专利名称：通过ERCC2等基因的SNPs检测肺癌易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测肺癌易感性的试剂盒，通过同时检測细 胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450， family 1， subfamily A， polypeptide 1 ， CYPlAl )、多聚ADP核糖 转移酶家族成员1 (poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1, PARP1,又简写为ADPRT)和切除修 复复合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2， ERCC2)的单核苷酸多态性位点(SNP)来预测个体对肺癌的易感性。
背景技术：
原发性支气管肺癌，简称肺癌，为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一，是一种严重威胁人类健康和 生命的疾病。肿瘤细胞源于支气管粘膜或腺体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有刺激性咳嗽、痰 中带血等呼吸道症状，病情进展速度与细胞的生物特性有关。半个世纪以来,世界各国肺癌的发病率和病死率都有明显增高趋势。世界卫生组织(WHO)2000年报告 1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6%,其中肺癌占恶性肿瘤死亡的'19%,居 恶性肿瘤死因的第一位。我国1990 1992年的抽样调査显示，在城市人口的肿瘤死亡中，肺癌由原来的 第4位上升为第I位，农村上升最快的也是肺癌。云南锡矿的肺癌发病率在1954 1959年间为28.02/10 万，1960 1969年间为197.87/10万，1970 1979年间上升到219.10/10万，这在全世界也是罕见的。英国 著名肿瘤学家R.Peto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万， 成为世界第一肺癌大国。病因和发病机制迄今尚未明确。 一致认为肺癌的发病与下列因素有关①吸烟(包括主动吸烟和被动 吸烟)②职业致癌因子，已被确认的致人类肺癌的职业因素包括石棉、无机砷化合物、二氯甲醚、铬及 其化合物、镍、氡、芥子气、氯乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等；③空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染)；④电离辐射；⑤饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的前瞻性人群观察的结果说明，食物中天然维生素A类、e胡萝卜素的摄入量与十几年后癌症的发生呈负相关，其中最突出的是肺癌；⑥其他，美国癌症学会将结核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺癌的危险性是 正常人群的10倍。其主要组织学类型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲霉)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺癌的发生可能也起一定的综合作用。近年研究表明，肺癌的发生与某些癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相关。己经证明的几个癌基因 家族包括引起突变的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗癌 基因p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小细胞肺癌中均有过度表达。 非小细胞肺癌中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺癌提供理论基础。SNP (single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DM 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性和对环境因素、药物反应的差异。CYPlAl基因位于第15号染色体15q22-q24位置，全长6.0kb， mRNA全长2601bp,共有7个外显子, 编码513个氨基酸的细胞色素P4501A1。 P4501A1是重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酵类，被瀲活的 CYPlAl能将多种环境中的有机物质如:PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多环芬芳碳氢化合物转 化为细胞毒素或其他致癌物质，从而增加癌症发生的危险。国内外韵众多研究显示CYPlAl的多态与野生 型相比有更高的酶接触反应活性和可诱导性，从而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危险度。细胞色素P450酶(CYP450)是细胞内重要的I相代谢嗨，在致癌物的活化和解毒过程中起着重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多环芳烃类致癌物的主要酶类。CYPlAl作为一种微神经元体细胞酶 与一些致癌物质的生物激活有关，例如benzo[apyrene。同时，CYPlAl易于被TCDD和多环的芳香族化 合物所诱变，包括3-甲基胆恶等买验室用致癌物质。目前的动物实验表明，CYP1A1的表达与芳基碳S化 合物受体(AhR)和Arnt (AhRNuclear Translocator〉的激动剂，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗剂有关。同时，CYP1A1通过C2羟基化作用参与雌激素的代谢活动。rel048943是位于CYP1A1基因上的一个A/G多态，位于第7外显子462号氛基酸由He转化为Val。 目煎NCB1公布的世界人口频率A:G为0.896:0.104,杂合度0.186。世界人群的关联分析表明，CYP1A1 Ue462Val位点ValVal和Vallle基因型在肺癌病例组中的频率明显高于对照组，在女性中风险度尤其突出。 基于多个中国人群肺癌发病与CYP1A1 He462Val位点的关联分析研究，上千例肺痛个体与健康对照个体的 分析，显示CYPlAlIle462Val这种位于酶蛋白的血红素结合区的变异，是中国人群中重要的肺癌遗传易感 因素之一。酶动力学研究表明，3种基因型表达的酶活性存在差异。Val/Val活化毒物的能力最强，Ile/Val 次之，而lle/Ile最弱。研究显示，CYPlAlValVal基因型是中国人群中重要的肺癌遗传易感因素之一。PARPl基因位于第l号染色体lq41-q42位置，全长47.3kb, mRNA全长3861bp,共有23个外显子， 编码1015氨基酸的多聚ADP核糖转移酶蛋白。这种酶通过聚ADP核糖基化反应修正多种核蛋白。这种 修正以DNA为基础，参与多种重要的细胞活动，例如分化，增殖，肿瘤转移等，同时也参与分子水平 的活动，例如修复DNA受损的细胞等等。PARP1的主要功能通常被描述为3个方面丄DNA修复功能 (BER): 2.抑制受损DNA的转录3.耗尽细胞中的能量，导致细胞凋亡；4.参与部分基因的转录调控。 这些功能可以修复细胞中受损的DNA,抑制破损DNA的转录，甚至杀死无法修复的细胞，达到抑制癌症 发生的作用。研究发现，PARP1功能缺失会提高乳腺癌，肺癌等癌症的发病率。rsll36410是位于第1号染色体上PARP1基因上的一个T/C多态，弓I起PARP1基因编码的蛋白第762 个氨基酸由Vai变为Ala。 NCBI公布的世界人群中的该多态的频率分布，T占0.808， C占0.192左右，杂 合度为0.311。分子生物学研究表明，PARP1上762号氨基酸由Val转化为Ala,降低了酶的活性，导致多 种癌症的发生风险升高。大样本的中国人群的关联分析显示，该位点的多态现象是中国人群中重要的肺癌 影响因素之一。ERCC2,位于第19号染色体19ql3.3位置，共有23个外显子，基因全长19.0kb, mRNA全长2355bp, 编码含761个氨基酸的蛋白。由ERCC2编码的蛋白参与转录偶联的核苷酸切除修复，它可识别与修复结 构无关的大范围的损伤，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚体，并且是基本转录因子复合物BTF2rTFIIH的一 个组成成分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，属于RAD3/XPD解旋酶亚家族。ERCC2的功能 缺失导致基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点,从而使碱基切除修复无法正确进行,导致DNA 上的致癌损伤积累。ERCC2基因的突变或者失活可能导致的疾病包括癌症、着色性干皮病、毛发硫营养 不良、柯凯因氏综合症。rel3181是位于第19号染色体ERCC2基因第23号外显子段Lys751Gln的T/G多态。世界人群中的频 率约为T:G =0.798: 0.202,杂合度0.322,中国人群中的频率约为T:G =0.91: 0.09。目前的多项研究表明， Lys751Gln的氛基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，这个位点的多态性与肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮肤 癌等疾病有关。ERCC2 Lys751Gln位点的多态现象与肺癌特别是肺鳞癌的发生存在显著关联。rsl799793是位于第19号染色体ERCC2基因第10号外显子段Asp312Asn的G/A多态。世界人群中 的频率约为G:A=0.778:0.222，中国人群中的频率约为G:A=0.94:0.06。目前的多项研究表明，该位点的多 态会导致ERCC2参与构成的转录因子复合物的性能发生弱化，从而使得对DNA损伤修复的能力下降，转 录因子的能力也同时发生下降，导致一系列诸如肺癌，前列腺癌等疾病的发生。ERCC2Asp312Asn多态性 与肺癌特别是肺鳞癌发生有显著关联，该位点的多态现象被认为是中国人群中肺癌遗传易感因素之一。国内外的大量的关联分析表明，CYP1A1基因上rsl048943号SNP位点基因型为G时肺癌的发生几率 增加；PARPl基因上rsll36410号SNP位点基因型为C时肺癌的发生儿率增加；ERCC2基因上rsl3181号 SNP位点基因型为G时肺癌的发生几率增加；ERCC2基因上rsl7的793号SNP位点基因型为A时肺痛的发 生几率增加。这四个SNPs位点的多态性可用于评估个体对肺痛的易感性。发明内容基于CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点、.PARP1基因上的rsl136410号SNP位点和ERCC2基因 200610116668.8说明书第3/9页上的rsl3181号及rsl799793号SNP位点的^态性可用于评估个体对肺癌的易感性的基础上，本发明提供 一种检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检 测PARP1基因上的rsl136410号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检测ERCC2基因上的rel3181 号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检测ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点的特异性引 物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点、PARP1基因上的 rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点 而设计，能特异性扩增出耙位点的DNA片段。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地, 试剂盒中包含具有SEQ ID NO: l和2所示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对、具 有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物对。特异性引物对可 用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这四对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点、PARP1基因上的 rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点 而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这四个SNPs位点肺癌易感基因型的探针。设计这类探针 是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 9、 10、 11和12所示序列的 Taqman探针。特异性荧光探针可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异 性荧光探针不限于这四条探针，所有可用于荧光定量PCR检测CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点、 PARPl基因上的rsll36410号SNP位点、ERCC2基因上的rs13181号.SNP位点和ERCC2基因上的rsl 799793 号SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括 lfil 10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0. lul 25mM dNTP混合液， 0. 5nl 25mM MgCl2溶液， 0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对(八条)各0.225nl， 10nM特异性荧光探针(四条)各0.25nl， 去离子水3. 58nl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用可检测肺癌昜感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针-有义引物l: 5' - GTGTTAAGTGAGMGGTGAT -3' (SEQ ID NO: 1) Tm值为56'C反义引物l: 5， - AGGATAGCCAGGMGAGAAA -3' (SEQ ID NO: 2) Tm值为58t:有义引物2: 5， - TTTGCCATTCACTGTGTTGG -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值为58。C
反义引物2:5，-atccttgctgctatcatCa -3,(seqidno:4)Tm值为541:有义引物3:5，-actcaggagtcaccaggAa -3，(seqidno:5)Tm值为58'c反义引物3:5'-TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3，(SEQIDNO:6)Tm值为58'C有义引物4:5'-ATCAAAGAGACAGACGAGCA _3，(SEQIDNO:7)Tm值为58'C反义引物4:5，-TCAGGMGCCCAGGAAAT -3，(SEQIDNO:8)Tm值为54'C荧光探针1:5'-TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3'(SEQIDNO:9)Tm值为64X:荧光探针2:5'- CAGGCCAAGGCGGAAATGCT -3，(SEQIDNO:10) Tm值为64"荧光探针3:5，-MTCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3，(SEQIDNO:11) Tm值为66"C荧光探针4:5，-TGCCCMCGAAGTGCTGCAG -3，(SEQIDNO:12) Tm值为64X:有义引物1,反义引物1和荧光探针1特异地针对检测CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点多态性; 有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异地针对检测PARPl基因上rsll36410号SNP位点多态性有义 引物3，反义引物3和荧光探针3特异地针对检测ERCC2基因上的rel3181号SNP位点多态性有义引 物4，反义引物4和荧光探针4特异地针对检测ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点多态性。荧光定量PCR反应体系为总体积lOnl，包含浓度为20ng/jil的DNA模板2^1、 1^1 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1^1 25raM dNTP混合液、0.5^1 25raM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有义引物l、 2 、 3和4各0.225nl、 20一的反义引物1、 2 、 3和4各0.225nl、 lOpM的荧光探 针l、 2 、 3和4各0.25nl，去离子水3.58nl。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行印个循环的 95'C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针1最终的荧光信号明显高于 正常对照，说明被检测DNA的CYPlAl基因上rsl048943号SNP位点基因型携带有G型，为肺癌易感型； 荧光探针2最终的荧光信号明显髙于正常对照，说明被检测DNA的PARP1基因上rsl136410号SNP位点基 因型携带有C型,为肺癌易感型;荧光探针3最终的荧光信号明显髙于正常对照,说明被检测DNA的ERCC2 基因上的rsl3181号SNP位点基因型携带有g型，为肺癌易感型；荧光探针4最终的荧光信号明显髙于正 常对照，说明被检测DNA的ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点基因型携带有A型，为肺癌易感型。实施例2.指导人们主动预防肺癌的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的dm抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检測者DNA的CYP1A1基因上rsl048943号SNP位点、PARP1基因上 rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点 同时进行荧光定量PCR检测，确定这四个SNPs位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺癌通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因 检测报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检测者
的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检测者肺痛遗传易感的相对风险。 同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并 为被检测者普及预防肺癌的健康知识。 序列表〈110>上海主健生物工程有限公司<120>通过ERCC2等基因的SNPs检测肺癌易感性的试剂盒〈160〉 12<210〉 1 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列<220〉<223〉引物 〈400> 1gtgttaagtg sgaaggtgat<210> 2 〈211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220〉〈223〉引物 〈400〉 23gg3tagcc8 ggaagagaaa<210> 3 〈211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <400〉 3tttgccattc actgtgttgg202020 〈210> 4 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 〈400〉 4atccttgctg ctatcatca〈210> 5 <211> 19 <212> DNA <213〉人工序列<220><223>引物 <400> 53ctcaggagt cacc明g38〈210> 6 〈211> l'9 〈212> ■ <213>人工序列<220〉<223〉引物 <400> 6tctgttctct gcaggagga<210〉 7<211〉 20<212〉 DNA <213〉人工序列<220><223>引物说明书第7/9页1919<400> 7atc幼ag3g3 c柳cg8gca〈210〉 8 <211> 18 〈212〉 ■ <213>人工序列<220><223>引物 <400> 8tcaggaagcc caggaaat〈210〉 9 <211> 20 〈212〉腿 <213>人工序列<220〉<223>探针 <400> 9tatcggtgag accgttgccc<210> 10 <211〉 20 <212> DM <213〉人工序列〈220>〈223>探针 <■ 10caggccaagg cgg幼8tgct〈210> 11 <211> 22 <212〉 DNA <213>人工序列 <220><223〉探针 <400> 11aatctgctct atcctctgca gc 22<210> <211> <212> <213>12 20 醒人工序列<220〉<223>探针 〈400> 12tgcccaacga agtgctgcag 20
权利要求
1.一种检测肺癌易感性的试剂盒，包括同时检测CYP1A1基因上的rs1048943号SNP位点、PARP1基因上的rs1136410号SNP位点、ERCC2基因上的rs13181号SNP位点和ERCC2基因上的rs1799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对CYP1A1基因上的 rsl048943号SNP位点、PARP1基因上的rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和 ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含CYP1A1基因上的rsl048943号SNP 位点、PARP1基因上的rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的rsl3181号SNP位点和ERCC2基因上的 rsl799793号SNP位点的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对CYP1A1基因上的 rsl048943号SNP位点、PARP1基因上的rsl136410号SNP位点、ERCC2基因上的ts3181号SNP位点和 ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这四个SNPs位 点肺癌易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: l和2所 示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物对 以及具有SEQ ID NO: 7和8所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQIDNO: 9、 10、 11和12所示序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂食的组分和含量包括lul 10 X荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lul 25raM dNTP混合液，0. 5pl 25raM MgCl2溶液，0. 02pl (5units/nl) Taq DM聚合酶， 20nM特异性引物对(八条)各0.225nl， 10nM特异性荧光探针(四条)各0.25^1,去离子水3.58^1。本 试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC。
全文摘要
本发明公开了一种检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测CYP1A1基因上的rs1048943号SNP位点、PARP1基因上的rs1136410号SNP位点、ERCC2基因上的rs13181号SNP位点和ERCC2基因上的rs1799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的CYP1A1基因、PARP1基因和ERCC2基因上的SNPs位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号C12Q1/68GK101153325SQ200610116668
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司