专利名称：多态性位点基因型预测同型半胱氨酸水平的用途、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性位点基因型用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的用途。本发明还涉及一种用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，一种通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型，预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的方法和试剂盒。本发明属于医药领域。
背景技术：
人体内同型半胱氨酸(Hcy，homosysteine)作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。同型半胱氨酸主要通过两条途径进行代谢再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径约有50％同型半胱氨酸在蛋氨酸合酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸，参加体内蛋白质的代谢。这一反应中的甲基供体(N-5甲基四氢叶酸)是由N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylene tetrahydrofolate reductase)作用于N-5，10-亚甲基四氢叶酸形成的。另外，约50％的同型半胱氨酸也可通过转硫途径在胱硫醚β合酶(CBS，cystathionine β-synthase)的催化下，与丝氨酸缩合成胱硫酶，后者进一步生成半胱氨酸和α-酮丁酸，此过程需要磷酸吡哆醛(活性维生素B6)作为辅助因子TIPS，1990，11411-416。
高Hcy血症的形成涉及多种因素，包括遗传、营养、药物及其他因素等Cattaneo M.Hyperhomocysteinemia，atherosclerosis and thrombosis[J].Thromb Haemost，1999，81165-176。遗传性Hcy血症主要是由于胱硫醚β合成酶、甲硫氨酸合成酶(MS)及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)活性降低所致。MTHFR是N5-甲基四氢叶酸形成的关键酶，MTHFR基因C677T突变可致酶活性下降，使蛋氨酸循环障碍，血中Hcy水平升高。在已经发现的人类MTHFR基因突变中，多数是可以导致酶活性严重下降甚至酶活性缺失的突变，在人群中罕见，而第677位核苷酸的基因突变(C→T)引起该酶活性轻中度降低，同型半胱氨酸浓度增高Circulation，1996，943074-3078。Brattstrom等Circulation，1998，98(23)2520-2526总结了3年中所进行的13项血浆Hcy水平与MTHFR基因型的研究和23项病例对照研究，共涉及5869例心血管病患者和6644例健康对照者，发现TT型血浆Hcy水平显著高于CC型。
高同型半胱氨酸血症与多种疾病以及疾病的并发症相关。高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，引起血管舒缩因子平衡紊乱，导致妊娠高血压综合征(PIH)。因此，多数研究认为MTHFR基因是PIH的主要候选基因中国公共卫生，2004，20，6762-764。目前广泛认为，除心血管病的传统危险因素外，同型半胱氨酸是动脉粥样硬化性血管疾病又一个强有力的预测因子。血液中总的同型半胱氨酸(total homocysteine，tHcy)水平升高可导致冠心病、脑血管病、外周血管病、动静脉血栓栓塞性疾病等。近年来基础与临床研究均显示，tHcy是心脑血管疾病独立的危险因素。高tHcy血症可促发所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周血管疾病等心血管病学进展，2000，2129。大量的事实表明轻度到中度tHcy血症(tHcy浓度≥12μmol/L，但≤100μmol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的、独立的危险因素。
Sutton等Circulation，1997，961745认为血Hcy水平与单纯收缩期高血压独立相关。有报道认为，Hcy代谢关键酶的基因多态性与单纯收缩期高血压的发生关系密切。MTHFR可能是单纯收缩期高血压的易感基因，tHcy是单纯收缩期高血压的重要中间表型中华心血管病杂志，2003，31269-273。Lim等Am J Epidemiol，2002，1561105-1113认为高水平的Hcy可增加发生高血压的危险性。高同型半胱氨酸血症(HHcy)是高血压病人死亡和左心室射血分数(LVEF)低的独立预测因子Arterioscler Thromb Vasc Biol2005，25115-121。高血压病患者中tHcy水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。
Jacques等Am J Clin Nutr.1999，69(3)482-489在美国第三次全国营养与健康调查研究的基础上，对具有美国人口代表性的、年龄在12岁以上的3766例男性和4819例女性血清Hcy水平进行了检测。结果显示，在非西班牙裔白人中，血清Hcy浓度的几何均数分别为男性9.6μmol/L、女性7.9μmol/L；在非西班牙裔黑人分别为男性9.8μmol/L、女性8.2μmol/L；在墨西哥裔男性9.7μmol/L、女性7.4μmol/L。对北京城乡35～64岁男女两性1168例血浆Hcy水平分布特点和相关因素进行的研究中华流行病学杂志，2002，23(1)32-36结果显示，血浆Hcy几何均数男性高于女性(15.4μmol/L vs 12.2μmol/L，P＜0.001)；血浆Hcy分布存在着城乡差别，农村男性(18.0μmol/L)是城市男性(12.0μmol/L)的1.5倍(P＜0.001)，农村女性(12.9μmol/L)是城市女性(9.6μmol/L)的1.3倍(P＜0.001)；北京城乡35～64岁人群中高Hcy血症(Hcy≥16μmol/L)的患病率为15.3％。相关因素分析显示，北京地区人群血浆Hcy水平的分布存在着年龄、性别和城乡间差别；北京地区人群Hcy水平及高Hcy血症的患病率明显高于西方发达国家，尤其是农村地区；城乡间Hcy水平的差别可能更大程度反映了环境因素的影响。
在血浆中，Hcy有三种形式Hcy、双硫Hcy-Hcy和双硫Hcy-半胱氨酸。在正常人体内游离型Hcy仅为血中总tHcy的2％左右。约80％Hcy以双硫键与白蛋白结合。双硫Hcy-Hcy和Hcy-半胱氨酸约为血中tHcy的10％～15％。测定Hcy的方法较多，目前常用的有①高效液相色谱法(HPLC)；②酶免疫分析法(EIA)；③离子色谱法；⑤荧光偏振免疫分析法。目前临床常用且比较成熟的方法是高效液相色谱和气相色谱质谱联用法。但是都存在操作比较复杂、试验耗时较长、重复性欠佳、成本较高、不易普及推广等缺陷。
一项孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法已于2001年4月2日申请专利，专利申请号为01107305.5，授权公告号为CN1155722C。该发明为孕前基因报警诊断试剂盒及其检测方法。所说的报警基因包括亚甲基四氢叶酸还原酶基因和甲硫氨酸合酶还原酶基因，其突变位点分别为C677T和A66G，并且分别提供了相应的引物序列，可在孕前诊断子代是否发生神经管畸形。
由于同型半胱氨酸为很多疾病特别是心脑血管性疾病的危险因素，同型半胱氨酸的水平与疾病的发生、发展以及预后等密切相关，而临床常用的测定同型半胱氨酸的检测方法存在一定缺陷，而且缺乏预见性，为了更早地预见同型半胱氨酸水平，同时更好地预防和干预同型半胱氨酸相关联疾病发生的进程，迫切需要对同型半胱氨酸的水平进行早期预测，本发明即提供一种预测同型半胱氨酸水平的方法和试剂盒以及用途，以及预测同型半胱氨酸相关联疾病发生的方法和试剂盒以及用途。
发明内容
本发明为同型半胱氨酸水平以及同型半胱氨酸相关联疾病发生的预测提供一种方法和试剂盒，即通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的可能性。在多态性位点基因型分析的基础上可以预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的可能性，因此能够更早地预防同型半胱氨酸水平的升高，更好地预防或者干预同型半胱氨酸相关联疾病的发生及进程，减轻患者痛苦，降低医疗成本。
本发明的一个方面，涉及MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的用途。
在本发明所述的用途中，所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A、A1317G中的多态性位点。在本发明中，所述的MTHFR的多态性位点还可以进一步包含与上述或者其他预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明中，所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病。具体的，当(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
本发明的又一方面，涉及一种用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸。优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测MTHFR基因的多态性位点基因型，或者(2)用于检测MTHFR基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与MTHFR基因上的多态性位点的核酸杂交，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
本发明中，所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
本发明的再一方面，涉及一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，所述方法包括步骤(1)利用上述的多态性分型寡核苷酸检测来自生物样品中所述MTHFR基因的多态性位点基因型；(2)根据所述MTHFR基因的多态性位点基因型预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病。
在本发明所述的方法中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
在本发明中，所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病。具体的，当(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
在本发明所述的方法，可以使用包括选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应—限制性片段长度多态性、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、Taqman生物检测方法。
PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法。生物芯片是指采用广岛原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量或质量。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP、Taqman技术、生物芯片、核酸芯片或者试剂盒。本发明对于多态性位点基因型的检测方法的说明并非是对于检测方法的限定，任何本领域技术人员采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点基因型来预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的方法均属于本发明内容，还可以进一步包括采用常规的生物技术方法通过检测本发明的多态性位点功能型基因型的转录产物和/或者表达产物的差异间接反映相关联的多态性位点来预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的方法。
本发明的另一方面，还涉及一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，其中所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病，所述试剂盒包含至少一种本发明所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。具体的，当(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
本发明提供的试剂盒中MTHFR的多态性位点基因型还可以进一步包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G中的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。本发明提到的试剂盒至少包括测定MTHFR的C677T多态性位点，还可以进一步包括测定上述的MTHFR其他多态性位点中的一个或者一个以上位点，也包括上述多态性位点的不同的排列组合。
在本发明所述的方法和试剂盒中所述的生物样品选自血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、排泄物样本等。
所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，或者包含运用芯片、微检测系统等方法进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
基于MTHFR基因，针对其不同的多态性位点，可以设计并且获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病。基于本发明的预测方法和用途获得的各种诊断剂和试剂盒也属于本发明范围。
本发明中的“试剂盒”不限于试剂盒的固有形式，可以表现为微芯片、微检测系统或者依赖于各种载体的检测系统，以及包括前述检测系统的统一包装形式，如微孔板系统、纸质载体、玻璃载体、尼龙膜载体，塑料载体、硅胶载体、凝胶载体、膜质载体等。
本发明是基于多年的流行病学研究，对于参与研究的个体分别检测MTHFR基因的多态性位点基因型和同型半胱氨酸水平进行分析，基于研究分析结果开发了相应的试剂盒，并且通过试剂盒的检测验证，确立了本发明中的用途和方法。
人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3上，基因包括11个外显子和10个内含子，外显子的长度分别为99-252bp，内含子长度分别为192-981bp，cDNA全长2.2kb，编码一种黄素蛋白，其生化功能是催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应Zhou J，Kang SS，Wong P WK，et al.Purification and characterization ofmethylenetetrahydrofolate reductase from human cadaver liver.Biochem Med Metab Bio，1990，43234-242.。5-甲基四氢叶酸是一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中同型半胱氨酸的复甲基化有关。MTHFR的多态性位点基因型，将改变MTHFR的功能活性。MTHFR酶活性降低，会导致Hcy在体内蓄积，而Hcy不仅与心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。
高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。
常见的单核苷酸多态性(SNP)位点可以位于基因的外显子部位、内含子部位和非编码区部位包括调节部位，优选为外显子部位，尤其是能改变编码的氨基酸序列的多态性位点。
本发明人研究发现MTHFR的常见的多态性位点表现为但不限于以下形式C677T、A1298C、G1793A、G215A、G482A、A1317G，优选为C677T。MTHFR的多态性位点基因型，尤其是上述位于外显子部位能够影响到相应编码氨基酸序列的多态性位点，常常会影响到MTHFR的酶功能和活性，因此间接或者直接影响到同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的发生。即通过测定MTHFR的多态性位点基因型，可以预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病。
在已知MTHFR基因的C677T的多态性情况下，比较不同个体的体内血液中同型半胱氨酸的水平，发现不同的MTHFR基因的C677T多态性位点基因型，同型半胱氨酸的水平不同，基因型为677TT纯合突变型个体与基因型为677CC野生型个体和/或677CT杂合型个体比较，体内同型半胱氨酸水平升高较明显，提示MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高；所述的基因型为677CC野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低。
通过进一步按照同型半胱氨酸的浓度分成不同的水平，分别以不同的浓度水平作为界值进行分析，结果发现，不同的MTHFR基因的C677T多态性位点基因型可以预测不同水平的同型半胱氨酸浓度，分别具有较高的预测的阳性预测值和阴性预测值。
进一步分析发现，对于不同浓度水平的同型半胱氨酸，不同的MTHFR基因的C677T多态性位点基因型有不同的比值比，而且随着同型半胱氨酸水平的增高，MTHFR基因的677TT纯合突变型与677CC野生型和/或677CT杂合型相比，比值比随之增高，提示MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大。
本发明的再一方面，还提供了利用功能基因预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的方法及试剂盒，可作为同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的可能性的指示系统，即通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病。在多态性位点基因型分析的基础上可以预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病，能够因此更早地预见同型半胱氨酸水平，同时更好地预防和干预同型半胱氨酸相关联疾病的进程，降低医疗成本。
本发明内容中，我们特别设计了用于测定多态性位点基因型位点的引物序列，并且根据该引物序列和靶序列特点确定了扩增效率高、特异性好和省时的检测方法，方便本领域的普通技术人员掌握和使用，有很好的实用价值。
特别是针对MTHFR的C677T多态性位点基因型设计了如下检测所用的PCR扩增引物，与常规的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好和省时，有更好的使用价值。MTHFR的C677T多态性位点基因型的特异性PCR扩增引物如下，扩增得到的片段长度为274bp正向引物5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’反向引物5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’具体实施方式
实施例1测定MTHFR基因的C677T(Ala222Val，dsSNP IDrs1801133)多态性位点并预测同型半胱氨酸水平(一)测定MTHFR基因的C677T多态性位点基因型(1)提取宿主细胞的基因组DNA(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；(b)于4℃、2000转/分离心10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40μl、RNA酶50μl，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟，将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml离心管中，75％乙醇1ml洗DNA絮状物后，室温干燥；(e)加DNA水化液1.0ml，置摇床，摇动过夜，备用；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFRC677T多态性位点根据MTHFR C677T基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’反向引物5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’PCR反应体系基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，10×buffer1.0μl，Gold Taq DNA聚合酶3U，ddH2O补足总体积至10μl。
PCR反应条件95℃预变性10min后；94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min；得到274bp的扩增片段。
酶切条件及体系(15μl)MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为274bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#21.5μl，HinfI内切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
HinfI内切酶识别位点为 基因型结果判定
将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC；酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT；酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT。
(二)同型半胱氨酸水平的预测MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
以上方法通过流行病学研究验证，先将个体按照MTHFR C677T基因型分为三组677CC纯合野生型组、677CT杂合型组和677TT纯合突变型组，分别测定同型半胱氨酸水平及其他如性别、年龄、身高、体重等生理参数，分析不同的基因型与基线同型半胱氨酸水平之间的关系，结果如下不同的MTHFR C677T多态性位点基因型个体的体内同型半胱氨酸水平不同，在677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型和/或677CT杂合型个体比较，同型半胱氨酸水平升高明显，经过多因子校正后的均值差异仍达到统计学显著性水平，提示MTHFR基因C677T多态性位点基因型和同型半胱氨酸水平有关，其中，677TT纯合突变型个体同型半胱氨酸水平较高(18.65±11.03μmol/L)，与677CC纯合野生型个体相比(10.74±3.60μmol/L)差别有显著性(p＜0.01)；而CT杂合型个体同型半胱氨酸水平略高(11.19±4.30μmol/L)，与677CC纯合野生型个体相比(10.74±3.60μmol/L)差别无显著性(p＝0.23)(见表1)。
表1 MTHFR基因C677T多态性位点基因型与同型半胱氨酸水平的关系
注*基因型CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR 677CT杂合型；#调整了性别、年龄、身高、体重等因素。
我们进一步采用病例—对照的研究方法，分别按照同型半胱氨酸水平为10μmoll/L、15μmol/L、20μmol/作为3个分界值(cut off)，分析MTHFR C677T多态性位点基因型与同型半胱氨酸水平的预测作用。结果如表2所示，当以同型半胱氨酸水平＝10μmol/L为分界值时，阳性预测值为76.8％，提示当MTHFR基因型为TT纯合突变基因型时，预测同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的有效率为76.8％；当以同型半胱氨酸水平＝15μmol/L为分界值时，阴性预测值为89.3％，提示当MTHFR基因型为CC纯合野生基因型时，预测同型半胱氨酸水平＜15μmol/L的有效率为89.3％；当以同型半胱氨酸水平＝20μmol/L为分界值时，阴性预测值为98.3％，提示当MTHFR基因型为CC纯合野生型时，预测同型半胱氨酸水平＜20μmol/L的有效率为98.3.％。研究结果表明，当所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高；当所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型时，预测同型半胱氨酸水平较低。
表2 MTHFR基因C677T多态性位点基因型与同型半胱氨酸水平的预测作用
注CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型。
我们进一步分析MTHFR C677T多态性位点基因型的TT纯合突变基因型与CC纯合野生型相比，发生同型半胱氨酸水平增高的危险性，即比较不同的MTHFR基因型的个体发生同型半胱氨酸水平升高的可能性。结果如表3所示，当以同型半胱氨酸水平＝10μmol/L为分界值时，MTHFR 677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的可能性是677CC纯合野生型个体的同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的可能性的2.8倍，即MTHFR 677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型个体相比，同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的危险性为2.8(OR＝2.8，95％CI＝2.1-4.8)，差别有显著性；当以同型半胱氨酸水平＝15μmoll/L为分界值时，MTHFR 677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的可能性是677CC纯合野生型个体的同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的可能性的6.1倍，即MTHFR 677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型个体相比，同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的危险性为6.1(OR＝6.1，95％CI＝4.2-9.7)，差别有显著性；当以同型半胱氨酸水平＝20μmol/L为分界值时，MTHFR 677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的可能性是677CC纯合野生型个体的同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的可能性的23.5倍，即MTHFR 677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型个体相比，同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的危险性为23.5(OR＝23.5，95％CI＝11.3-52.1)，差别有显著性。研究结果表明，当所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；当所述MTHFR多态性位点型为677CC纯合野生型时，预测同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大。
表3 MTHFR基因C677T多态性位点基因型与高Hcy血症发生率关系的Logistic回归分析
注*基因型CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；#调整了性别、年龄、身高、体重等因素。
由表1中结果可知，CT杂合型的同型半胱氨酸水平与CC纯合野生型的同型半胱氨酸水平无显著的统计学差异，我们将CT杂合型和CC纯合野生型个体合并为一组，将TT纯合突变型作为另外一组，仍然按照如上的病例—对照的研究方法，分别按照同型半胱氨酸水平为10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L作为3个分界值(cut off)，分析MTHFRC677T多态性位点基因型与同型半胱氨酸水平的预测作用，得到如上相似的结果。具体结果如表4所示，当以同型半胱氨酸水平＝10μmol/L为分界值时，阳性预测值为76.8％，提示当MTHFR基因型为TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的有效率为76.8％；当以同型半胱氨酸水平＝15μmol/L为分界值时，阴性预测值为84.1％，提示当MTHFR基因型为CC纯合野生型和/或CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平＜15μmol/L的有效率为84.1％；当以同型半胱氨酸水平＝20μmol/L为分界值时，阴性预测值为96.7％，提示当MTHFR基因型为CC纯合野生型和/或CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平＜20μmol/L的有效率为96.7％.。研究结果表明，当所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高；当所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低。
表4 MTHFR基因C677T多态性位点基因型与同型半胱氨酸水平的预测作用
注CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR 677CT杂合型。
同样，我们进一步分析MTHFR C677T多态性位点基因型的TT纯合突变基因型与CC纯合野生型和/或677CT杂合型相比，发生同型半胱氨酸水平增高的危险性，即比较不同的MTHFR基因型的个体发生同型半胱氨酸水平升高的可能性。结果如表5所示，当以同型半胱氨酸水平＝10μmol/L为分界值时，MTHFR 677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的可能性是677CC纯合野生型个体的同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的可能性的5.7倍，即MTHFR 677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型和/或677CT杂合型个体相比，同型半胱氨酸水平≥10μmol/L的危险性为5.7(OR＝5.7，95％CI＝2.1-8.6)，差别有显著性；当以同型半胱氨酸水平＝15μmol/L为分界值时，MTHFR677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的可能性是677CC纯合野生型和/或677CT杂合型个体的同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的可能性的11.2倍，即MTHFR677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型和/或677CT杂合型个体相比，同型半胱氨酸水平≥15μmol/L的危险性为11.2(OR＝11.2，95％CI＝3.7-32.4)，差别有显著性；当以同型半胱氨酸水平＝20μmol/L为分界值时，MTHFR 677TT纯合突变型个体的同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的可能性是677CC纯合野生型和/或677CT杂合型个体的同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的可能性的23.5倍，即MTHFR 677TT纯合突变型个体与677CC纯合野生型个体相比，同型半胱氨酸水平≥20μmol/L的危险性为27.5(OR＝27.5，95％CI＝12.1-87.9)，差别有显著性。研究结果表明，当所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；当所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大。
表5 MTHFR基因C677T多态性位点基因型与高Hcy血症发生率关系的Logistic回归分析
注*基因型CC，代表MTHFR 677CC纯合野生型；TT，代表MTHFR 677TT纯合突变型；CT，代表MTHFR 677CT杂合型；#调整了性别、年龄、身高、体重等因素。
实施例2测定MTHFR C677T多态性位点基因型预测同型半胱氨酸水平的试剂盒(一)试剂盒的组成成分核酸提取试剂，PCR反应试剂，MTHFR C677T多态性位点基因型特异性引物、核酸聚合酶、限制性内切酶、酶切反应混合液和阳性对照模板、阴性对照模板，分别分装后组装成的试剂盒。其中阳性对照模板包括MTHFR C677T纯合野生型、杂合型、纯合突变型阳性对照模板；特异性引物为能够特异性扩增至少含有MTHFR C677T多态性位点的引物。
(二)检测的步骤(1)提取宿主细胞的基因组DNA(a)取400μl红细胞裂解液加入1.5ml离心管中，加入100μl左右新鲜全血或者抗凝全血。37℃水浴5分钟，15000g离心1分钟；(b)去上清，加入100μl白细胞裂解液，高速振荡30秒至液体均一，37℃水浴5分钟。加入35μl蛋白沉淀液，高速振荡20秒后15000g离心90秒，离心管底可见褐色沉淀；(c)将上清液全部移入装有100μl异丙醇的1.5ml离心管中，来回轻柔的摇匀数次至有白色絮状物出现；(d)弃上清液，注意保留白色沉淀，加入100μl 75％乙醇(以无水乙醇配制)，15000g离心90秒，弃上清，室温干燥沉淀；(e)加核酸储存液100μl，所得溶液即为全血基因组DNA；(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度。
(2)使用PCR和限制性酶切片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFR677CT多态性位点根据MTHFR 677CT基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。
引物序列正向引物5’-CTT TGA GGC TGA CCT GAA GC-3’反向引物5’-CTG GGA AGA ACT CAG CGA AC-3’PCR反应体系基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20μmol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，，10×buffer1.0μl，Gold Taq DNA polymerase 3U，ddH2O补足总体积至10μl。
PCR反应条件
95℃预变性10min后；94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min。得到274bp的片段。
酶切条件及体系(15μl)MTHFR C677T位点PCR产物目的片段长度为274bp，总的酶切体系为15μl，其中PCR产物10μl，10×NEBuffer#2 1.5μl，HinfI内切酶4U(0.4μl)，和3.1μl ddH2O，37℃过夜。
HinfI内切酶识别位点为 (三)基因型测定的结果判定将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下酶切片段为274bp，MTHFR基因型为677CC纯合野生型；酶切片段为274+228+46bp，MTHFR基因型为677CT杂合型；酶切片段为228+46bp，MTHFR基因型为677TT纯合突变型。
(四)对于同型半胱氨酸水平的预测根据上述步骤(三)的基因型结果，参照与实施例1的步骤(二)相同的预测方法，对于同型半胱氨酸水平进行预测。
MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
权利要求
1.MTHFR基因的多态性位点基因型用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述MTHFR基因的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其中(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
6.一种用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测MTHFR基因的多态性位点基因型，或者(2)用于检测MTHFR基因的多态性位点基因型的寡核苷酸探针，其能特异地与MTHFR基因上的多态性位点的核酸杂交，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，优选地，寡核苷酸探针的长度为15-50个核苷酸。
7.如权利要求6所述的多态性分型寡核苷酸，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
8.一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，所述方法包括步骤(1)利用权利要求6或7所述的多态性分型寡核苷酸检测来自生物样品中所述MTHFR基因的多态性位点基因型；(2)根据所述MTHFR基因的多态性位点基因型预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含C677T多态性位点，还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病。
11.如权利要求8所述的方法，其中(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
12.如权利要求8所述的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术聚合酶链反应、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针法、PCR-序列特异寡核苷酸法、序列测定、PCR-序列特异性引物法、PCR-荧光法、PCR指纹图法、寡核苷酸连接分析、荧光能量共振转移的检测法、生物芯片、核酸芯片、质谱技术、基因扫描、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶或化学错配切割法、和Taqman生物检测方法。
13.一种利用MTHFR基因的多态性位点基因型预测生物样品中同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型至少包含选自C677T多态性位点，其中所述的同型半胱氨酸相关联疾病包括动脉粥样硬化性疾病、冠心病、脑血管疾病、肾功能损害、外周血管疾病、动静脉血栓性疾病、高血压、高血脂、糖尿病、精神性疾病，所述试剂盒包含至少一种如权利要求6或7中任一项所述的多态性分型寡核苷酸，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述MTHFR的多态性位点基因型还可以包含选自A1298C、G1793A、G215A、G482A和A1317G的多态性位点，还可以进一步包含与上述预测同型半胱氨酸水平的基因多态性位点存在连锁不平衡的多态性位点，包括无义突变位点、错义突变位点以及位于基因内含子部位、基因调节部位的多态性位点。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其中(1)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测同型半胱氨酸水平较高，并且同型半胱氨酸水平升高的可能性较大；(2)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测同型半胱氨酸水平较低，并且同型半胱氨酸水平不升高的可能性较大；(3)所述MTHFR多态性位点基因型为677TT纯合突变型时，预测发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大；(4)所述MTHFR多态性位点基因型为677CC纯合野生型和/或677CT杂合型时，预测不发生同型半胱氨酸相关联疾病的可能性较大。
16.如权利要求8所述的方法和/或权利要求13所述的试剂盒，其中所述的生物样品选自血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述生物样品为血液样品。
全文摘要
本发明涉及亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的多态性位点基因型用于预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的用途，用于测定MTHFR基因的多态性位点基因型的多态性分型寡核苷酸，通过测定MTHFR基因的多态性位点基因型，预测同型半胱氨酸水平和/或同型半胱氨酸相关联疾病发生的方法和试剂盒。属于医药领域。
文档编号C12Q1/68GK101037708SQ20061006491
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月17日 优先权日2006年3月17日
发明者徐希平, 戴成祥, 王燕, 蒋善群, 张克荣, 毛广运, 张善春, 王梦德, 刘平, 王玉, 邢厚恂 申请人:北京华安佛医药研究中心有限公司, 安徽省生物医学研究所