专利名称：用于细胞扩增的随时间变化电磁力套筒及其使用方法
技术领域：
本发明一般涉及用于细胞扩增的套筒，更具体地涉及可移动地 容纳培养容器的随时间变化电磁力套筒。本发明还涉及这样的随时间变化电磁力套筒其在使用时对培养容器中的细胞提供随时间变 化的电磁力，用于其中的细胞扩增。技术背景培养细胞的方法已存在多年。 一些方法包括使用如培养瓶或培 养皿的培养室在二维培养物中培养细胞，而其它一些方法包括使用 如生物反应器的培养室在三维培养物中培养细胞。最佳培养细胞的 方法包括将分子(比如生长因子、激素及其它)加入培养物中的细 胞，从而例如上调或下调细胞的扩增。 一些方法经优化用于培养个 体细胞，另一些方法经优化用于组织培养。另外，为了随时间尽量 产生更多的细胞或更大的组织构建体，细胞培养在多种条件下进行。美国专利号6,643,597, Wolf等公开了使用随时间变化电磁力 ("time varing electromagnetic force, TVEMF")在培养物中培养细 胞。Wolf等公开了使用电极为细胞培养物提供电磁力，用于其生长。 在使用导电线圏而不是电极为细胞培养物传递TVEMF的情况下， 所述线圏与培养室集成在一起，并且固定在它上面。由于在培养物 中扩增的细胞可能被引入人体用于组织再生或治疗人体疾病，因此 培养室应该是无菌的。如果待传递给培养室中细胞的TVEMF源与 培养室集成在一起，则每个培养室都应该在不干扰TVEMF源的情 况下灭菌，这是一个麻烦而且耗时的过程，并且如果所述容器将在 每次使用后丟弃，则集成式TVEMF线圏也不得不与之一起丢弃。 无论如何，集成式TVEMF线圏都是昂贵的细胞扩增方法。因此，非常期望能有这样的TVEMF套筒其包含具有内部部 分的导电线圏，其中所述内部部分限定可拆装地容纳培养容器的空 间。也非常期望能有这样的TVEMF套筒其包含具有内部部分和 外部部分的线圏支架、缠绕在线圏支架外部部分上的导电线圏以及
TVEMF源，并且其中线圏支架的内部部分限定可拆装地容纳培养 室的空间。还非常期望能有这样的TVEMF套筒在使用时被导入 到含有细胞的培养容器，并且为培养容器中的细胞提供TVEMF以 用于细胞扩增。本发明克服了之前和现在的细胞培养方法的有关问 题，并且显示出以往未见的优点。发明内容本发明涉及包含具有内部部分和外部部分的导电线圏以及与导 电线圏有效连接的TVEMF源的TVEMF套筒，其中所述内部部分 限定了可移动地容纳培养容器的空间。优选地，所述导电线圏基本 上是刚性的。本发明还涉及包含具有内部部分和外部部分的线圏支架、缠绕 在线圏支架外部部分的导电线圏以及与导电线圏有效连接的 TVEMF源的TVEMF套筒，其中线圏支架的内部部分限定了可移 动地容纳培养容器的空间。本发明还涉及细胞扩增的方法，其包括以下步骤提供随时间 变化电磁力套筒，所述随时间变化电磁力套筒包含具有内部部分和 外部部分的导电线圏，其与TVEMF源有效连接；将含有细胞的培 养容器导入随时间变化电磁力套筒的导电线圏的内部部分；以及通 过随时间变化电磁力套筒为培养容器中的细胞提供随时间变化电磁 力，以用于细胞扩增。所述TVEMF套筒可优选地对培养容器中的 细胞传递脉沖方波(遵循傅立叶曲线)形式的TVEMF，并且所述 TVEMF可优选为约0.05高斯到约6高斯。通过以下用于公开目的而给出的本发明优选实施方案描述，本 发明的其它方面、特征和优点将是4艮明显的。本发明可通过下文所 述的优选实施方案更完整的进行描述，但并不旨在仅限于此。
在附图中，图1是TVEMF套筒的侧视图； 图2是TVEMF套筒的前视图；图3是可移动地邻近并容纳培养室的TVEMF套筒的前视图4是TVEMF套筒的侧视图；图5是导入培养容器的TVEMF套筒的侧视图；图6是TVEMF套筒的侧-见图；图7是导入旋转式培养容器的TVEMF套筒的截面侧视图；和图8是可移动地邻近并容纳旋转式培养容器的TVEMF套筒的截面 侧视图。附图详述在附图中，图1-6展示了可为培养室内的细胞提供TVEMF的 TVEMF套筒10的优选实施方案。图7和8展示了可为旋转式培养 容器内的细胞提供TVEMF的旋转式TVEMF套筒10的优选实施方 案。图1是TVEMF套筒10优选实施方案的侧视图，其包含导电线 圏5和与导电线圏5有效连接的TVEMF源9。短语"有效连接" 以及类似的词和短语旨在指所述TVEMF源可以以这样的形式与导 电线圏连接在运行时，所述TVEMF源可通过导电连接对导电线 圏传递TVEMF，优选4吏用至少一个电导线。所述TVEMF源可优 选固定在导电线圏上，并且可优选与导电线圏集成在一起。在本发 明中，导电线圏可以是任何导电材料。所述导电线圏可优选(但不 限于)为以下导电材料银、金、铜、铝、铁、铅、钛、铀、铁磁 金属和锌或者其组合。导电线圏也可优选包含盐水。本发明的导电 线圏可优选基本为刚性。"基本为刚性"在本发明中旨在指导电线圏 可在不需要支持的情况下维持其形状。导电线圏可以为任何形状， 优选基本为圆柱形，优选具有基本为椭圆形的截面，更优选具有基 本为卵形的截面，最优选具有基本为圓形的截面。导电线圏也可优 选为螺线管一一紧密缠绕的导电线圏。另外，导电线圏可优选缠绕 在绝缘体中，所述绝缘体包括但不仅限于橡胶、塑料、有机硅、玻 璃和陶瓷。优选地，所述绝缘体为导电线圏提供刚性。在图1展示的优选实施方案中，导电线圏5缠绕在线圏支架3 的外部部分上。本发明的线圏支架可优选地由非导电非磁性材料制成，更优选非金属，并且最优选塑料例如聚乙烯。另外，所述线圏 支架可优选包含导电材料，优选铁。不限于理论地，认为铁芯能增
强螺线管的磁场。所述线圈支架的外部部分具有与导电线圏匹配的 形状。"匹配"指所述线圏支架为导电线圏提供支持，并优选决定 并维持导电线圏的形状。所述导电线圏可以缠绕在支持导电线圏形 状的线圏支架的外部部分上，优选具有基本为卵形的截面，更优选基本为椭圆形截面，最优选基本为圆形的截面。在TVEMF套筒IO 的这一优选实施方案中，导电线圏5和线團支架3置于(优选可拆 卸地)为其提供稳定支持的底座11上。图2是图1所展示TVEMF套筒10优选实施方案的前视图，描 述了缠绕在线圏支架3外部部分上的导电线圏5,并且其中导电线圏 5和线圏支架3置于(优选可拆卸地)底座11上。图3是图1和2所展示TVEMF套筒10优选实施方案的前视图， 其还在缠绕了导电线圈5的线圏支架3的内部部分中具有培养容器 1。在本发明中，所述导电线圏和线圏支架(存在时)具有限定可移 动地容纳培养容器的空间的内部部分。"可移动地容纳"和类似术语 指空间的特征，其中培养容器根据需要导入其中和从其中移出。例 如，导电线圏或线圏支架(存在时)内部部分的空间可移动地容纳 培养容器。该空间可接纳培养容器，使得所述培养容器可按照需要 从所述空间移出和/或拆除。所述线圏支架内部部分的空间可以是任 何形状，优选具有可将至少一个培养容器可移动地放置于其上的一 个面。本发明的培养容器可以是可被导电线圏和线圏支架(适用时) 内部部分所包围并包含在其中的培养容器，包括但不仅限于生物反 应器培养容器、旋转式生物反应器培养容器、瓶、板、皿和/或一次 性培养容器。"包围"指导电线圏和线圏支架(适用时)围绕在培养容器上。另外，所述培养容器可以是单个培养容器或者一个以上的 培养容器。本发明的培养容器也能够支持和维持细胞培养物，优选细胞、细胞聚集体、组织或组织样结构的扩增。图4是本发明TVEMF套筒10的另一个优选实施方案的侧视图， 其具有导电线圏105和有效连接的TVEMF源109。导电线圏105 以基本为圆柱体的形状缠绕，优选具有基本为卵形的截面，更优选 具有基本为圆形的截面，最优选具有基本为椭圆形的截面。在此优 选实施方案中的导电线圏105基本为刚性，并且优选是绝缘的。绝 缘体可优选地提供形成导电线圏形状的刚性。TVEMF套筒10的导 电线圏的截面大至足以可移动地容纳和包围培养容器。另外，导电 线圏105可移动地邻近培养容器101。"可移动地临近"和类似术语 指导电线圏可与所述培养容器相邻、接近或接触，从而使其易于从 所述培养容器移出或拆除。图5展示了 TVEMF套筒10的又一个优选实施方案的侧视图， 其具有导电线圏205和与导电线圏205有效连接的TVEMF源209。 在TVEMF套筒10的此优选实施方案中，导电线圈205缠绕在线圏 支架203的外部部分上。图5还展示导入培养容器201(例如培养脏) 的TVEMF套筒IO。在此优选实施方案中，培养容器201放置在升 降器213上，升降器213又放置(优选可拆卸地放置)在底座211 上，使得升降器213可从底座211移去，并且可如所需进行清洁、 灭菌和/或保存。导电线圏205放置在(优选可拆卸地)底座211上。 为了将培养容器201导入TVEMF套筒10，将培养容器201放置在 升降器213上，接着将导电线圏205和线圏支架203放置在培养容 器201上。术语"导入"和类似术语旨在指导电线圏或线圏支架(适 用时)的内部部分中可移动地接纳和容纳培养容器。操纵TVEMF 套筒使其包围并可移动地邻近培养容器就认为是将TVEMF套筒导 入培养容器。另外，操纵培养容器使其被TVEMF套筒所包围也认 为是将培养容器导入TVEMF套筒。在本发明中，在使用时一旦导入后，TVEMF套筒的导电线圏即可移动地邻近培养容器，同时包 围培养容器。图6是图5所展示TVEMF套筒10的优选实施方案的侧视图。 TVEMF套筒10包含导电线圏205和有效连接的TVEMF源209。 在图6中，与图5—样，导电线圏205缠绕在线圏支架203的外部 部分上。线圏支架203可移动地邻近并包围培养容器，缠绕了导电 线圏205的线圏支架203可拆卸地放置在底座211上。图7是TVEMF套筒10以及将其导入旋转式培养容器301的另 一个优选实施方案的截面侧视图。图6中优选实施方案的TVEMF 套筒10包含导电线圏305和与导电线圏305有效连接的TVEMF源 309。在此优选实施方案中，导电线圏305缠绕在线圏支架303的外 部部分上，并且TVEMF套筒IO是旋转式的。在一个末端上，第一
导线325和第二导线326与TVEMF源309相连。在另一末端上， 线325、 326与至少一个环相连以便于导电线圉305旋转，优选分别 与第一环321和第二环322相连。在图7中还描述了由底座311支 撑的马达外壳312。马达313固定在马达外壳312的内部，并且通过 第一线314和第二线315连接到控制盒316，其中容纳有控制装置， 由此马达313的速度可以通过旋转控制旋钮317进行增量控制。从 马达外壳312延伸出的是马达轴318。旋转架328可移动地容纳旋转 式培养容器固定器329 (优选是一次性的)，其可移动地容纳旋转式 培养容器301，它可拆卸地固定在旋转式培养容器固定器329中，优 选通过螺钉331固定。在图7中，TVEMF套筒10和旋转式培养容器301优选可拆卸 地^L旋转架328上。马达轴318容纳旋转架328。当控制旋钮317 打开时，旋转式培养容器301与缠绕了导电线圏305的线圈支架303 可优选同时旋转。另外，在运行时，TVEMF套筒10保持可移动地 邻近并包围旋转式培养容器301,而同时为旋转式培养容器301内的 细胞提供TVEMF。旋转式培养容器可优选是一次性的，其中可将 其抛弃并在以后的细胞培养中使用新的。所述旋转式培养容器也可 优选在每次使用后灭菌，例如在高压灭菌锅中灭菌，并且在以后的 细胞培养中重复使用。 一次性培养容器可在无菌环境中制造并包装， 由此医疗或研究人员可以像其它一次性医疗设备那样使用它们。图8展示了图7的TVEMF套筒IO优选实施方案的截面侧视图， 其可移动地邻近并包围旋转式培养容器301。在运行时，将培养容器导入TVEMF套筒。打开TVEMF套筒 的TVEMF源，通过导电线圏将TVEMF传递到被TVEMF套筒包 围并与其可移动地邻近的培养容器。在使用中，TVEMF分布在整 个培养容器中，并因此到达其中含有的细胞，优选近乎均一的分布。 在本发明中，术语"细胞"或者任何其它相似的术语旨在包括但不 仅限于单个细胞、附着在细胞附着基质上的细胞、细胞聚集体、组 织和组织样结构。术语"扩增"旨在包括培养容器中组织、组织样 结构和/或细胞聚集体在尺寸的生长和/或细胞数量上的生长。由于本发明提供了为培养容器中的细胞提供TVEMF以进行细 胞扩增的方法，因此设计TVEMF套筒的大小和构造以可移动地容 纳培养容器，从而可为培养容器中的细胞提供TVEMF，优选以近 乎均一的分布。由于本发明的TVEMF套筒可移动地邻近培养容器， 因此所述TVEMF套筒可重复使用以进行连续细胞培养。也因为 TVEMF套筒可移动地邻近培养容器，因此单个TVEMF套筒可容 纳不同类型、形状和尺寸的培养容器。导电线圏的尺寸及其缠绕数为使得当向导电线圏提供TVEMF 时，在培养容器中产生TVEMF以进行其中细胞的扩增。所述 TVEMF套筒可产生优选从约0.05高斯至约6高斯的TVEMF，更 优选从约0.05高斯至约0.5高斯，最优选约0.5高斯。所述TVEMF 优选为3波，更优选为微分方波，最优选为方波(遵循傅立叶曲线)。 优选地，脉冲方波的频率为约2至约25周/秒，更优选约5至约20 周/秒，例如约10周/秒，导电线圏的RMS值为约l至约1000mA, 优选约l至约10mA,例如6mA。然而，这些参数并不意在限制本 发明的TVEMF,并且可基于本发明的其它方面而发生变化。TVEMF 可通过标准i殳备测量，例如EN331 Cell Sensor高斯计。还预期所述TVEMF套筒可装有温度控制装置。所述温度控制 装置(优选为自动传感器)检测导电线圏和线圏支架(适用时)内 部部分内的温度。在使用中，如果所述温度控制设备检测到导电线 圏和线圏支架(存在时)内部部分内的温度读数高于所需温度，则 所述温度控制设备可为用户发出这种温度改变的警报，优选使用警 铃发出警报。不限于理论地，在存在高电阻时会产生热。因此，可 移动地容纳了培养容器的空间可能会变热，这取决于导电线圏的直 径和其中提供的电量。如在本发明中所预期的，可对TVEMF套筒作出多种改变而不 脱离本发明的范围，因此本文的所有内容均应理解为"^兌明而非限制。操作方法从供体收集外周血细胞PBC，并使用所收集的全血制成培养混 合物，其中将细胞(0.75xl(^个细胞/ml)悬浮在补充了 5%人白蛋 白(HA )、 100 ng/ml重组人G誦CSF (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)、和100 ng/ml重组人干细胞因子(SCF) (Amgen)的Iscove 改良的Dulbecco培养基(IMDM) ( GIBCO, Grand Island, NY)中。 将溶于DMSO的10 ppm D-青霉胺[D(-)-2-氨基-3-巯基-3-甲基丁
酸I(Sigma-Aldrich)(铜螯合剂)加入细胞混合物中。不限于理论地， 铜螯合剂的目的是在TVEMF扩增之前降低外周血中铜的量。不限 于理论地，相信可用铜量的下降可增强细胞扩增。实施例1-旋转式生物反应器中的细胞扩增将如上述制备的培养混合物的第一样品置于带有75 ml培养室 的旋转式生物反应器中。将0.75 x 106个细胞/1111的培养混合物置于 75ml培养室中，总培养混合物体积为75 ml。通过包围并且可移动 地邻近旋转式生物反应器的TVEMF套筒(例如图7和8中的)为 旋转式生物反应器的培养容器中的细胞提供脉冲方波形式的约0.5 高斯随时间变化电磁力。将第二样品置于不施加任何TVEMF的旋 转式生物反应器中。除了 TVEMF条件以外，所有其它条件在第一 和第二样品之间均相同。所述培养容器以约10rpm的速率旋转。培 养物在37C和5% co2中生长。使第一和第二样品的细胞扩增7天,在扩增的第七天之后用PBS (磷酸緩沖液)洗涤细胞，并通过传统计数技术进行计数，例如使 用Coulter细胞计数器。通过视觉判断，发现通过TVEMF套筒接 触TVEMF的第一培养混合物的生长或扩增是未接触TVEMF的样 品的五倍以上。实施例2-培#^中的细胞扩增将如上述制备的培养混合物的第一样品置于培养脏中，对包围 并临近培一的TVEMF套筒(例如图5和6中)提供脉冲方波形 式的约0.5高斯TVEMF。将第二样品置于不施加任何TVEMF的培 养脏中。除了 TVEMF条件以外，所有其它条件在第一和第二样品 之间均相同。培养物在37"C和5。/。C02中培养。使第一和第二样品的细胞扩增7天,在扩增的第七天之后用PBS (磷酸緩冲液)洗涤细胞，并通过传统计数技术进行计数，例如使 用Coulter细胞计数器。通过视觉判断，发现通过TVEMF套筒接 触TVEMF的培养混合物的生长或扩增是未接触TVEMF的样品的 两倍以上。
权利要求
1.随时间变化电磁力套筒，其包含-具有内部部分和外部部分的导电线圈，其中所述内部部分限定可移动地容纳培养容器的空间；和-与所述导电线圈有效连接的随时间变化电磁力源。
2. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏基本 上是刚性的。
3. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述随时间变化电 磁力套筒可绕轴旋转。
4. 根据权利要求3的随时间变化电磁力套筒，其中所述轴基本上是水 平的。
5. 根据权利要求3的随时间变化电磁力套筒，其中所述轴基本上是竖 直的。
6. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏为螺 线管。
7. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏基本 为圆柱体。
8. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具有 基本为圓形的截面。
9. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具有 基本为卵形的截面。
10. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具 有基本为椭圆形的截面。
11. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述培养容器可 绕轴旋转。
12. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏是 绝缘的。
13. 根据权利要求l的随时间变化电磁力套筒，其还包含具有内部部 分的线圏支架，其中所述线圏支架位于导电线圏的内部部分中，并且 其中所述线圏支架的内部部分可移动地容纳所述培养容器。
14. 随时间变化电磁力套筒，其包含-具有内部部分和外部部分的线圏支架，其中所述内部部分限定可移动 地容纳培养容器的空间； -缠绕在线圏支架外部部分上的导电线圏；和 -与导电线圏有效连接的随时间变化电磁力源。
15. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述随时间变化 电磁力套筒可绕轴旋转。
16. 根据权利要求15的随时间变化电磁力套筒，其中所述轴基本上是 水平的。
17. 根据权利要求15的随时间变化电磁力套筒，其中所述轴基本上是 竖直的。
18. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏是 螺线管。
19. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具 有基本为圆形的截面。
20. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具 有基本为卵形的截面。
21. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏具 有基本为椭圆形的截面。
22. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述培养容器可 绕轴旋转。
23. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述导电线圏是 绝缘的。
24. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述线圏支架是 非导体的。
25. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，其中所述线圏支架包 含导体材料。
26. 根据权利要求25的随时间变化电磁力套筒，其中所述导体材料是 铁。
27. 根据权利要求14的随时间变化电磁力套筒，还包含用于控制培养 容器中温度的温度控制装置。
28. 细胞扩增的方法，其包括以下步骤-提供具有内部部分和外部部分的随时间变化电磁力套筒；-将含有细胞的培养容器导入随时间变化电磁力套筒的内部部分；和-通过随时间变化电磁力套筒对培养容器中的细胞提供随时间变化电磁力，以用于细胞扩增。
29. 根据权利要求28的方法，其中随时间变化电磁力套筒的内部部分 还包含具有内部部分和外部部分的线圏支架，其中导电线圏缠绕在所 述线圈支架的外部部分上，并且其中所述线圏支架的内部部分限定可 移动地容纳培养容器的空间。
30. 根据权利要求28的方法，其中随时间变化电磁力套筒的内部部分 还包含具有内部部分和外部部分的导电线圏，其中所述内部部分限定 可移动地容纳培养容器的空间。
31. 根据权利要求28的方法，其中所述随时间变化电磁力为方波。
32. 根据权利要求28的方法，其中所述随时间变化电磁力为约0.05高 斯至约6高斯。
33. 根据权利要求28的方法，其中所述随时间变化电磁力为约0.05高 斯至约0.5高斯。
34. 根据权利要求28的方法， 斯。
35. 根据权利要求31的方法， 25周/秒。
36. 根据权利要求31的方法, 20周/秒。其中所述随时间变化电磁力为约0.5高 其中所述方波的频率为约2周/秒至约 其中所述方波的频率为约5周/秒至约
37. 根据权利要求31的方法，其中所述方波的频率约为10周/秒。
38. 根据权利要求28的方法，其中所述随时间变化电磁力是微分方波。
39. 根据权利要求28的方法，其中所述随时间变化电磁力是S波。
全文摘要
随时间变化电磁力的套筒，其中所述随时间变化电磁力的套筒包含与导电线圈有效连接的随时间变化电磁力源，所述线圈能够可拆装地容纳培养容器。本发明还涉及用于细胞扩增的方法，其包括提供随时间变化电磁力的套筒，该套筒导入培养容器中，并且在使用时对所述培养容器中的细胞传递随时间变化的电磁力，用于细胞扩增。
文档编号C12M1/42GK101213291SQ200680023814
公开日2008年7月2日 申请日期2006年6月22日 优先权日2005年6月29日
发明者克莱顿·R·帕克 申请人:雷格内泰克公司