红平红球菌菌株或其培养液混和；和培养该混合物。
5.从含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，其中含丙烯酸的污染物为含丙烯酸的污水或废水。
全文摘要
本发明涉及一种具有丙烯酸降解活性和抗丙烯酸性的新型菌株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)LG12，及使用该菌株从含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。根据本发明的菌株不但具有丙烯酸降解活性，而且具有抗高浓度丙烯酸性，因此可用于从含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸。
文档编号C12N1/20GK1914312SQ200580003225
公开日2007年2月14日 申请日期2005年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者李相贤, 赵俊衡, 朴五镇, 李周远, 朴时载 申请人:Lg化学株式会社