短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法

专利名称：：短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法
技术领域：
：本发明涉及短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法，详细地，涉及用于通过在微生物等细胞中导入短链脂肪酸抗性基因使之表达、来育种短链脂肪酸抗性提高的细胞的方法、以及作为通过该方法获得的微生物细胞的应有的、用于生产有用物质的高密度菌体培养法和含有短链脂肪酸的发酵液的有效制备。
背景技术：
：以往，在微生物工业培养时，在培养基中添加作为营养源的葡萄糖等碳源、蛋白胨等氮源、硫酸盐或磷酸盐、钠等无机物质、钙或锌等微量元素、嘌呤、嘧啶等生长因子等营养源。不过，如果这些营养源由于微生物的增殖而被消耗的话，微生物在培养基中生成甲酸和醋酸等对微生物的生长存在毒性的短链脂肪酸，其结果是，当然存在微生物的生长停止这样的问题。尤其是，在重组蛋白质生产中常常使用的大肠杆菌(Escherichiacoli)在以高密度好氧性发酵中，可以作为宿主菌广泛使用。在进行大肠杆菌的好氧高密度培养时，一般在增殖培养基中添加适量的葡萄糖，因此在培养中生成以醋酸作为主要成分的短链脂肪酸。这些短链脂肪酸是抑制高密度培养的主要原因，还抑制重组蛋白质的生成(参照例如，非专利文献1和非专利文献2)。为了解决这个问题，可以使用在微生物的培养中，对应于培养时间的推进，向培养基中连续地或间歇地流加营养源的流加培养法(例如，参照非专利文献3)和用透析膜等将菌体外的产物除去到培养系外的透析培养法(例如，参照非专利文献4)等。如果按照流加培养法，可以任意控制培养基中的特定成分的浓度，例如，可以将糖浓度稳定地保持在用该培养基中培养的微生物的最适范围内。因此，可以有效培养目的微生物，并广泛进行应用。不过，该流加培养法中，无法抑制有机酸的生成，常发生生成的有机酸导致的增殖率降低以及重组蛋白质的产量降低等问题。而且，在透析培养中，通过除去菌体外的产物，可以减少生成的短链脂肪酸的影响，不过仍然存在由于装置特殊，而造成工程复杂化的问题。而且，在大肠杆菌中，好氧条件下的葡萄糖代谢中，添加超过TCA循环处理能力的量的碳源的情况下，醋酸排出到生成醋酸的细胞外，由此导致生长抑制和重组蛋白质的生成抑制(例如，参照非专利文献5)。由于醋酸是由磷酸转乙酰酶(PTA)和醋酸激酶(ACK)从乙酰-CoA生物合成的，在非专利文献5中，制备了大肠杆菌的这些酶(PTA和ACK)基因的缺失变异林。不过，在这些变异林中，即使失活醋酸的生物合成系统(PTA和ACK),由于用于生成醋酸的其它途径依然存在，因此虽然使醋酸的生成量降低，也不能使其完全不生成。而且，上述缺失变异林过剩地积累了乳酸和丙酮酸等醋酸以外的有机酸(例如，参照非专利文献6和非专利文献7)。这样一来，正在对下述微生物进行开发，所述微生物能够完全不生成在微生物培养时所生成的甲酸和醋酸等对生长有害的短链脂肪酸，这一开发还未成功。另一方面，在想要在工业上生产这些短链脂肪酸时，希望开发通过微生物的发酵可以有效地大量生产短链脂肪酸的方法。这种情况下，需要对短链脂肪酸具有充分抗性的微生物，不过至今还未开发出这种微生物。另一方面，本发明人等获得了多个源于醋酸菌的具有提高醋酸抗性功能的基因，不过这些基因中，存在具有ATP结合盒(ATP-bindingcassette)基序的基因群(例如，参照专利文献l)。这些具有ATP结合盒基序的基因一般总称为ABC转运子家族(ABCtransporterfamily),推测其编码具有将代谢产物和药剂等从细胞内输送到细胞外或者从细胞外输送到细胞内的转运子功能的蛋白质。在多拷贝数载体中连接构成这些ABC转运子家族的基因(ABC转运子基因)的其中之一，导入于醋酸菌中时，所获得的转化林(醋酸菌)虽然提高了醋酸抗性，不过却没有影响对其它有机酸的抗性(例如，专利文献l参照)。专利文献l:特开2003-289868号公报非专利文献1:Appl.Environ.Microbiol.第56巻，p.1004一1011(1990年)非专利文献2:Biotechnol.Bioeng.第39巻、p.663-671(1992年)非专利文献3:TrendsBiotechnol.第14巻，p.98-100(1996年)非专利文献4:Appl.Microbiol.Biotechnol.，第48巻，p.597-601(1997年)非专利文献5:Biotechnol.Bioeng.，第35巻，p.732-738(1990年)非专利文献6:Biotechnol.Bioeng.，第38巻，p.1318-1324(1991年)非专利文献7:Biosci.Biotechnol.Biochem.,第58巻，p.2232-2235(1994年)
发明内容发明要解决的问题因此，本发明的第一目的为提供不抑制以微生物为代表的细胞的生长，而且保持有用物质原有的高生产性，赋予对包括甲酸和醋酸等对生长有害的短链脂肪酸的抗性的方法。而且，本发明的第二目的为提供作为上述微生物的用途的、在短链脂肪酸存在下有效培养微生物的方法，用于通过发酵制备有用的短链脂肪酸的方法。用于解决问题的方法
技术领域：
：本发明人等在摸索用于解决上述问题的方法的过程中，着眼于短链脂肪酸之一的醋酸，聚焦于对该醋酸具有强效抗性的且可以用于在食醋的制备中进行醋酸发酵时利用的醋酸菌所带有的基因群，所述基因群为来源于前述醋酸菌的推测为ABC转运子家族的基因群。并且，反复研究了是否可以将构成ABC转运子家族的ABC转运子基因导入到原来的醋酸菌以外的异种细胞中，使之表达。其结果发现在属于与醋酸菌完全不同的属的原本乙醇氧化能力低的大肠杆菌(Escherichiacoli),和属于醋酸菌的醋酸发酵能力低的重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)中也可以获得转化体，并且还发现了该转化体与醋酸菌的情况不同，不会因为醋酸以外的短链脂肪酸(碳原子数5以下)而受到生长抑制，也就是说，具有短链脂肪酸抗性这一出乎意料的结果。而且，还发现通过基因导入，由这些微生物自身产生的有用物质和由外部导入的重组蛋白质的生产性没有降低。而且，在通过醋酸菌的转化林来了解ABC转运子基因如何发挥对短链脂肪酸的抗性增强功能的机理的时候，根据细胞内的醋酸浓度相对原林降低这一点，可以确定是赋予了将醋酸从细胞内排出到细胞外的培养基的功能，推测该功能可以解释为不仅提高了醋酸菌而且还提高了异种细胞的短链脂肪酸抗性的机制。并且发现，将导入了该基因的微生物进行高密度菌体培养时，与没有导入基因的微生物相比，即使在短链脂肪酸存在下也可以充分生长，由此认为在工业化培养中是有用的。而且还发现了可以使丙酸等短链脂肪酸的蓄积浓度提高。本发明是基于这些发现完成的。也就是说本发明由以下的(1)(ll)构成。(1)短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法，其特征在于将编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因导入到细胞中，使之表达。(2)上述(1)中记栽的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列号l中记载的碱基序列中的第301-2073位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)含有与序列表的序列号l中记载的碱基序列中的第301-2073位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质的DNA。(3)上述(1)中记载的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)含有序列表的序列号3中记载的碱基序列中的第331~2154位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)含有与序列表的序列号3中记载的碱基序列中的第331~2154位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性功能的蛋白质的DNA。(4)上述(1)中记载的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)、(b)、(c)或(d)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列、和第1724~2500位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第17242500位碱基构成的碱基序列并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA;(c)包括序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第10021724位碱基构成的碱基序列，和与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA;(d)包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和、与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA。(5)上述(1)中记栽的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DM:(a)序列表的序列号8中记载的碱基序列中的第2491025位碱基构成的DNA。(b)包括与序列表的序列号8中记栽的碱基序列中的第249~1025位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DM在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质的DNA。(6)上述(1)~(5)任一项中记载的细胞育种方法，其特征在于短链脂肪酸为曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸或戊酸。(7)用上述(1)~(5)任一项中记载的方法育种的细胞，其特征在于细胞为微生物细胞。(8)上述(7)中记载的细胞，其特征在于微生物细胞为属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞。(9)高密度菌体培养法，其特征在于使用上述(8)中记载的细胞。(10)上述(8)中记载的高密度菌体培养法，其特征在于在短链脂肪酸存在下培养细胞。(11)含有短链脂肪酸的发酵液的制造方法，其特征在于在细胞生成短链脂肪酸的条件下培养上述(8)中记载的细胞。发明的效果如果根据本发明，赋予对短链脂肪酸的抗性，可以育种短链脂肪酸抗性获得提高的细胞。而且，在微生物细胞中使用本发明的育种方法时，可以有效育种不受培养中生成的对生长有害的短链脂肪酸产生的影响的细胞。由本发明获得的短链脂肪酸抗性的微生物细胞也可以应用于生成短链脂肪酸的高密度菌体培养中。而且，还可以应用于含有高浓度短链脂肪酸的发酵液的制备中。尤其是，在是赋予了短链脂肪酸抗性的大肠杆菌等的情况下，其在培养中的增殖能力显著提高，可以有效积累高浓度的短链脂肪酸，因此在产业上有用。图1是表示大肠杆菌-醋酸菌穿梭载体pGIlS的构建的简图。图2表示实施例l中的转化体和未转化体在(a)未添加培养基、(b)含有甲酸的培养基、(c)添加醋酸的培养基和(d)添加丙酸的培养基中的生长量的经时变化。图3表示实施例1中的转化体和未转化体在(a)含有丁酸的培养基、(b)含有异丁酸的培养基、和(c)添加了正戊酸的培养基中的生长量的经时变化。图4表示实施例2中的转化体和未转化体在(a)含有甲酸的培养基、和(b)添加了醋酸的培养基中的生长量的经时变化。图5葡糖酸醋杆菌.工》夕-4来源的基因片段的限制性酶切图镨和短链脂肪酸抗性基因的位置和向质粒pABC31中的插入片段的简图。图6表示实施例3中的转化体和未转化体在(a)含有甲酸的培养基、和(b)添加了醋酸的培养基中的生长量的经时变化。图7表示实施例4中的转化体和未转化体在(a)含有曱酸的培养基、和(b)添加了醋酸的培养基中的生长量的经时变化。图8来源于克隆的葡糖酸醋杆菌工^夕-4的基因片段的限制性酶切图镨和短链脂肪酸抗性基因的位置、和向质粒pABC41中插入的片段的简图。图9表示实施例6(1)中的各细胞的生长量、以及培养液中的总有机酸量和醋酸量的推移。图10表示实施例6(2)中的葡萄糖的流加培养中的生长量的推移。图11表示实施例7中的转化体和未转化体的在含有醋酸的培养基中的培养经过。图12表示序列表的序列号1记载的碱基序列构成的DNA的限制性酶切图i脊和短链脂肪酸抗性基因的位置、和向质粒pABCl中的插入片段的简图。具体实施例方式以下，对本发明详细地il明。本发明的目的在于将具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的基因(短链脂肪酸抗性基因)导入细胞的育种方法、由该育种方法育种的细胞、以及使用该细胞的高密度菌体培养法以及含有有用短链脂肪酸的发酵液的制造方法。〔1〕本发明的育种方法
技术领域：
：本发明的短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法的特征在于，如权利要求l中记载的，将编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因(短链脂肪酸抗性基因)导入细胞中使之表达。这里，所谓具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质是指，本发明的育种方法的对象细胞中，可以发挥将整合到该细胞中的或由代谢等细胞内的功能生产的短链脂肪酸排出到细胞外功能的蛋白质，例如，在添加了对生长有影响的醋酸浓度的培养基中，相对于原菌林，使细胞内的醋酸浓度降低15~20°/以上的蛋白质。作为这种蛋白质，具体可以例举有，具有序列表的序列号2、4、或9中所示的氨基酸序列的蛋白质、和具有序列号6和7中所示的氨基酸序列的蛋白质复合体。而且，只要是具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质，在序列表的序列号2、4和9所示的各氨基酸序列中，包含在l个或多个，优选l个或几个氨基酸中的取代、缺失、插入、添加、逆位等变异的蛋白质也包含在上述蛋白质中。而且，同样地，只要是具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质，在序列号6和/或7所示的氨基酸序列的任一个中含有在l个或多个，优选l个或几个氨基酸中的取代、缺失、插入、添加、逆位等变异的蛋白质复合体也包含在上述蛋白质中。而且，所谓编码上述蛋白质的基因(短链脂肪酸抗性基因)是指含有上述蛋白质的编码区域，且可以导入到细胞内使之表达的基因。作为这种基因的代表，可以例举有推测为ABC转运子家族的、构成醋酸菌来源的基因群的ABC转运子基因。ABC转运子基因是指具有ATP结合盒(ATP-bindingcassette)的基序的基因或者编码与具有该基序的基因形成操纵子的蛋白质复合体的基因。具有ATP结合盒(ATP-bindingcassette)的基序的基因一般4皮称为ABC转运子家族(ABCtransporterfamily)，据推测其编码具有将代谢产物或药剂等从细胞内输送到细胞外，或者从细胞外输送到细胞内的转运子的功能的蛋白质。作为这种ABC转运子基因，可以例举有，例如，包含编码具有序列表的序列号2、4、6、7或9中所示的氨基酸序列的蛋白质的编码区域的基因，具体可以例举有，如权利要求25的(a)中记载的，包括序列号1、3、5或8中记载的碱基序列中、序列号1的第301~2073位碱基构成的碱基序列、序列号3的第331~2154位碱基构成的碱基序列、序列号5的第1002~1724位碱基构成的碱基序列和第1724~2500位碱基构成的碱基序列或序列号8的第249~1025位碱基构成的碱基序列的DNA。这些DM可以是含有上述特定的碱基序列的DNA,也可以采用例如，序列表的序列号l、3、5或8各个序列中记载的碱基序列的全长构成的,。基于以序列号1、3、5或8所示的碱基序列设计的引物，以醋酸菌(醋酸杆菌属和葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌)的基因作为模板通过PCR法可以容易地获得这些DNA。尤其是，序列表的序列号1和3记载的各碱基序列构成的DNA可以分别以醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)No.102琳(于1983年6月27日(由原保藏于1989年2月13日移交)以保藏号FERMBP-2287保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号)(旧称通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所，旧址日本茨城筑波市东1-1-3)。)作为模板分别获得。而且，序列表的序列号5和8记载的各碱基序列构成的DNA，可以以Gluconacetobacterentanii之一的AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(于1984年2月23日以保藏号FERMBP-491保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)(旧称通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所，旧址日本茨城筑波市东1-1-3)。)作为模板分别获得。而且，在本发明中，作为短链脂肪酸抗性基因，可以同样使用如权利要求2、3和5的(b)中记载的那样，含有序列号l、3或8中记载的碱基序列中、序列号l的第301-2073位碱基构成的碱基序列、序列号3的第331~2154位碱基构成的碱基序列、或与由该碱基序列的至少一部分且编码具有增强醋酸抗性功能的蛋白质的DM。于是，同样可以使用如权利要求4的(b)、(c)或(d)中记载的那样，(b)包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA、或(c)包括序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列，和与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DM在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA，或(d包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第17242500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA。并且，这里所称的严格条件是指所谓形成特异的杂交体而不形成非特异的杂交体的条件。该条件是难以明确地数值化，不过如果要举出一例，可以例举有同源性高的DNA同类，例如具有70。/。以上的同源性的DNA同类之间杂交，比其同源性更低的DNA之间不杂交的条件，或者通常的杂交的洗涤条件，例如在60X:以与1xSSC，0.1。/。SDS相当的盐浓度进行洗涤的条件等。上述的短链脂肪酸抗性基因编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因的确认，可以通过判别例如，如后述的实施例中说明的那样，通过实际上将基因导入细胞使之表达，在含有短链脂肪酸的培养基中培养该细胞(转化体)时生长的有无，和该培养基中生长量的增加(增殖程度)来确认。这里，所谓短链脂肪酸是指碳原子数l~5的直链或支链结构的脂肪酸，可以有也可以没有不饱和键。由本发明的育种方法获得的细胞是对尤其是碳原子数l~5的直链或支链结构的饱和脂肪酸，也就是如权利要求6中记载的对曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸或戊酸具有强抗性的细胞。本发明的育种方法的对象如果是可以导入上述短链脂肪酸抗性基因进行表达的细胞，就没有特别的限定。作为细胞，可以例举有属于大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌等细菌细胞、酵母细胞、曲霉属的微生物等真菌细胞等微生物细胞。其中，通过以如权利要求7中记载的微生物细胞作为对象，通过增强短链脂肪酸抗性功能，可以使通过工业化培养、尤其是使高密度菌体培养法进行的培养中的培养效率和短链脂肪酸的发酵生产中的生产效率有所提高，因此优选。作为微生物细胞，可以例举有尤其是如权利要求8中记载的属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞。细菌细胞中，如果以大肠杆菌，葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter)属的醋酸菌等自身乙醇氧化能力低的细菌细胞作为对象，由于可以使该短链脂肪酸的生产量和生产效率、菌体的生长量显著增加，因此优选。作为醋酸菌，可以例举有属于醋酸杆菌(Acetobacter)属和葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter)属的醋酸菌。作为醋酸杆菌属的细菌，具体可例举有醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)，具体可以4吏用醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)No.1023抹(于1983年6月27日(由原保藏于1989年2月13日移交)以保藏号FERMBP-2287保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)(旧称通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所，旧址日本茨城筑波市东1-1-3)、醋化醋杆菌木糖亚种3288(Acetobacteracetisubsp.xyli麵IF03288)林、醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)IF03283抹等。作为葡糖酸醋杆菌属的细菌，可例举有，例如，欧洲葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobactereuropaeus)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、葡糖酸醋杆菌工》夕-(Gluconacetobacterentanii)，具体可以使用欧洲葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobactereuropaeus)讓6160株、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)ATCC49037林、葡糖酸醋杆菌工y夕-4(Gluconacetobacterentanii)之一的AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(于1984年2月23日以保藏号FERMBP-491保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)(旧称通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所，旧址日本茨城筑波市东1-1-3)。作为大肠杆菌，优选属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌。作为属于埃希氏菌属的细菌，可例举有，例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)，具体可以使用大肠杆菌K12林、大肠杆菌JM109林、大肠杆菌DH5ot抹、大肠杆菌C600林、大肠杆菌BL21株、大肠杆菌W3110林等。而且，作为属于杆菌属(Bacillus)的细菌，可例举有，例如，枯草杆菌(Bacillussubtilis)和纳豆杆菌(Bacillussubtilis)，具体可以使用枯草杆菌Marburgl68林等。作为酵母细胞，可以使用例如，p卑酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomycespombe)等。尤其是，使用本发明的权利要求2或权利要求3所涉及的DNA作为短链脂肪酸抗性基因时，这些细胞中，优选以大肠杆菌和重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)作为对象。大肠杆菌自身的乙醇氧化能力极低，而且，重氮营养葡糖酸醋杆菌是醋酸菌，但由于醋酸发酵能力低，因此通过赋予这些微生物短链脂肪酸抗性，可以充分提高其有用性。在本发明的育种方法中向细胞导入表达短链脂肪酸抗性基因的可以利用重组载体进行。也就是说，可以通过使用在适当的载体中连接了短链脂肪酸抗性基因的重组载体转化细胞，扩增该基因的细胞内的拷贝数的方法，或者，通过使用在适当的载体中连接了短链脂肪酸抗性基因的结构基因和在该细胞中有效行使功能的启动子序列的重组载体转化细胞，通过扩增该基因在细胞内的拷贝数来实现。作为用于重组载体的制备中使用的载体，可以使用可以在宿主中自我增殖的噬菌体载体或质粒载体等。作为质粒载体，可例举有大肠杆菌来源的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC118、pET16b等)、枯草杆菌来源的质粒(例如pUB110、pTP5等)、酵母来源的质粒(例如Yep13、Ycp50等)等，作为噬菌体载体，可以例举有入噬菌体(AgtlO、人ZAP等)等。进而，也可以使用逆转录病毒或牛痘病毒等动物病毒载体、杆状病毒等昆虫病毒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等制备转化体。而且，还可以使用多拷贝载体或转座子等将目的DNA导入到宿主中，在本发明中，这种多拷贝载体或转座子包含于本发明的重组载体中。作为多拷贝载体，可以例举有pUF106(例如，参照Cellulose、p.153-158(1989年))、pMV24(例如，参照Appl.Environ.Microbiol.)、第55巻、p.171-176(1989年))、pGI18(参照例如，后述的制造例l)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例如，参照特开昭60-9488号公报)等。而且，还可以例举有染色体整合型载体pMVLl(例如，参照Agric.Biol.Chem.第52巻，p.3125-3129(1988年))。进而，作为转座子，可以例举有Mu和IS1452等。通过在栽体中连接短链脂肪酸抗性基因制备重组载体时，可釆用用适当的限制性酶切割纯化的DNA，通过在适当的栽体DNA的限制性酶切部位或多克隆位点插入连接于载体中的方法等。这里，需要在将获得的重组载体导入于细胞时，通过表达短链脂肪酸抗性基因所编码的具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质，发挥前述功能。因此，在重组载体中，除短链脂肪酸抗性基因和启动子序列之外，还可以根据希望通过连接插入增强子等顺式因子、剪接信号、polyA添加信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。这里，作为选择标记，可以例举有例如二氢叶酸还原酶基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。而且，也可以将染色体DNA上的短链脂肪酸抗性基因的启动子序列置换为在醋酸杆菌属或葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌或者在大肠杆菌中有效行使功能的其它启动子序列，此时，可以设法构建同源重组用的载体，用该栽体在微生物的染色体中发生同源重组。作为这种启动子序列，可以例举有，例如，大肠杆菌的质粒pBR322(宝生物公司制)的氨千青霉素抗性基因、质粒pHSG298(宝生物公司制)的卡那霉素抗性基因、质粒pHSG396(宝生物公司制)的氯霉素抗性基因、p-半乳糖苷酶基因等各基因的启动子等醋酸菌以外的微生物来源的启动子序列。用于同源重组的载体构建是本领域技术人员所公知的。这样一来，在微生物中通过将内源性的短链脂肪酸抗性基因配置于强力的启动子的控制下，可以扩增该短链脂肪酸抗性基因的拷贝数，增强其表达。作为这种重组载体，具体可以例举有，通过在醋酸菌-大肠杆菌穿梭栽体(多拷贝载体)pGI18分别连接序列表的序列号l、3、5和8记载的各碱基序列构成的DNA获得的pABClll、pABC112、pABC31和pABC41。本发明的育种方法中向细胞导入表达短链脂肪酸抗性基因可以使用上述重组载体按照常规方法进行。例如，细菌细胞的情况是，可以通过采用钙离子的方法(例如，参照Agric.Biol.Chem.，第49巻，p.2091-2097(1985年))、电穿孔法(例如，参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第87巻、p.8130-8134(1990年)、Biosci.Biotech.Biochem.，第58巻，第974页，1994年等)等。而且，在酵母细胞中(作为宿主)使用的情况，可以例举有，例如，电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。而且，转化体的选择可以利用导入的基因内构成的标记基因的性质来实施。例如，釆用氨节青霉素抗性基因的情况下，可以选择对氨千青霉素药剂显示抵抗性的细胞，具体的是，使用添加适当量(例如，100jag/m1程度)氨爷青霉素形成的培养基作为选择培养基，涂布转化林，进行培养，以在选择培养基上生长的菌落作为转化林。而且，在使用新霉素抗性基因时，可以选择对G418药剂显示出抵抗性的细胞。在本发明的育种方法中，这样一来，通过在细胞中导入短链脂肪酸抗性基因使之表达，可以获得短链脂肪酸抗性获得提高的细胞。经育种的细胞的短链脂肪酸抗性是否获得提高的确认，通过以下方式进行在细菌细胞的情况是，在添加了O.01~3%左右的短链脂肪酸的培养基中培养15小时以上，测定生长度，吸光度及干燥菌体重量，与未转化的原始细胞完全或基本不生长相比，其显示出生产量大幅提高。作为这种短链脂肪酸抗性获得提高的细胞，本发明人实际上可以获得如后述的实施例中所示，通过在醋酸菌醋化醋杆菌No.1023林中导入上述重组载体pABClll获得的No.1023/pABClll林、通过在大肠杆菌JM109林中导入重组载体pABClll获得的JM109/pABClll林、同样，通过在重氮营养葡糖酸醋杆菌ATCC49037林中导入重组载体pABClll获得的ATCC49037/pABClll林、通过在大肠杆菌JM109林中导入重组载体pABC112获得的JM109/pABC112林、同样，通过在大肠杆菌JM109林中导入重组栽体pABC31获得的JM109/pABC31林、通过在大肠杆菌JM109林中导入重组载体pABC41获得的JM109/pABC41抹。这些转化林中的5林保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，JM109/pABClll林的保藏号为FERMBP-10184、ATCC49037/pABC111林的保藏号为FERMBP-10186、JM109/pABC112林的保藏号为FERMBP-10185、JM109/pABC31抹的保藏号为FERMBP-10182、JM109/pABC41林的保藏号为FERMBP-10194。〔2〕本发明的高密度培养法本发明的高密度菌体培养法，如权利要求9中记载的，特征在于使用权利要求8中记载的细胞，也就是说、其特征在于，使用的是通过前述〔1〕中说明的本发明的育种方法，在属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞中导入短链脂肪酸抗性基因使之表达而由此育种得到的短链脂肪酸抗性获得提高的属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞。这里，所谓高密度菌体培养法是指在高密度，一般是在培养基中密度为50~200g(干燥菌体)/L的条件下培养细菌细胞(菌体)的方法。对于培养基、培养时间、培养条件，可以根据细胞的种类等进行适当设定，例如在大肠杆菌的情况下，可以在天然培养基或合成培养基的任一种培养基中，也可以在例如，添加葡萄糖的LB培养基中于28"C~37X:进行通气培养。一旦细菌细胞消耗了培养基中的营养源，通常、培养基中就会生成短链脂肪酸，这成为抑制生长的原因，不过本发明的高密度菌体培养法由于使用短链脂肪酸抗性获得提高的细菌细胞，因此可以阻止生长抑制。也就是说、如权利要求10中记栽的，即使在甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、或戊酸等对生长存在毒性的短链脂肪酸存在下培养细胞，也不会抑制生长，可以维持微生物自身生产的有用物质以及由外部导入的重组蛋白质的生产性。这里，作为有用物质，如果是可以通过利用微生物制备的物质，可以是任意一种形态，没有特别的限定。作为其中1例，可以例举有微生物菌体本身。而且，如果使用本发明的细胞，由于可以使细胞的终密度提高，因此即使是由常规代谢产生的物质，也可以以极高效率制备。作为这种物质的例子，可以例举有脂肪酸、氨基酸、抗生物质、酶、维生素和乙醇等。如实施例6中所示，可以提高培养基中有机酸的生成量。而且，作为重组蛋白质，可以例举有，例如，人的成长激素和肽、白介素1P、干扰素等。尤其是、在大肠杆菌的情况下，除上述碳原子数5以下的短链脂肪酸以外还可以有效生产柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、焦谷氨酸等有机酸。作为高密度菌体培养法，作为从实验室水平到工业化生产水平都可以广泛应用的方法，可以例举有流加培养、透析培养。流加培养是一种对应于培养时间的退役，连续或间接地向培养基中流加特定营养源进行培养的方法。作为流加对象的营养源，优选抑制细胞的增殖和蛋白质生产的作为短链脂肪酸的直接原料的葡萄糖、甘油等碳源。为了将培养基中的碳源浓度和/或菌体的生长浓度保持在一定水平，流加的程序表可以为按照指数函数来不断增加流加速度的方式、一边将培养基中的碳源浓度保持在规定浓度以下一边梯度性地(一般，每隔2~5小时)增加流加速度(流加量)的一些方式。对于培养基的种类、温度、湿度、pH、时间、搅拌的有无等培养条件，也可以根据细菌细胞的种类和状态来适当确定。在以往的流加培养中，为了避免微生物培养中生成的以醋酸为代表的短链脂肪酸所导致的细胞的增殖抑制，蛋白质生产抑制等，不仅需要调整葡萄糖等流加速度，还需要细致地调整培养基中的溶解氧量以抑制生成的短链脂肪酸，本发明的短链脂肪酸抗性获得提高的属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞由于可以不受短链脂肪酸的影响地维持生产性，因此可以省去以往这样的调整的麻烦。而且，透析培养是一边向培养系统外使用透析膜等除去醋酸等菌体外产物，一边进行培养的方法。在以往的透析培养中，需要特殊的装置，不过本发明的短链脂肪酸抗性获得提高的属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞由于可以不受短链脂肪酸的影响地维持生产性，因此即使用简单的装置(例如，发酵罐)也可以实施。〔3〕含有短链脂肪酸的发酵液的制造方法
技术领域：
：本发明的发酵液的制造方法的特征在于，在细胞生成短链脂肪酸的条件下培养权利要求8中记载的细胞。所谓权利要求8中记载的细胞，是指通过前述〔1〕中说明的本发明的育种方法，将短链脂肪酸抗性基因导入属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞使之表达由此育种得到的短链脂肪酸抗性获得提高的、属于醋酸菌、大肠杆菌或杆菌属的细菌细胞，可以从其中选择具有所希望的短链脂肪酸生产能力的细菌细胞。例如，大肠杆菌可以生产所有短链脂肪酸，醋酸菌可以选择性地生产醋酸。而且，所谓短链脂肪酸除了甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸之外还指乳酸和丙酸。本发明的发酵液的制造方法需要在生成短链脂肪酸的条件下培养对象细菌细胞，这种条件，可以根据细菌细胞的种类的生成对象-短链脂肪酸的种类适当确定，不过，通常根据短链脂肪酸适量添加短链乙醇。实施例以下，通过实施例更具体地说明本发明。(制造例l)大肠杆菌-醋酸菌穿梭载体pGI18的开发醋酸菌_大肠杆菌穿梭载体pGI18由来源于AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的约3.lkb的质粒pGIl和pUC18制备而成。图l中显示了质粒pGI18制备的概况。首先，由Acetobacteraltoacetigenes制备质粒pGIl。也就是说，从AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的培养液中收集菌体，使用氢氧化钠和十二烷基硫酸钠溶菌后，进行苯酚处理，再用乙醇纯化质粒DNA。获得的质粒是具有3个HincII的位点以及l个Sfil识别部位的环状双链DNA质粒，质粒整体长度为约3100个碱基对(3.lkbp)。而且，没有EcoRI、Sacl、Kpnl、Smal、BamHI、Xbal、Sall、Pstl、Sphl、HindIII的识别部位。将该质粒命名为pGIl，用于载体pGI18的制备。通过PCR法扩增如上述方式获得的质粒pGIl，用AatII切割。将该片段插入pUC18(2.7kbp、宝生物(林)制)的经过限制性酶AatII切割的部位，制成质粒pGI18。PCR法，具体按下述方式实施。使用质粒pGIl作为模板，而且，使载的碱基序列)和引物B(参照序列表的序列号ll记载的碱基序列)作为引物。用上述模板和引物，釆用KOD-Plus-(东洋纺织(林)制)，以94'C30秒、60'C30秒、68X:3分作为l个循环进行30个循环的条件下实施PCR。其结果获得的质粒pGI18，如图1中所示，还包括pUC18和pGIl中的任一种，整体长度为约5800个碱基对(5.8kbp)。该质粒pGI18的碱基序列如序列表的序列号12中所示。(实施例1)在用序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA转化的醋化醋杆菌中的醋酸的排出(1)转化株的获得用限制性酶PsU切割克隆了序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA的pABCl(图12)，将获得的约2.5Kb的片段连接到制造例l中制备的醋酸菌—大肠杆菌穿梭载体pGI18的限制性酶Pstl切割部位中，制备质粒pABClll。通过电穿孔法(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第87巻、p.8130-8134(1990年))将由此制备的pABClll转化醋化醋杆菌(Acetobacteraceti)No.1023林(FERMBP-2287)。在添力口了100jug/ml的氨节青霉素和2y。的醋酸的YPG培养基中选择转化林。对于在上述选择培养基上生长的氨千青霉素抗性的转化林，通过常规方法提取质粒，进行分析，确认带有具有序列表的序列号l中记载的碱基序列构成的DNA的质粒。(2)转化林的醋酸排出对于带有如上所述获得的质粒pABClll的氨节青霉素抗性的转化抹(No.1023/pABClll林)，使之在添加了醋酸的YPG培养基上的生长、将其细胞内的醋酸浓度，与只导入了穿梭栽体pGI18的醋化醋杆菌No.1023林(No.1023/pGI18抹)进行比较。也就是说，按照久^4大一等人的方法(例如，参照Biotechnol.Bioeng.，第84巻，p.40-44，2003年)，在含有l、2、3和4重量/体积。/。的各浓度的醋酸钾的100ml的YPG培养基中培养No.1023/pABClll林和No.1023/pGI18林。从50ml的培养液中收集菌体，进行碱性溶菌后，用F-试剂盒(口少夕工)测定从各培养液获得的细胞内的醋酸浓度(M)，进行比较。各培养液中细胞内醋酸钾浓度的结果示于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表l中所示，转化株No.1023/pABClll林和非转化林No.1023/pGI18林中的任何一林随着培养液中的醋酸钾浓度的增高，细胞内的醋酸钾浓度也上升，不过其上升度，转化林(No.1023/pABClll林)比较慢，尤其是，在培养时的醋酸钾浓度为4重量/容量％时，No.1023/pABClll林只能积累No.1023/pGI18林的84%。这表明转化林No.1023/pABCl1l林将细胞内的醋酸排出到细胞外。由此表明序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA是编码具有将醋酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因。(实施例2)被序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA转化的大肠杆菌的短链脂肪酸抗性(l)转化林的获得杆菌JM109林，以添加了100ng/ml的氨千青霉素的LB琼脂培养基选择转化林。通过常规方法提取质粒，进行解析，确认在选择培养基上生长的氨苄青霉素抗性的转化林带有具有醋酸抗性基因的质粒。这样获得的转化株JM109/pABClll林于2004年12月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)，其保藏号为FERMBP-10184。(2)转化林的短链脂肪酸抗性对于如上述方式获得的带有质粒pABClll的氨爷青霉素抗性的转化林(JM109/pABClll林)，将其在添加了甲酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸等各短链脂肪酸的LB培养基上的生长与只导入了穿梭载体pGI18的大肠杆菌(JM109/pGI18林)进行比较。也就是说，作为短链脂肪酸，用含有O.10%甲酸、0.15%醋酸、0.10%丙酸、0.10°/。丁酸、0.15%异丁酸和0.25%正戊酸任一种、100ug/ml氨苄青霉素、lmMIPTG(异丙基-l-巯基-p-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基(pH5.0:短链脂肪酸添加培养基)，于37"C进行JM109/pABC111林和JM109/pGI18林的振荡培养(150rpm)。而且，为了比较，除了不添加短链脂肪酸之外，用与上述短链脂肪酸添加培养基相同的组成构成的未添加培养基进行相同的培养。在各培养基中，根据时间变化测定660nm处的吸光度，在各培养基间进行比较，以此作为各细胞的增殖程度(生长量)的指标。各培养基中生长量(吸光度(660nm))随时间的变化示于图2和图3中。如图2和图3中所示，在未添加培养基中，任一种细胞均可以生长，与之相对，在各短链脂肪酸添加培养基中，非转化抹-JM109/pGI18林无法生长或生长非常弱，与之相对，转化林-JM109/pABClll林可以增殖。也就是说，非转化抹(JM109/pGI18林)受短链脂肪酸存在的影响，与之相对，转化抹(JM109/pABClll林)对任意一种短链脂肪酸均具备抗性。由此表明，通过在大肠杆菌细胞中导入序列表的序列号l中记载的碱基序列构成的DNA，可以育种对各种短链脂肪酸的抗性获得提高的大肠杆菌。(实施例3)用序列表的序列号3中记载的碱基序列构成的DNA转化的大肠杆菌的短链脂肪酸抗性(l)转化林的获得通过PCR法扩增序列表的序列号3中记载的碱基序列构成的DNA，将获得的片段连接于制备例1中制备的醋酸菌一大肠杆菌穿梭载体pGI18的限制性酶SmaI切割部位中，制备质粒pABC112。PCR法具体按以下方式实施。用AcetobacteraUoacetigenesMH-M林(FERMBP-W1)的基因组DNA作为模板，并且，使用引物l(参照序列表的序列号13记载的碱基序列)和引物U参照序列表的序列号14记栽的碱基序列)作为引物。通过上述模板和引物，采用KOD-Plus-(东洋纺织(林)制)，在94C15秒、60匸30秒、68匸2分作为1个循环，进行30个循环的条件下实施PCR。用电穿孔法(参照Biosci,Biotech.Biochem.，第58巻，笫974页，1994年)用这样制备的pABC112转化大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100iug/ml的氨千青霉素的LB琼脂培养基选择转化株。对于在选择培养基上生长的氨苄青霉素抗性的转化林，通过常规方法提取质粒，进行分析，确认带有具有序列表的序列号3中记载的碱基序列构成的DNA的质粒。这样获得的转化林JM109/pABC112株于2004年12月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)，其保藏号为FERMBP-10185。(2)转化抹的短链脂肪酸抗性对于按上述方式获得的带有质粒pABC112的氨千青霉素抗性的转化林(JM109/pABCl12抹)，将其在添加了甲酸和醋酸等各短链脂肪酸的LB培养基上的生长与只导入了穿梭载体pGI18的大肠杆菌(JM109/pGI18林)进行比较。具体而言，用含有O.10%甲酸或0.15%醋酸作为短链脂肪酸、100"g/ml氨苄青霉素、lmMIPTG(异丙基-l-巯基-p-D-疏代半乳糖苷)的LB培养基(pH5.0),于37。C,进行JM109/pABC112林和JM109/pGI18林的静置培养或振荡培养(150rpm)。在各短链脂肪酸添加培养基中，根据时间变化测定66Onm处的吸光度，在各短链脂肪酸添加培养基间进行比较，以此作为各细胞的增殖程度(生长量)的指标。各培养基中生长量(吸光度(660nm))的经时变化示于图4。如图4中所示，转化林JM109/pABCl12林在任意添加各短链脂肪酸的培养基中均可以增殖，与之相对，非转化林JM109/pGI18林无法生长。也就是说、非转化林(JM109/pGI18林)受短链脂肪酸存在的影响，与之相对，转化株(JM109/pABCl12株)对甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通过在大肠杆菌细胞中导入序列表的序列号3中记载的碱基序列构成的DNA，可以育种对各种短链脂肪酸的抗性获得提高的大肠杆菌。(实施例4)用序列表的序列号5中记载的碱基序列构成的DNA转化的大肠杆菌的短链脂肪酸抗性(l)大肠杆菌转化林的获得通过PCR法扩增序列表的序列号5中记载的碱基序列构成的DNA，将获得的片段连接于制造例l中制备的醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18的限制性酶Smal切割部位中，制备出质粒pABC31。PCR法具体按以下方式实施。用ActobacteraltoacetigenesMH-2A林(FERMBP-W1)的基因组DM作为模板，并且，使用引物3(参照序列表的序列号15记栽的碱基序列)和引物4(参照序列表的序列号16记栽的碱基序列)作为引物。通过上述模板和引物，采用KOD-Plus-(东洋纺织(抹)制)，在94T15秒、60"C30秒、68°Cl分作为l个循环，进行30个循环的条件下实施PCR。AcetobacteraltoacetigenesMH-24林的基因组DNA中序歹'J号5记载的碱基序列的限制性酶切图谱和序列号5记载的碱基序列的位置、和质粒pABC31中的插入片段的简图示于图5。用电穿孔法用这样制备的pABC31转化大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100jag/ml的氨节青霉素的LB琼脂培养基选择转化林。对于在选择培养基上生长的氨爷青霉素抗性的转化林、通过常规方法提取质粒，进行分析，确认带有具有序列表的序列号5中记载的碱基序列构成的DNA的质粒。这样获得的转化抹JM109/pABC31林于2004年12月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东l-l-l中央第6号)，其保藏号为FERMBP-10182。(2)转化体的短链脂肪酸抗性按上述方式获得的带有质粒pABC31的氨千青霉素抗性的转化抹(JM109/pABC31林)，将其在添加了甲酸和醋酸等各短链脂肪酸的LB培养基上的生长与只导入了穿梭载体pGI18的大肠杆菌(JM109/pGI18林)进行比较。具体而言，用含有O.10%曱酸或0.15%醋酸作为短链脂肪酸、100pg/ml氨千青霉素、lmMIPTG(异丙基-l-巯基-P硫代半乳糖苷)的LB培养基(pH5.0),于37。C,进行JM109/pABC31林和JM109/pGI18林的静置培养、或振荡培养(150rpm)。在各短链脂肪酸添加培养基中，根据时间变化测定66Onm处的吸光度，在各短链脂肪酸添加培养基间进行比较，以此作为各细胞的增殖程度(生长量)的指标。各培养基中生长量(吸光度(660nm))示于图6。如图6中所示，转化林JM109/pABC31抹在任意添加各短链脂肪酸的培养基中均可以增殖，与之相对，非转化抹JM109/pGI18林无法生长。也就是说，非转化抹(JM109/pGI18抹)受短链脂肪酸存在的影响，与之相对，转化林(JM109/pABC31林)对甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通过在大肠杆菌细胞中导入序列表的序列号5中记栽的碱基序列构成的DNA，可以育种对各种短链脂肪酸的抗性获得提高的大肠杆菌。(实施例5)被序列表的序列号8中记载的碱基序列构成的DNA转化的大肠杆菌的短链脂肪酸抗性(l)大肠杆菌转化林的荻得通过PCR法扩增序列表的序列号8中记载的碱基序列构成的DNA,将获得的片段连接于制造例l中制备的醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18的限制性酶SmaI切割部位中，制备出质粒pABC41。PCR法具体按以下方式实施。用AcetobacteraltoacetigenesMH-24林(FERMBP-491)的基因组DNA作为模板，并且，引物5(参照序列表的序列号17记载的碱基序列)和引物6(参照序列表的序列号18记载的碱基序列)作为引物。通过上述模板和引物，采用KOD-Plus-(东洋纺织(林)制)，在94'C15秒、60X:30秒、l分作为l个循环，进行30个循环的条件下实施PCR。用电穿孔法用这样制备的pABC41转化大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109林。以添加了100pg/ml的氨节青霉素的LB琼脂培养基选择转化抹。对于在选择培养基上生长的氨苄青霉素抗性的转化林、通过常规方法提取质粒，进行分析，确认带有具有序列表的序列号8中记载的碱基序列构成的DM的质粒。确认序列表的序列号8中记载的碱基序列中，在第249~1025位碱基方面，存在编码序列号9记载的259个氨基酸构成的氨基酸序列的开放阅读框(ORF)。而且，清楚了序列表的序列号9中记载的氨基酸序列与已知序列的同源性低至30%,序列表的序列号8中记栽的碱基序列构成的基因由本发明人首次发现，是新基因。AcetobacteraltoacetigenesMH-24林的基因组DNA中序歹'J号8记载的碱基序列的限制性酶切图语和序列号8记载的碱基序列的位置以及在质粒pABC41中的插入片段的简图示于图8。这样获得的转化林JM109/pABC41林于2004年12月27日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号)，其保藏号为FERMBP-10194。(2)转化体的短链脂肪酸抗性对于按上述方式获得的带有质粒pABC41的氨节青霉素抗性的转化抹(JM109/pABC41林)，将其在添加了甲酸和醋酸等各短链脂肪酸的LB培养基上的生长与只导入了穿梭载体pGI18的大肠杆菌(JM109/pGI18林)进行比较。具体而言，用含有o.15%的甲酸或醋酸作为短链脂肪酸、100jjg/ml氛苄青霉素、lmMIPTG(异丙基-1-巯基-p-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基(pH5.0),于37C，进行JM109/pABC41林和JM109/pGI18林的静置培养或振荡培养(150rpm)。在各短链脂肪酸添加培养基中，根据时间变化测定66Onm处的吸光度，在各短链脂肪酸添加培养基间进行比较，以此作为各细胞的增殖程度(生长量)的指标。各培养基中生长量(吸光度(660nm))示于图7。如图7中所示，转化抹JM109/pABC41林在任意添加各短链脂肪酸的培养基中均可以增殖，与之相对，大肠杆菌JM109/pGI18林无法生长。也就是说、非转化抹(JM109/pGI18林)受短链脂肪酸存在的影响，与之相对，转化抹JM109/pABC41林对甲酸和醋酸均有抗性。由此表明，通过在大肠杆菌细胞中导入序列表的序列号8中记载的碱基序列构成的DNA，可以育种对各种短链脂肪酸的抗性获得提高的大肠杆菌。(实施例6)大肠杆菌转化体的高密度培养(1)添加葡萄糖的LB培养基中的培养对于实施例2中获得的带有质粒pABClll的大肠杆菌JM109抹的转化抹(JM109/pABClll林)，将在LB培养基中添加了葡萄糖的培养基中的生长与只导入穿梭栽体pGI18的大肠杆菌林(JM109/pGI18抹)进行比较。具体而言，用5升小型罐(三少7理化学工业公司制；KMJ-2A),对含有20%葡萄糖、100lag/ffll氨苄青霉素的LB培养基(pH7.0)进行过滤灭菌，进行"C、500rpm、0.3vvm的通气培养。比较转化林与非转化林的培养中和培养结束时的生长量、以及培养液中的醋酸量和总有机酸量。生长量是作为660nm处的吸光度(OD660nm)进行测定的。另一方面，培养液中的总有机酸量和醋酸量是通过从培养液中离心分离菌体，适当稀释上清液，用岛津高效液相层析有机酸分析系统(柱ShodexRSpakKC-811、移动相4mM对甲苯磺酸、反应液4mM对曱苯磺酸、80]uMEDTA、16mMBis-Tris),作为上清液中的总短链脂肪酸(有机酸)浓度(柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、焦谷氨酸的各浓度的总值)和醋酸浓度进行测定的。图9中表示各细胞的生长量、以及培养液中的总有机酸量和醋酸量的推移。而且，培养开始后第22小时的生长量、以及培养液中的总短链脂肪酸量和醋酸量汇集在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>根据图9的结果，确认了转化林JM109/pABClll株比非转化林JM109/pGI18林的生长量、总短链脂肪酸(有机酸)量和醋酸量都要高。而且，根据表2的结果，可以确认，对于培养开始后第22小时的生长量，总有机酸量和醋酸量，转化林(JMlG9/pABClll林)比非转化林(JM109/pGI18林)都要高。由此表明，通过在大肠杆菌细胞中导入序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA获得的大肠杆菌在高密度菌体培养中，不受短链脂肪酸所导致的生长抑制，而且不仅可以生产醋酸等短链脂肪酸，还可以产生许多有机酸。(2)葡萄糖流加培养使用实施例2中获得的带有质粒pABClll的大肠杆菌JM109林的转化抹(JM109/pABClll林)，将其培养中在培养基中添加葡萄糖的流加培养中的生长与只导入穿梭载体pGI18的大肠杆菌(JM109/pGI18林)进行比较。培养中，使用2升的小型罐(三少7理化学工业公司制；KMJ-2A)、pH控制器(三少"7理化学工业公司制；数字pH控制器MPH-2C)。而且，使用对应于l升矿物培养基(Mineralmedium:2.OgNa2S04，2.468g(NH4)2S04，0.5gNH4C1，14.6gK2HP04，3.6gNaH2P04H20，l.Og(匪4)广H-柠檬酸盐，Q.05g)，添加3ml1M的MgS04、3ml的微量元素溶液(Traceelementsolution:0.5gCaCl2，0.18gZnS047H20,0.lgMnS04H20，20.lgEDTA—Na2，16.7gFeCl36H20，0.16gCuS045H20，0.18gCoCl26H20(每l升培养用培养基))构成的培养基作为培养培养基。一边将温度、pH、搅拌速度和通气量分别控制为35X:、6.8、700rpm、0.51/min，一边进行培养。pH的调整通过添加29yD氨溶液来进^亍。收集用5ml添加了100jig/ml的氨千青霉素的LB培养基培养了6小时的培养液中的菌体，将l升用5ml前述的培养培养基再次悬浮的悬浮液接种于培养基，通气搅拌培养16.5小时。然后，到第26.5小时，连续地按表3中所示程序表随时间依次一边提高流加速度和流加量，一边流加50%葡萄糖溶液，一边进行通气搅拌培养(通气量；0.5vvm、搅拌速度；70Qrpm)—边培养。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>通过测定660nm的吸光度(OD660nm)处的生长量和菌体干燥重量确认菌体的增殖。葡萄糖的流加培养中的生长量(OD660nm)的推移示于图10。根据图10,可以清楚地确认转化林(JM109/pABCl1l林)的生长量比JM109/pGI18林有所提高。而且，在培养结束时测定最终菌体量(干燥菌体重量(g:DCW(DriedCellWeight))和消耗葡萄糖量，计算菌体浓度(每1L培养基的千燥菌体重量g/1)和菌体产率(w/wM)。再计算平均增殖速度(g/h)作为每个单位时间的菌体的增殖速度。各菌中的这些结果汇集于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>根据表4的结果，转化林(JM109/pABClll林)的菌体量、菌体浓度、菌体产率、每单位时间的增殖速度都比JM109/pGI18林的值要高。由此可以确认葡萄糖的流加培养所产生的高密度培养的有用性。(实施例7)被序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA转化的重氮营养葡糖酸醋杆菌的短链脂肪酸抗性(l)转化林的获得的醋酸菌的l种重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)ATCC49037林。在添加了IOOpg/ml的氨节青霉素YPG培养基选择转化株。对于在选择培养基上生长的氨苄青霉素抗性的转化林、通过常规方法提取质粒，进行分析，确认带有具有序列表的序列号l中记载的碱基序列构成的DNA的质粒。这样获得的转化株ATCC49037/pABClll株于2004年12月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城筑波市东1-1-1中央笫6号)，其保藏号为FERMBP-10186。(2)转化体的醋酸抗性对于如上述方式获得的带有质粒pABClll的氨千青霉素抗性的转化林(ATCC49037/pABClll抹)，将其在添加了醋酸的YPG培养基中的生长与只导入穿梭载体pGI18的重氮营养葡糖酸醋杆菌ATCC49037林(ATCC49037/pGI18林)进行比较。具体而言，用含有O.05X醋酸、100jag/ml氨千青霉素的YPG培养基，于30'C进行振荡培养(150rpm),根据时间变化测定660nm处的吸光度，作为各细胞的增殖的程度(生长量)的指标进行比较。各培养基中生长量(吸光度(660nm)的经时变化)示于图11。其结果，如图ll中所示，可以确认转化林(ATCC49037/pABClll林)可以在添加了0.05。/。醋酸的YPG培养基中增殖，与之相对，ATCC49037/pGI18林无法生长。由此表明，通过在不生产醋酸的醋酸菌-重氮营养葡糖酸醋杆菌中导入序列表的序列号1中记载的碱基序列构成的DNA，可以增强其醋酸抗性。工业实用性如果根据本发明，可以赋予对短链脂肪酸的抗性，育种短链脂肪酸抗性获得提高的细胞。而且对于微生物细胞，在适用本发明的育种方法的情况下，可以有效育种不受培养中生成的对生长有害的短链脂肪酸所产生的影响的细胞。由本发明获得的短链脂肪酸抗性的微生物细胞也可以应用于生成短链脂肪酸的高密度菌体培养中。而且，还可以应用于含有高浓度短链脂肪酸的发酵液的制造中。尤其是被赋予了短链脂肪酸抗性的大肠杆菌等情况下，由于培养中增殖能力显著提高，可以有效积蓄高浓度的短链脂肪酸，因此在产业上有用。权利要求1、短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法，其特征在于将编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因导入到细胞中使之表达。2、根据权利要求l中记栽的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)包括序列表的序列号l中记栽的碱基序列中的第301-2073位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)含有与序列表的序列号1中记栽的碱基序列中的第301-2073位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DM在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质的DNA。3、根据权利要求l中记载的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)含有序列表的序列号3中记栽的碱基序列中的第331~2154位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)含有与序列表的序列号3中记载的碱基序列中的第331~2154位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质的DNA。4、根据权利要求l中记载的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)、(b)、(c)或(d)中所示的DM:(a)包括序列表的序列号5中记栽的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列、和第1724~2500位碱基构成的碱基序列的DNA;(b)包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA;(c)包括序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列，和与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DNA;(d)包括与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1002~1724位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列、和、与序列表的序列号5中记载的碱基序列中的第1724~2500位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质复合体的DM。5、根据权利要求l中记载的细胞育种方法，其特征在于编码具有将短链脂肪酸从细胞内排出到细胞外功能的蛋白质的基因为下述(a)或(b)中所示的DNA:(a)序列表的序列号8中记载的碱基序列中的第2491025位碱基构成的DNA。(b)包括与序列表的序列号8中记载的碱基序列中的第249~1025位碱基构成的碱基序列或由该碱基序列的至少一部分制备的可以成为探针的碱基序列的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，并且编码具有增强醋酸抗性的功能的蛋白质的DNA。6、权利要求1~5任一项中记栽的细胞育种方法，其特征在于短链脂肪酸为曱酸、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸或戊酸。7、用权利要求1~5任一项中记载的方法育种的细胞，其特征在于细胞为微生物细胞。8、权利要求7中记栽的细胞，其特征在于微生物细胞为属于醋酸菌、大肠杆菌、或杆菌属的细菌细胞。9、高密度菌体培养法，其特征在于使用权利要求8中记载的细胞。10、根据权利要求9中记载的高密度菌体培养法，其特征在于在短链脂肪酸存在下培养细胞。11、含有短链脂肪酸的发酵液的制造方法，其特征在于在细胞生成短链脂肪酸的条件下培养权利要求8中记载的细胞。全文摘要本发明的目的在于提供不抑制以微生物为代表的细胞的生长，而且保持有用物质原有的高生产性，赋予对甲酸和醋酸等对生长有害的短链脂肪酸的抗性的方法、以及在短链脂肪酸存在下有效培养微生物的方法，用于通过发酵制备有用的短链脂肪酸的方法。本发明提供了特征在于编码具有从细胞内将排出到细胞外功能的蛋白质的基因导入细胞，使之表达的短链脂肪酸抗性获得提高的细胞的育种方法，特征在于使用该细胞的高密度菌体培养法，以及特征在于在该细胞生成短链脂肪酸的条件下培养该细胞的含有短链脂肪酸的发酵液的制备方法。文档编号C12P21/02GK101103106SQ20058004576公开日2008年1月9日申请日期2005年12月12日优先权日2004年12月17日发明者中野繁,深谷正裕申请人:株式会社味滋集团公司