胎盘干细胞群的制作方法

专利名称：胎盘干细胞群的制作方法
月台盘干细月包群
本申请要求2005年12月29日提交的美国临时申请号60/754,968的利 益；以及2006年12月22日提交的美国临时申请号60/846,641的利益。
1. 发明领域
本发明提供了分离的胎盘干细胞，胎盘干细胞群，包含该干细胞的組合 物，以及获得该干细胞的方法。
2.
背景技术：
人类干细胞是全能或多能前体细胞，其能产生多种成熟人类细胞系。有 证据"i正明，干细胞可用于恢复许多，如果不是全部的，组织，以及恢复生理 和解剖功能。
许多不同类型的哺乳动物干细胞已经被表征。参见，例如，Caplan等， 美国专利号5，486，359(人类间充质干细胞)；Boyse等，美国专利号 5，004,681(胎儿和新生儿造血干细胞和祖细胞)；Boyse等，US 5,192,553(相同 的)；Beltrami等，Cell 114(6):763-766(2003)(心脏干细胞);Forbes等，J. Pathol. 197(4):510-518(2002)(肝千细胞)。脐带血和来源于脐带血的全部有核 细胞已被用于移植，以部分或完全地恢复已经进行消融治疗(ablative therapy) 的患者的造血功能。
3. 发明概述
本发明提供了分离的胎盘干细胞，胎盘干细胞群，包含该干细胞的组合
物，以及获得该干细胞的方法。
本发明首先4是供了分离的干细胞，包含这种干细胞的细胞群，其中该干 细胞存在于并可分离自胎盘组织(例如，羊膜、绒毛膜、胎盘小叶等等)。胎 盘干细胞显示干细胞的一种或多种特性(例如，显示与干细胞相关的标记，在
未分化状态培养时复制至少10-20倍，分化成三个胚层的成熟细胞，等等)， 并能附着于组织培养基质(例如，组织培养塑料如组织培养皿或多孔板的表 面)。
在一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞，其是CD200+ 或HLA-G+。在特定的实施方案中，所述细胞是CD200+和HLA-G+。在特定 的实施方案中，所述细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中， 所述干细胞是CD34-、 CD3&或CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细 胞是CD3《、CD3&和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞是 CD34'、 CD38'、 CD45\ CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，当在 允许拟胚体形成的条件下培养所述群时，所述干细胞促进包含胎盘干细胞的 分离的胎盘细胞群中一种或多种拟胚体的形成。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘细胞群，其包括，例 如，被富集的CD200+、 HLA-G+干细胞。在不同的实施方案中，至少10%、 至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、或者至少95%或以上的所述分离的胎盘细胞是CD200+、 HLA-G+干细胞。在上述群体的特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+和 CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38'或CD45-。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38\ CD4f、 CD73+和 CD105+。在其它的特定实施方案中，所述群体被扩增，例如，传代至少1
次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。在另一 特定的实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件下培养该群体时，所述群体 形成一种或多种拟胚体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的干细胞，其是CD73+、 CD105+和CD200+。在特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一 特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD38-或CD45-。在另一特定的实 施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD38-和CD45-。在更特定的实施方案中， 所述干细胞是CD34—、 CD38'、 CD45'和HLA-G+。在另一特定的实施方案 中，当在允许拟胚体形成的条件下培养所述群体时，所述干细胞促进包含干 细胞的分离的胎盘细胞群形成一种或多种拟胚体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘细胞群，其包括，例 如，被富集的CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在不同的实施方案中，至 少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、或者至少95%的所述分离的胎盘细胞是 CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在所述群体的特定的实施方案中，所述干 细胞是HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD38一或 CD45—。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38'和CD45.。 在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38'、 CD45'和HLA-G+。 在其它的特定实施方案中，所述群体被扩增，例如，传代至少1次、至少3 次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。在另一特定的实施 方案中，在允许形成拟胚体的条件下培养该群体时，所述群体形成一种或多 种拟胚体。
本发明还提供了一种分离的干细胞，其是CD200+和OCT-4+。在特定的
实施方案中，干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述 干细胞是HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38' 或CD45'。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38—和CD45' 。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38\ CD45\ CD73+、 CD105+和HLA-G+。在另一特定的实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件 下培养所述群体时，所述干细胞促进在包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群 中形成一种或多种拟胚体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的细胞群，其包括，例如， 富集的CD200+、 OCT-4+干细胞。在不同的实施方案中，至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、 至少90%、或至少95%的所述分离的胎盘细胞是CD200+、 OCT-4+干细胞。 在上述群体的特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一 特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所 述干细胞是CD3《、CD3&或CD45、在更特定的实施方案中，所述干细胞是 CD34\ CD38\ CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+。在其它的特定实施方 案中，所述群体被扩增，例如，已经传代至少1次、至少3次、至少5次、 至少10次、至少15次、或至少20次。在另一特定实施方案中，当在允许 形成拟胚体的条件下培养该群体时，所述群体形成一种或多种拟胚体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的干细胞，其是CD73+和 CD105+,而且当在允许形成拟胚体的条件下培养所述群体时，其促进在包含 所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种拟胚体。在特定的实施方 案中，所述干细胞是CD34-、 CD38-或CD45、在另一特定的实施方案中，所 述干细胞是CD3《、CD3&和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞
是OCT-4+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+、 CD34\ CD38-和CD45-。
本发明进一步提供了一种分离的胎盘细胞群，其包括，例如富集的 CD73+、 CD105+干细胞，其中在允许形成拟胚体的条件下培养所述群体时， 形成一种或多种拟胚体。在不同的实施方案中，至少10%、至少20%、至少 30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、 或至少95n/Q的所述分离的胎盘细胞是CD73+、 CD105+干细胞。在上述群体的 特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD3&或CD45、在另一特定的实 施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD3K和CD45、在另一特定的实施方案 中，所述干细胞是OCT-4+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+、 CD34'、 CD38'和CD45'。在其它的特定实施方案中，所述群体被扩增， 例如，已经传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、 或至少20次。
本发明进一步提供了一种分离的干细胞，其是CD73+、 CD105+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38-或CD45、在另一特 定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD3K和CD45、在另一特定的实施 方案中，所述干细胞是OCT-4+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是 CD200+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38\ CD4f、 OCT-4+和CD200+。在另一特定的实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件 下培养所述群体时，所述干细胞促进在包含胎盘干细胞的分离的胎盘细胞群 中形成一种或多种拟胚体。
本发明进一步提供了一种分离的细胞群，其包括，例如，富集的 CD73+、 CD105+和HLA-G+干细胞。在不同的实施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、 至少90%、或至少95%的所述分离的胎盘细胞是CD73+、 CD105+和HLA-G+ 干细胞。在上述群体的特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38'或 CD45—。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38'和CD45'。 在另一特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+。在另一特定的实施方案 中，所述干细胞是CD200+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38\ CD45\ OCT-4+和CD200+。在另一特定实施方案中，所述群体被扩 增，例如，已经传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15 次、或至少20次。在另一特定实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件下 i咅养该群体时，所述群体形成拟胚体。
本发明进一步提供了一种分离的干细胞，其是OCT-4+，而且当在允许 形成拟胚体的条件下培养所述群体时，该细胞促进在包含所述干细胞的分离 的胎盘细胞群中形成一种或多种拟胚体。在特定的实施方案中，所述干细胞 是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38'或CD45—。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更特 定的实施方案中，所述干细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD3《、CD38-和CD45、
本发明还提供了一种分离的细胞群，其包括，例如富集的OCT-4+的胎 盘干细胞，其中在允许形成拟胚体的条件下培养所述群体时，形成一种或多 种拟胚体。在不同的实施方案中，至少10%、至少20%、至少30%、至少 40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95% 的所述分离的胎盘细胞是OCT-4+胎盘干细胞。在上述群体的特定的实施方 案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干
细胞是CD34- CD3-或CD45-在另一特定的实施方案中，所述千细胞是 CD200+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+、 CD105 + 、 CD200+、 CD34- CD3-或CD45-。在另一特定实施方案中，所述群体被扩 增，例如，已经传代至少1次、至少3次、至少5次、至少10次、至少15 次、或至少20次。
本发明进一步提供了一种在此描述的分离的胎盘干细胞群，其根据以下 方法生成，包括灌注哺乳动物胎盘，该胎盘已经被排出脐带血而且被灌注以 除去残余血液；用灌注溶液灌注所述胎盘；收集所述灌注溶液，其中灌注后 的所述灌注溶液中含有包括胎盘干细胞的胎盘细胞群；和从所述细胞群分离 大量所述胎盘干细胞。在特定的实施方案中，灌注溶液通过脐静脉和脐动 J昧，并在它从胎盘流出以后进行收集。在另一特定的实施方案中，灌注溶液 通过脐静脉，并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集。
本发明进一步提供了一种在此描述的分离的胎盘干细胞群，其根据以下 方法生成，包括用組织裂解酶消化胎盘組织以获得包含胎盘干细胞的胎盘细 胞群，并从所述胎盘细胞的剩余物中分离大量胎盘干细胞。在特定的实施方 案中，所述胎盘组织是全部胎盘、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或 任何上述的组合。在其它的特定实施方案中，组织裂解酶是胰蛋白酶或胶原 酶。
在更特定的实施方案中，本发明提供了任何上述的分离的干细胞，其中 所述干细胞以可检测地高于骨髓来源的间充质干细胞的水平表达一种或多种 基因，其中所述一种或多种基因选自ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 C0L4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、
GPRC5B、 HLA誦G、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2 、 MEST、 NFE2L3 、 NUAK1 、 PCDH7、 PDLIM3 、 PJP2 、 RTN1 、 SERPINB9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5 、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A，而且其中所述骨髓来源的 干细胞已经进行了多次传代培养，以等于所述胎盘干细胞已经进行的传代 数。在Affymetrix GENECHIP 阵列上找到相应于这些基因的序列。这些基 因也可以下列GenBank登录号找到 NMJ)01615(ACTG2)、 BC065545(ADARB1),(NM—181847(AMIG02) 、 AY358590(ARTS-1)、 BC074884(B4GALT6) 、 BC008396(BCHE) 、 BC020196(Cllorf9)、 BC031103(CD200) 、 NM—001845(COL4Al)、 丽—001846(COL4A2)、 BC052289(CPA4) 、 BC094758(DMD) 、 AF293359(DSC3) 、 画一001943(DSG2) 、 AF338241(ELOVL2) 、 AY336105(F2RL1)、 画J)18215(FUJ10781) 、 AY416799(GATA6) 、 BC075798(GPR126)、 NM—016235(GPRC5B) 、 AF340038(ICAM1) 、 BC000844(IER3)、 BC066339(IGFBP7)、 BC013142(IL1A)、 BT019749(IL6)、 BC007461(IL18)、 BC072017(KRT18) 、 BC075839(KRT8) 、 BC060825(LIPG)、 BC065240(LRAP) 、 BC010444(MATN2) 、 BC011908(MEST)、 BC068455(NFE2L3) 、 NM—014840(NUAK1) 、 AB006755(PCDH7)、 NM—014476(PDLIM3) 、 BC126199(PKP-2) 、 BC090862(RTN1)、 BC002538(SERP麵9)、 BC023312(ST3GAL6)、 BC001201(ST6GALNAC5)、 BC126160 或 BC065328(SLC12A8) 、 BC025697(TCF21) 、 BC096235(TGFB2)、 BC005046(VTN)和BC005001(ZC3H12A)，自2006年12 月起。
在更特定的实施方案中，所述干细胞以可检测地高于骨髓来源的间充质
干细胞的水平表达ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3 、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 HLA-G、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PKP2、 RTN1 、 SERPINB9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5 、 SLC12A8 、 TCF21 、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A。
在更特定的实施方案中，本发明还提供了上述的任何分离的干细胞群， 其中所述干细胞以可检测地高于骨髓来源的间充质干细胞的水平表达一种或 多种基因，其中所述一种或多种基周选自ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1 、 B4GALT6、 BCHE 、 Cllorf9、 CD200 、 COL4A1 、 COL4A2 、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1 、 FLJ10781 、 GATA6、 GPR126 、 GPRC5B 、 HLA-G 、 ICAM1 、正R3 、 IGFBP7 、 IL1A 、 IL6 、 IL18 、 KRT18 、 KRT8 、 LIPG 、 LRAP 、區TN2 、 MEST 、 NFE2L3 、 NUAK1 、 PCDH7 、 PDLIM3 、 PKP2 、 RTN1 、 SERPINB9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A，其中所述 的骨髓来源的干细胞群已经进行多次传代培养，以等于所述胎盘干细胞进行 的传代数，其中所述的骨髓来源的间充质干细胞群的细胞数等于所述分离的 干细胞群的细胞数。在更特定的实施方案中，分离的干细胞群以可检测地高 于骨髓来源的间充质干细胞的水平表达ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS國1 、 B4GALT6 、 BCHE 、 Cllorf9 、 CD200 、 COL4A1 、 COL4A2 、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1 、 FLJ10781、 GATA6、
GPR126 、 GPRC5B 、 HLA-G 、 ICAM1 、 IER3 、 IGFBP7 、 IL1A 、 IL6 、 IL18 、 KRT18 、 KRT8 、 LIPG 、 LRAP 、 MATN2 、 MEST 、 NFE2L3 、 NUAK1 、 PCDH7 、 PDLIM3 、 PKP2 、 RTN1 、 SERP誰9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A。
在选择细胞群的方法的更特定的实施方案中，本发明还提供了选择一种 上述的细胞群的方法，包括选择以可检测地高于骨髓来源的间充质干细胞的 水平表达一种或多种基因的细胞，其中所述的一种或多种基因选自 ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1 、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1 、 FLJ10781 、 GATA6 、 GPR126 、 GPRC5B 、 HLA隱G 、 ICAM1 、 IER3、 IGFBP7、 IL1A5 、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8 、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PKP2、 RTN1 、 SERPINB9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN 和ZC3H12A，而且其中所述骨髓来源的干细胞已经进行了多次传代培养， 以等于所述胎盘干细胞已经进行的传代数。在更特定的实施方案中，所述选 择包括选择以可检测地高于骨髓来源的间充质干细胞的水平表达ACTG2 、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1 、 B4GALT6 、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4Al、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3 、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1 、 FLJ10781 、 GATA6 、 GPR126 、 GPRC5B 、 HLA-G 、 ICAM1 、 IER3 、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST 、 NFE2L3 、 NUAK1 、 PCDH7 、 PDLIM3 、 PKP2 、 RTN1 、 SERPINB9、 ST3GAL6、 ST6GALNAC5、 SLC12A8、 TCF21、 TGFB2、 VTN 和ZC3H12A的细胞。
本发明还提供了包含一种或多种本发明干细胞的组合物，其中所述干细 胞已经从胎盘中分离。因此，本发明进一步提供了包含干细胞的组合物，其
中所述干细胞是CD200+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细胞是 CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38' 或CD45'。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD3&和CD4夕 。在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38\ CD45—、 CD73+、 CD105+、 CD200+和HLA-G+。
在另一实施方案中，本发明提供了包含干细胞的组合物，其中所述干细 胞是CD73+、 CD105+和CD200+。在特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38'或CD45'。在另 一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38-和CD45'。在另 一特定的 实施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD38\ CD45—和HLA-G+。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含干细胞的组合物，其中所述 干细胞是CD200+和OCT-4+。在特定的实施方案中，所述千细胞是CD73+ 和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另 一特 定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38'或CD45'。在另一特定的实施 方案中，所述干细胞是CD3《、CD3&和CD45、在另一特定的实施方案中， 所述干细胞是CD34-、 CD38\ CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含干细胞的组合物，该干细胞 是CD73+和CD105+，其中在允许形成拟胚体的条件下，所述干细胞促进在 分离的胎盘细胞群中形成拟胚体，该分离的胎盘细胞群包含所述干细胞。在 特定的实施方案中，所述干细胞是CD34-、 CD38-或CD45、在另一特定的实 施方案中，所述干细胞是OCT-4+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞 是CD200+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+、 CD200+、 CD34-、 CD38和CD45國。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含干细胞的组合物，该干细胞 是CD73+、 CD105+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细胞是CD34' 、CD3&或CD45、在另一特定的实施方案中，所述千细胞是OCT-4+。在另 一特定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在另一特定的实施方案中， 所述干细胞是OCT-4+、 CD200+、 CD34\ CD38'和CD45、
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含干细胞的组合物，该干细胞 是OCT-4+,其中在允许形成拟胚体的条件下，所述干细胞促进在分离的胎 盘细胞群中形成拟胚体，该分离的胎盘细胞群包含所述干细胞。在特定的实 施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所 述干细胞是CD3《、CD38-和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞 是CD200+。在另一特定的实施方案中，所迷干细胞是CD73 + 、 CD105+、 CD200+、 CD34-、 CD38和CD45-。
在上述组合物的更特定的实施方案中，所述干细胞以可检测地高于骨髓 来源的间充质干细胞的水平表达一种或多种基因，其中所述一种或多种基因 选自 ACTG2 、 ADARB1 、 AMIG02 、 ARTS画1 、 B4GALT6 、 BCHE 、 Cllorf9、 CD200、 COL4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3 、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781 、 GATA6 、 GPR126 、 GPRC5B 、 HLA誦G、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6 、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、而AK1、 PCDH7、 PDUM3、 PKP2、 RTN1 、 SERPINB9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5 、 SLC12A8 、 TCF21 、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A，而且其中所述骨髓来源的干细胞已经进行了多
次传代培养，以等于所述胎盘干细胞已经进行的传代数。在上述组合物的一 个更特定的实施方案中，所述干细胞以可检测高于分离的骨髓来源的间充质
干细胞群的水平表达ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1、 B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3 、 DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 HLA-G、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PKP2、 RTN1 、 SERP膽9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5 、 SLC12A8 、 TCF21 、 TGFB2、 VTN和ZC3H12A,其中所述的干细胞群和所述的骨髓来源的间充 质细胞群具有相等的细胞数。
在另一特定的实施方案中，任何上述的组合物包括基质。在更特定的实 施方案中，所述基质是三维支架。在另一个更特定的实施方案中，所述基质 包括胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋 白。在另一个更特定的实施方案中，所述基质是羊膜或羊膜来源的生物材 料。在另一个更特定的实施方案中，所述基质包括胞外膜蛋白。在另一个更 特定的实施方案中，所述基质包括合成的化合物。在另一个更特定的实施方 案中，所述基质包括生物活性化合物。在另一个更特定的实施方案中，所述 的生物活性化合物是生长因子、细胞因子、抗体、或小于5,000道尔顿的有 机分子。
在另一实施方案中，本发明进一步提供了一种组合物，其包括任何上述 干细胞或任何上述干细胞群调节的培养基。在特定的实施方案中，任何这种 組合物包括不来源于胎盘的干细胞。在更特定的实施方案中，所述干细胞是 胚胎干细胞。在另一个更特定的实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞。
在另一个更特定的实施方案中，所述干细胞是骨髓-来源的干细胞。在另一个 更特定的实施方案中，所述干细胞是造血祖细胞。在另一个更特定的实施方 案中，所述干细胞是体干细胞。在一个更加特定的实施方案中，所述体干细 胞是神经干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、心脏千细胞或肌肉 干细胞。
本发明还才是供了生产来源于哺乳动物胎盘的干细胞群的方法。在一实施
方案中，例如，本发明提供了一种生产细胞群的方法，包括选择(a)附着于基 质，和(b)表达CD200和HLA-G的细胞；和从其它细胞中分离所述的细胞以 形成细胞群。在另一实施方案中，本发明提供了一种生产细胞群的方法，包 括选樹a)附着于基质，和(b)表达CD73、 CD105和CD200的细胞；和从其 它的细胞分离所述的细胞以形成细胞群。在另一实施方案中，本发明提供了 一种生产细胞群的方法，包括选择(a)附着于基质，和(b)表达CD200和OCT-4的细胞；和从其它的细胞分离所述的细胞以形成细胞群。仍然在另一特定 的实施方案中，本发明提供了一种生产细胞群的方法，包括选择(a)附着于基 质，(b)表达CD73和CD105,和(c)当在允许形成拟胚体的条件下用胎盘细胞 群培养时，促进形成一种或多种拟胚体的细胞；和从其它的细胞中分离所述 细胞以形成细胞群。在另一实施方案中，本发明提供了一种生产细胞群的方 法，包括选择(a)附着于基质，和(b)表达CD73、 CD105和HLA-G的细胞； 和从其它的细胞中分离所述的细胞以形成细胞群。本发明还提供了一种生产 细胞群的方法，包括选择(a)附着于基质，(b)表达0CT-4，和(c)当在允许形 成拟胚体的条件下用胎盘细胞群培养时，促进形成一种或多种拟胚体的细 胞；和从其它的细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在任何上述方法的特定 的实施方案中，所述基质包括纤粘连蛋白。在另一特定的实施方案中，该方
法包括选择表达ABC-p的细胞。在另一特定的实施方案中，该方法包括选择 显示出至少一种特异于间充质干细胞的特性的细胞。在更特定的实施方案 中，所述特异于间充质干细胞的特性是表达CD29、表达CD44、表达 CD90、或表达上述的组合。在该方法的另一特定的实施方案中，^f吏用抗体完 成所述选择。在另一特定的实施方案中，使用流式细胞仪完成所述选择。在 另一特定的实施方案中，使用磁珠完成所述选择。在另一特定的实施方案 中，所述选择由焚光激活细胞分类术来完成。在上述方法的另一特定的实施 方案中，所述细胞群被扩增。
本发明还提供了一种生产千细胞系的方法，包括用编码生长促进蛋白的 DNA序列转化干细胞；和把所述干细胞暴露于促进所述生长促进蛋白生产 的条件下。在特定的实施方案中，所述生长促进蛋白是v-myc、 N-myc、 c-myc、 p53、 SV40大T抗原、多瘤大T抗原、Ela腺病毒或人乳头瘤病毒E7 蛋白。在更特定的实施方案中，所述DNA序列是可调控的。在更特定的实 施方案中，所述DNA序列是四环素可调控的。在另一特定的实施方案中， 所述生长促进蛋白具有可调控活性。在另一特定的实施方案中，所述生长促 进蛋白是温度敏感突变体。
本发明进一步提供了低温贮藏的千细胞群。例如，本发明提供一种 CD200+、 HLA-G+干细胞群，其中所述细胞已经被低温贮藏，而且其中所述 群体被包含在容器中。本发明还提供一种CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞 群，其中所述干细胞已经被低温贮藏，而且其中所述群体被包含在容器中。 本发明还提供一种CD200+、 OCT-4+干细胞群，其中所述干细胞已经被低温 贮藏，而且其中所述群体被包含在容器中。本发明还提供了一种CD73+、 CD105+干细胞群，其中所述细胞已经被低温贮藏，其中所述群体被包含在容
器中，而且当在允许形成拟胚体的条件下，用胎盘细胞群进行培养时，其中
所述干细胞促进形成一种或多种拟胚体。本发明进一步提供了一种CD73+、 CD105+、 HLA-G+干细胞群，其中所述细胞已经被低温贮藏，而且其中所述 群体被包含在容器中。本发明还提供了一种OCT-4+干细胞群，其中所述细 胞已经被低温贮藏，其中所述群体被包含在容器中，而且当在允许形成拟胚 体的条件下，用胎盘细胞群培养时，其中所述干细胞促进形成一种或多种拟 胚体。在任一上述低温贮藏的群体的特定实施方案中，所述容器是袋子。在 不同的特定实施方案中，所述群体包括大约、至少、或最多1乂106个所述干 细胞、5乂106个所述干细胞、lxl(^个所述干细胞、5乂107个所述干细胞、 1X1()S个所述干细胞、5X1()S个所述干细胞、1乂109个所述干细胞、5X109 个所述干细胞、或1X101Q个所述干细胞。在任何上述低温贮藏的群体的其 它特定实施方案中，所述干细胞已经传代大约、至少、或至多5次、至多10 次、至多15次或至多20次。在任何上述低温贮藏的群体的另一特定实施方 案中，所述干细胞已经在所述容器中被扩增。
3.1定义
如这里使用的，术语"SH2"指结合标记CD105上的抗原表位的抗体。 因此，被称为SH2+的细胞是CD105+。
如这里使用的，术语"SH3"和"SH4"指结合标记CD73上的抗原表 位的抗体。因此，被称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+。
如这里使用的，术语"分离的干细胞"指基本上与从中获取该干细胞的 组织例如胎盘中的其它的、非干细胞分离的千细胞。干细胞是"分离的"， 如果至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或至少99%的与该干细胞天然
締合的非干细胞，或显示不同的标记模式的干细胞，被从该干细胞中除去， 例如，在收集和/或培养干细胞期间。
如这里使用的，术语"分离的细胞群"指基本上与从中获取该细胞群的 组织例如胎盘的其它细胞分离的细胞群。干细胞是"分离的"，如果至少
50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或至少99%的与该细胞群、或获得该细 胞群的细胞天然締合的细胞，也即显示不同的标记模式的干细胞，被从该干 细胞中除去，例如，在收集和/或培养干细胞期间。
如这里使用的，术语"胎盘干细胞"指来源于哺乳动物胎盘的干细胞或 -組细胞，无论其形态，细胞表面标记，或原代培养以后的传代数。然而，如 这里使用的术语"胎盘干细胞"不指滋养层。细胞被认为是"干细胞"，如 果该细胞保留干细胞的至少一种特性，例如，与一种或多种干细胞类型相关 的标记或基因表达模式；在培养中复制至少10-40次的能力；分化成具有所 有3胚层的细胞的能力；缺乏成熟(也即，分化的)细胞特性，等等。术语 "胎盘干细胞"和"胎盘来源的干细胞"可以互换使用。
如这里使用的，当该标记是高于背景可检测的时，干细胞对于特定的标 记是"阳性的"。例如，胎盘干细胞对于例如CD73是阳性的，因为CD73 在胎盘干细胞中是可检测的，其呈现可检测地高于背景的量(例如，与同种型 对照相比较)。当该标记可用于从至少一种其它的细胞类型中区别该细胞时， 或当通过该细胞呈递或表达时，该标记可用于选择或分离该细胞时，细胞对 于该标记也是阳性的。在例如，抗体介导的检测的上下文中，"阳性"，作 为特定的细胞表面标记存在的指示，是指当使用特异于该标记的抗体，例如 荧光标记抗体时，该标记是可检测的；"阳性"还指细胞其以产生信号的量 带有该标记，例如，在细胞计数器中，该信号可检测地高于背景。例如，细
胞是"CD200+"，其中细胞用特异于CD200的抗体可检测地标记，而且来 自抗体的信号可检测地高于对照(例如，背景)。相反地，在同样的上下文 中，"阴性"指当使用标记特异性的抗体时，细胞表面标记与背景相比不能 检测到。例如，细胞是"CD34'",其中细胞不能用CD34特异性的抗体可 检测地标记。除非这里另有说明，分化("CD")标记簇使用抗体进行检测。 如果使用RT-PCR， OCT-4是可检测的，那么认为OCT-4存在，而且细胞是 "OCT画4+"。
4.附图简述


图1:来自灌注液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、羊膜-绒毛膜板(D)或脐带(E) 的胎盘干细胞的活力。X轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图2:通过FACSCalibur确定的来自灌注液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、 羊膜-绒毛膜板(D)或脐带(E)的HLA ABC7CD4S7CDW/CD133+细胞的百分 数。X轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图3:通过FACS Aria确定的来自灌注液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、羊 膜-绒毛膜板(D)或脐带(E)的HLA ABC7CD457CD347CD133+细胞的百分数。 X轴上的数字表示从中获得干细胞的胎盘。
图4:在来源于胎盘灌注液的干细胞中HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。
图5:在来源于羊膜的干细胞中HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33 、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。
图6:在来源于绒毛膜的干细胞中HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。
图7:在来源于羊膜-绒毛膜板的干细胞中HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。
图8:在来源于脐带的干细胞中HLA-G、 CD10 、 CD13、 CD33 、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表达。
图9:在来源于灌注液(A)、羊膜(B)、绒毛膜(C)、羊膜-绒毛膜板(D)或脐 带(E)的干细胞中表达的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的平均表达。
图10:本研究中使用的羊膜/绒毛膜(AC)、脐带(UC)、骨髓来源的干细 胞(BM-MSC)和人皮肤成纤维细胞(NHDF)细胞系的培养时间进程。所有的培 养物都使用相同的接种和传代蜜度进行生长和繁殖。圆圈表示用于RNA分 离的培养物。正好在衰老之前收获晚期培养物。在38次倍增时收获两个UC 培养物(UC-38)，以比较胰蛋白酶消化对基因表达的作用。所有的其它培养物 在RNA分离之前直接在它们的培养瓶中进行裂解。
图11:在羊膜/绒毛膜(AC)、脐带(UC)、骨髓来源的干细胞(BM-MSC)和 人皮肤成纤维(DF)细胞中的8215个基因相对表达水平的线条图。X轴上标 明的与每个细胞系相关的数字表示，在评价基因表达水平之前，细胞系被培 养的天数。通过GeneSpring软件分析的RNA表达数据产生该图表。AC-03 作为选定条件。
图12:显示在羊膜/绒毛膜(AC)、脐带(UC)、骨髓来源的干细胞(BM-MSC)和人皮肤成纤维细胞(DF)细胞的AC-03中过表达>6倍的基因的所有基 因列表的子集。X轴上标明的与每个细胞系相关的数字表示，在评价基因表 达水平之前，细胞系被培养的天数。通过GeneSpring软件分析的RNA表达 数据产生该图表。AC-03作为选定条件。
图13:通过倍率变化过滤发现羊膜/绒毛膜(AC)、脐带(UC)、骨髓来源 的干细胞(BM-MSC)和人皮肤成纤维细胞(DF)细胞胎盘干细胞特异性或脐带 干细胞特异性基因。X轴上标明的与每个细胞系相关的数字表示，在评价基 因表达水平之前，细胞系被培养的天数。通过GeneSpring软件分析的RNA 表达数据产生该图表。AC-03作为选定条件。
5.发明详述
5.1胎盘干细胞和胎盘千细胞群
胎盘干细胞是这样的干细胞，可获自胎盘或其部分，其附着于组织培养 基质并具有分化成非胎盘细胞类型的能力。胎盘干细胞可以是胎儿或母亲来 源的(也即，可以分别具有胎儿或者母亲的基因型)。优选地，本发明的胎盘 干细胞和胎盘干细胞群是胎儿来源的。胎盘干细胞群，或包含胎盘干细胞的 细胞群，可包括单独胎儿或母亲来源的胎盘干细胞，或者可包括胎儿与母亲 来源的胎盘干细胞的混合群体。胎盘干细胞，和包括胎盘干细胞的细胞群， 可通过下面所述的形态学、标记和培养特性进行鉴定和选择。
5.1.1物理学和形态学特征
本发明的胎盘干细胞，当在原代培养或细胞培养中培养时，附着于组织 培养基质，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料)。培养中的胎盘 干细胞呈现一般的成纤维样、星形形态，带有许多从中央细胞体伸出的细胞 质突。但是，胎盘干细胞是与在相同条件下培养的成纤维细胞相比形态学可 区分的，因为胎盘干细胞显示比成纤维细胞更大数量的这种突出。胎盘干细 胞也与造血干细胞是形态学可区分的，造血干细胞在培养中一般呈现更圆， 或鹅卯石的形态。
5.1.2细胞表面，分子和遗传标记
本发明的胎盘干细胞和胎盘干细胞群表达大量的标记，其可用于鉴定和/ 或分离干细胞，或包含该干细胞的细胞群。本发明的胎盘干细胞和干细胞群 (也即，两个或更多个胎盘干细胞)，包括直接从胎盘或其任何部分(例如，羊 膜、绒毛膜、胎盘子叶等等)获得的干细胞和包含干细胞的细胞群。胎盘干细 胞群也包括培养中的胎盘干细胞群(也即，两个或更多个)，和容器例如袋子 中的群体。但是，胎盘干细胞不是滋养层。
本发明的胎盘干细胞一般表达标记CD73、 CD105、 CD200、 HLA-G和/ 或OCT-4，而不表达CD34、 CD38或CD45。胎盘干细胞也可以表达HLA-ABC(MHC-1)和HLA-DR。这些标记可用于鉴定胎盘干细胞，和区别其它的 干细胞类型与胎盘干细胞。因为胎盘干细胞能表达CD73和CD105，它们具 有间充质干细胞样特性。然而，由于胎盘干细胞能表达CD200和HLA-G, 一种胎儿特异性标记，它们可以与间充质干细胞，例如，骨髓来源的间充质 干细胞区分开，骨髓来源的间充质干细胞既不表达CD200也不表达HLA-G。同样，缺乏CD34、 CD38和/或CD45的表达可鉴定胎盘干细胞为非造血 干细胞。
因此，在一实施方案中，本发明提供了分离的干细胞，其是CD200+或 HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞。在特定的实施 方案中，所述干细胞是CD200+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细 胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、 CD3K或CD45'。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD3&和 CD45'。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38'、 CD45\
CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，在允许形成拟胚体的条件下， 所述CD200+或HLA-G+干细胞促进在包含该干细胞的胎盘细胞群中形成拟胚 体。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘细胞分 离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些标记的胎盘 干细月包分离开。
在另一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干 细胞的方法，包括选择CD200+或HLA-G+胎盘细胞，其中所述细胞是胎盘千 细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择为CD200+与HLA-G+的胎盘 细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD73+与CD105+的胎 盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD3《、CD38— 或CD45-的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD34\ CD3&和CD45—的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包 括选择还为CD34'、 CD38\ CD45'、 CD73+和CD105+的胎盘细胞。在另一特 定的实施方案中，所述选择包括选择在允许形成拟胚体的条件下，促进在包 含该干细胞的胎盘细胞群中形成拟胚体的胎盘细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的细胞群包括，例如，富集 的CD200+、 HLA-G+干细胞。在特定的实施方案中，所述群是胎盘细胞群。 在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少 大约40%、至少大约50%、或至少大约60n/o的所述细胞是CD200+、 HLA-G+ 干细胞。优选地，至少大约70%的所述细胞是CD200+、 HLA-G+干细胞。更 优选地，至少大约90%、 95%或99%的所述细胞是CD200+、 HLA-G+干细 胞。在分离的群的特定的实施方案中，所述干细胞还是CD73+和CD105+。 在另一特定的实施方案中，所述干细胞还是CD3《、CD38'或CD45、在更特
定的实施方案中，所述干细胞还是CD34—、 CD38'、 CD45'、 CD73+和 CD105+。在另一特定实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件下培养该群体 时，所述分离的群产生一种或多种拟胚体。在另一特定的实施方案中，所述 胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一特定的实施方案中， 所述胎盘干细胞群与不显示这些标记的胎盘干细胞分离开。
在另 一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干 细胞群的方法，包括选择这样的胎盘细胞群，其中至少大约10%、至少大约 20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少 大约70%、至少大约80%、至少大约90%、或至少大约95%的所述细胞是 CD200+、 HLA-G+干细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD73+与CD105+的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还 为CD3《，CD38-或CD45'的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包 括选择还为CD34\ CD38_、 CD45\ CD73+和CD105+的干细胞。在另 一特定 的实施方案中，所述选择还包括选择当在允许形成拟胚体的条件下培养时， 形成一种或多种拟胚体的胎盘干细胞群。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的干细胞，其是CD73+、 CD105+和CD200+。在特定的实施方案中，所述分离的干细胞是分离的胎盘 干细胞。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另一特定的 实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38—或CD45、在另一特定的实施方案 中，所述干细胞是CD34-、 CD38-和CD45、在更特定的实施方案中，所述干 细胞是CD3《、CD38-、 CD45—和HLA-G+。在另一特定的实施方案中，当在 允许形成拟胚体的条件下培养所述群休时，分离的CD73+、 CD105+和 CD200+干细胞促进在包含该千细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种拟胚体。
在另 一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离 开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些标记的胎盘干 细月包分离开。在另一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干细胞的方法，包括选择CD73+、 CD105+和CD200+胎盘细胞，其中所述细胞 是胎盘干细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为HLA-G+的胎 盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD34'、 CD38' 或CD45-的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD34\ CD3&和CD45—的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包 括选择还为CD34\ CD38\ CD45'和HLA-G+的胎盘细胞。在另一特定的实 施方案中，所述选择另外包括选择CD73+、 CD105+和CD200+的干细胞，且 当在允许促进形成拟胚体的条件下培养所述群体时，其促进在胎盘细胞群中 形成一种或多种拟胚体，该胎盘细胞群包含该干细胞。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的细胞群包括，例如，富集 的CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在特定的实施方案中，所述干细胞是 胚胎干细胞。在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约20%、至少大 约30%、至少大约40%、至少大约50%、或至少大约60%的所述细胞是 CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在另一实施方案中，所述细胞群中至少大 约70%的所述细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在另一实施方案 中，所述细胞群中至少大约90%、 95%或99%的所述细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在所述群体的特定的实施方案中，所述干细胞是 HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38'或CD45' 。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34'、 CD38—和CD45'。在更特
定的实施方案中，所述干细胞是CD34\ CD38\ CD45—和HLA-G+。在另一 特定的实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件下培养时，所述细胞群产生 一种或多种拟胚体。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不是干 细胞的胎盘细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不 显示这些特性的胎盘干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明还^是供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干 细胞群的方法，包括选择这样的胎盘细胞群，其中至少大约10%、至少大约 20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少 大约70%、至少大约80%、至少大约90%、或至少大约95%的所述细胞是 CD73+、 CD105+、 CD200+干细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择 还为HLA-G+的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD34'、 CD38—或CD45—的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括 选择还为CD34'、 CD38'和CD4孓的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述 选择包括选择还为CD34\ CD38\ CD45'和HLA-G+的干细胞。在另 一特定时，产生一种或多种拟胚体的胎盘细胞群。本发明还提供了一种分离的干细胞，其是CD200+和OCT-4+。在特定的 实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在特定的实施方案中，干细 胞是胚胎干细胞。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是HLA-G+。在另 一特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38-或CD45、在另一特定的 实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD3K和CD45、在更特定的实施方案 中，所述干细胞是CD34\ CD38\ CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+。在 另一特定的实施方案中，当在允许生产拟胚体的条件下培养所述群体时，干
细胞促进通过胎盘细胞群生产一种或多种拟胚体，该胎盘细胞群包含该干细 胞。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不是千细胞的胎盘细胞分 离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些标记的胎盘 干细月包分离开。在另一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干细胞的方法，包括选择CD200+和OCT-4+胎盘细胞，其中所述细胞是胎盘干 细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为HLA-G+的胎盘细胞。 在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD34\ CD38-或CD45'的 胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD34'、 CD38—和CD45—的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择 还为CD3《、CD38-、 CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的胎盘细胞。在另 一特定的实施方案中，所述选择包括选择当在允许形成拟胚体的条件下培养 该群体时，还促进在包含该干细胞的胎盘细胞群中产生一种或多种拟胚体的 胎盘干细胞。本发明还提供了一种分离的细胞群包括，例如，富集CD200+、 OCT-4+ 的干细胞。在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约20%、至少大约 30%、至少大约40%、至少大约50%、或至少大约60%的所述细胞是 CD200+、 OCT-4+干细胞。在另一实施方案中，至少大约70%的所述细胞是 所述的CD200+、 OCT-4+干细胞。在另一实施方案中，至少大约90%、 95% 或99%的所述细胞是CD200+、 OCT-4+干细胞。在分离的群体的特定的实施 方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述 干细胞是HLA-G+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD3& 和CD45、在更特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38\ CD45'、CD73+、 CD105+和HLA-G+。在另一特定的实施方案中，当在允许形成拟胚 体的条件下培养时，该群体产生一种或多种拟胚体。在另一特定的实施方案 中，所述胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一特定的实施 方案中，所述胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干 细胞群的方法，包括选择这样的胎盘细胞群，其中至少大约10%、至少大约 20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少 大约70%、至少大约80%、至少大约90%、或至少大约95%的所述细胞是 CD200+、 OCT-4+干细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD73+与CD105+的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还 为HLA-G+的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择还为 CD34\ CD38—和CD45-的干细胞。在另一特定的实施方案中，所述干细胞还 是CD3《、CD38\ CD45-、 CD73+、 CD105+和HLA-G+的干细胞。本发明进一步提供了一种分离的干细胞，其是CD73+、 CD105+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞。在另一特定的实施方 案中，所述干细胞是CD3《、CD38-或CD45、在另一特定的实施方案中，所 述千细胞是CD34-、 CD38-和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞 是OCT-4+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更特定的 实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38\ CD45-、 OCT-4+和CD200+。在 另一特定的实施方案中，当在允许形成拟胚体的条件下培养该群体时，所述 干细胞促进在包含所述干细胞的胎盘细胞群中形成拟胚体。在另 一特定的实 施方案中，所述胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一特定的 实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些特性的胎盘干细胞分离开。 在另 一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干细胞的方法，包括选择CD73+、 CD105+和HLA-G+胎盘细胞，其中所述细胞 是胎盘干细胞。在特定的实施方案中，所述选择包括选择还为CD34—、 CD38'或CD45'的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包括选择 还为CD3《、CD3&和CD45-的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选 择包括选择还为OCT-4+的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择 包括选择还为CD200+的胎盘细胞。在另一特定的实施方案中，所述选择包 括选择还为CD34\ CD38\ CD45-、 OCT-4+和CD200+的胎盘细胞。在另一 特定的实施方案中，所述选择包括选择当在允许形成拟胚体的条件下培养所 述群体时，还促进在包含所述千细胞的胎盘细胞群中形成一种或多种拟胚体的胎盘细胞。本发明还提供了一种分离的细胞群，其包括，例如，富集的CD73+、 CD105+和HLA-G+干细胞。在特定的实施方案中，所述干细胞是胎盘干细 胞。在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、 至少大约40%、至少大约50%、或至少大约60%的所述细胞是CD73+、 CD105+和HLA-G+干细胞。在另一实施方案中，至少大约70%的所述细胞是 CD73+、 CD105+和HLA-G+。在另一实施方案中，至少大约90%、 95%或 99%的所述细胞是CD73+、 CD105+和HLA-G+干细胞。在上述群体的特定实 施方案中，所述干细胞是CD34\ CD3&或CD45、在另一特定的实施方案 中，所述干细胞是CD34-、 CD38-和CD45、在另一特定的实施方案中，所述 干细胞是OCT-4+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更 特定的实施方案中，所述干细胞是CD3《、CD38-、 CD4f、 OCT-4+和 CD200+。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘
细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不显示这些特 性的胎盘干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明还提供了一种从大量胎盘细胞中选择胎盘干细胞群的方法，包括选择胎盘细胞群，其中大多数所述细胞是CD73+、 CD105+和HLA-G+。在特定的实施方案中，所述多数细胞还是CD34\ CD3&和/或CD45、在另 一特定的实施方案中，所述多数细胞还是CD200+。 在另一特定的实施方案中，所述多数细胞还是CD34'、 CD38'、 CD45—、 OCT-4+和CD200+。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的干细胞，其是CD73+和 CD105+，而且当在允许形成拟胚体的条件下培养所述群体时，其促进在包含 所述干细胞的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种拟胚体。在特定的实施方 案中，所述干细胞是CD3《、CD3K或CD45-。在另一特定的实施方案中，所 述干细胞是CD3《、CD3&和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞 是OCT-4+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+、 CD34'、 CD38— 和CD45、在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘 细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些特性 的胎盘干细胞分离开。本发明进一步提供了一种分离的胎盘细胞群，其包括，例如富集的 CD73+、 CD105+干细胞，其中在允许形成拟胚体的条件下培养所述群体时， 形成一种或多种拟胚体。在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约 20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少 大约70%、至少大约80%、至少大约90%、或至少大约95%的所述分离的胎 盘细胞是CD73+、 CD105+干细胞。在上述群体的特定的实施方案中，所述干
细胞是CD3《、CD38—或CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞是 CD34\ CD38-和CD45、在另一特定的实施方案中，所述干细胞是OCT-4+。在更特定的实施方案中，所述干细胞是0CT-4+、 CD34'、 CD38-和CD45-。在其它的特定实施方案中，所述群体被扩增，例如，已经传代至少1次、 至少3次、至少5次、至少10次、至少15次、或至少20次。在另一特定 的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一 特定的实施方案中，所述胎盘千细胞群与不显示这些特性的胎盘干细胞分离 开。本发明进一步4是供了一种分离的干细胞，其是OCT-4+，而且当在允许 形成拟胚体的条件下培养所述群体时，其促进在包含所述干细胞的分离的胎 盘细胞群中形成一种或多种拟胚体。在特定的实施方案中，所述干细胞是 CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD3& 或CD45'。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更特定的实 施方案中，所述干细胞是CD73+ 、 CD 105 + 、 CD200+ 、 CD34- 、 CD38-和 CD45'。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不是干细胞的胎盘细 胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞与不显示这些特性的 胎盘干细胞分离开。本发明还提供了一种分离的细胞群，其包括，例如富集的OCT-4+干细 胞，其中在允许形成拟胚体的条件下培养时，所述群体形成一种或多种拟胚 体。在不同的实施方案中，至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、 至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约 80%、至少大约90%、或至少大约95%的所述分离的胎盘细胞是OCT-4+干 细胞。在上述群体的特定的实施方案中，所述干细胞是CD73+和CD105+。在另一特定的实施方案中，所述干细胞是CD34—、 CD38-或CD45'。在另 一特 定的实施方案中，所述干细胞是CD200+。在更特定的实施方案中，所述干 细胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34-、 CD38—和CD45、在另一特定实 施方案中，所述群体被扩增，例如，已经传代至少1次、至少3次、至少5 次、至少10次、至少15次、或至少20次。在另一特定的实施方案中，所 述胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另 一特定的实施方案 中，所述胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明还提供了一种分离的胎盘千细胞，其是 CD10+、 CD34—、 CD105+和CD200+。本发明进一步提供了 一种分离的胎盘干 细胞群，其中至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95% 或至少大约99%的所述胎盘干细胞是CD10+、 CD34\ CD105+、 CD200+。在 上述实施方案的特定的实施方案中，所述干细胞另外是CD90+和CD45、在 特定的实施方案中，所迷干细胞或胎盘干细胞群与不是千细胞的胎盘细胞分 离开。在另一特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不显示这些 特性的胎盘干细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述分离的胎盘干细 胞是非母亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群 中至少大约90%、至少大约95%或至少大约99%的所述细胞是非母亲来源 的。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞，其HLA-A，B，Cr、 CD45'、 CD133'和CD34—。本发明进一步提供了 一种分离的胎盘干细 胞群，其中至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%或 至少大约99%的所述胎盘干细胞是HLA-A,B，CT、 CD45-、 CD133'和CD34-。 在特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞 分离开。在另一特定的实施方案中，所述胎盘干细胞群与不显示这些特性的 胎盘干细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非 母亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%的所述细胞是非母亲来源的。在 另一实施方案中，本发明提供了一种获得胎盘干细胞的方法，该胎盘干细胞 是HLA-A,B,CT、 CD45\ CD133'和CD34'，其包括从胎盘灌注液中分离所述 细胞。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞，其是 CD10+、 CD13+、 CD33+、 CD45-、 CD11T和CD133-。本发明进一步提供了一 种分离的胎盘干细胞群，其中至少大约70%、至少大约80%、至少大约 90%、至少大约95%或至少大约99%的所述胎盘干细胞是CD10+、 CD13+、 CD33+、 CD45\ CD11T和CD133'。在特定的实施方案中，所述干细胞或胎 盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所 述分离的胎盘干细胞是非母亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分 离的胎盘干细胞群中至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%的所述 细胞是非母亲来源的。在另一特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞 群与不显示这些特性的胎盘干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明提供 了 一种获得胎盘干细胞的方法，所述胎盘干细胞是CD10+、 CD13+、 CD33+、 CD45\ CD11T和CD133、该方法包括从胎盘灌注液中分离所述细 胞。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞，其是CD1(T 、CD33—、 CD44+、 CD45'和CD11T。本发明进一步提供了一种分离的胎盘干 细胞群，其中至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%
或至少大约99%的所述胎盘千细胞是CD1(T、 CD33_、 CD44+、 CD45-和 CD11T。在特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不是干细胞的 胎盘细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母 亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中至少大 约90%、至少大约95%、或至少大约99%的所述细胞是非母亲来源的。在另 一特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘 干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明提供了一种获得胎盘干细胞的方 法，该胎盘干细胞是CD10-、 CD33\ CD44+、 CD45-、 CD11T,该方法包括 从胎盘灌注液中分离所述细胞。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞，其是CD1(T 、CD13'、 CD33—、 CD45'和CD117'。本发明进一步提供了 一种分离的胎盘干 细胞群，其中至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95% 或至少大约99%的所述胎盘干细胞是CD1(T、 CD13\ CD33'、 CD45—和 CD11T。在特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不是干细胞的 胎盘细胞分离开。在另一特定的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母 亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中至少大 约90%、至少大约95%、或至少大约99%的所述细胞是非母亲来源的。在另 一特定的实施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘 干细胞分离开。在另一实施方案中，本发明提供了一种获得胎盘干细胞的方 法，该胎盘干细胞是CD1(T、 CD13-、 CD33-、 CD45—和CD11T，该方法包括 从胎盘灌注液中分离所述细胞。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘千细胞，其是HLA A，B,C-、 CD45-、 CD34-、 CD133-，其对CDIO、 CD13 、 CD38、 CD44、CD90、 CD105、 CD200和/或HLA-G呈阳性，和/或CD117呈阴性。本发明 进一步提供了一种分离的胎盘干细胞群，其中所述干细胞是HLA A，B,C—、 CD45\ CD3《、CD133、而且该群体中至少大约20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或大约99%的干细胞对CDIO、 CD13、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD200和/或HLA-G呈阳性，和/或对CD117呈阴性。在特定的实 施方案中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不是干细胞的胎盘细胞分离开。在 另一特定的实施方案中，所述分离的胎盘干细胞是非母亲来源的。在另一特 定的实施方案中，在所述分离的胎盘干细胞群中至少大约90%、至少大约 95%、或至少大约99%的所述细胞是非母亲来源的。在另一特定的实施方案 中，所述干细胞或胎盘干细胞群与不显示这些特性的胎盘干细胞分离开。在 另一实施方案中，本发明提供了一种获得胎盘干细胞的方法，所述细胞是 HLA A,B,Cr、 CD45-、 CD34-、 CD133陽和对CDIO、 CD13、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD200和/或HLA-G呈阳性，和/或对CD117呈阴性，该方 法包括从胎盘灌注液中分离所述细胞.
在另一实施方案中，本发明提供了一种胎盘干细胞，其是如通过抗体结 合确定的CD200+和CD10+，和如通过抗体结合和RT-PCR确定的CD117'。 在另一实施方案中，本发明提供了一种胎盘干细胞，其是CD10+、 CD29—、 CD54+、 CD200+、 HLA-G+、 HLA I类'和p-2-小球蛋白-。在另一实施方案 中，本发明提供了胎盘干细胞，其中至少一种标记的表达比间充质干细胞(例 如，骨髓来源的间充质干细胞)至少高2倍。在另一特定的实施方案中，所述 分离的胎盘干细胞是非母亲来源的。在另一特定的实施方案中，在所述分离 的胎盘干细胞群中至少大约90%、至少大约95%、或至少大约99%的所述细
胞是非母亲来源的。在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞群，其中大量所述的胎盘干细胞是醛脱氢酶(ALDH)阳性，如通过醛脱氢酶活性分析确定 的。这种分析是本领域已知的(参见，例如，Bostian&Berts, Biochem. J.， 173, 787,(1978))。在特定的实施方案中，所述的ALDH分析使用ALDEFLUOR 作为醛脱氬酶活性的标记(Aldagen， Inc.， Ashland， Oregon)。在特定的实施方 案中，所述的大量为所述细胞群中大约3%到大约25%的细胞。在另一实施 方案中，本发明提供了一种分离的脐带干细胞群，其中大量所述的脐带干细 胞是醛脱氩酶(ALDH)阳性，如通过醛脱氬酶活性分析确定的，其使用 ALDEFLUOI^作为醛脱氢酶活性的指示物。在特定的实施方案中，所述的 大量为所述细胞群中大约3%到大约25%的细胞。在另一实施方案中，所述 胎盘干细胞或脐带干细胞群，显示比具有相同的细胞数和在相同条件下培养 的骨髓来源的间充质群高至少3倍，或至少5倍的ALDH活性。本发明提供了任何上述的胎盘干细胞或胎盘干细胞群，其中所述干细胞 或胎盘干细胞群已经传代至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 14、 16、 18或20次、或更多，或扩增了 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38或40群体倍 增，或更多。在任何上述胎盘细胞或细胞群的特定的实施方案中，所述群中细胞，或 至少大约95%或大约99%的细胞的染色体组型是正常的。在任何上述胎盘细 胞或细胞群的另一特定的实施方案中，细胞，或细胞群中的细胞，是非母亲 来源的。带有任何的上述标记组合的分离的胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞群可
以任何比例组合。本发明还提供了任何两种或多种上述胎盘干细胞群的分离 或富集，以形成胎盘干细胞群。例如，本发明提供了一种分离的胎盘干细胞 群，其包括由如上所述的标记组合中的一个来限定的第一胎盘干细胞群，和 由如上所述的另 一个标记组合限定的第二胎盘干细胞群，其中所述的第一和第二群体以大约1:99、 2:98、 3:97、 4:96、 5:95、 10:90、 20:80、 30:70、 40:60、 50:50、 60:40、 70:30、 80:20、 90:10、 95:5、 96:4、 97:3、 98:2或大约 99:1的比例組合。以同样的方式，任何的3、 4、 5或多种上述的胎盘干细胞 或胎盘干细胞群可以进行组合。本发明进一步提供了胎盘干细胞，其通过使用或不使用酶消化来破坏胎 盘组织，接着进行培射参见5.2.3节)或灌注(参见5.2.4节)来获得。例如，本 发明提供了一种分离的胎盘干细胞群，其根据以下方法生产包括灌注哺乳 动物胎盘，该胎盘已经被排出脐带血而且被灌注以除去残余血液；用灌注溶 液灌注所述胎盘；收集所述灌注溶液，其中灌注后的所述灌注溶液含有包括 胎盘干细胞的胎盘细胞群；和从所述细胞群中分离大量所述胎盘干细胞。在 特定的实施方案中，灌注溶液通过脐静l^和脐动脉，并在它从胎盘中流出后 进行收集。通过这种方法生产的胎盘干细胞群一般包含胎儿和母亲的细胞的 混合物。在另一特定的实施方案中，灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集， 或者通过脐动脉并从脐静脉收集。通过这种方法产生的胎盘干细胞群一般基 本上是专门胎儿来源的；也即，例如，该群体中大于90%、 95%、 99%或 99.5%的胎盘干细胞是胎儿来源的。在不同的实施方案中，包含在从胎盘的灌注液中获得的细胞群内的胎盘 干细胞是所述胎盘细胞群的至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99% 或至少99.5%。在另一特定的实施方案中，通过灌注收集的胎盘干细胞包含
胎儿的细胞和母亲的细胞。在另一特定的实施方案中，通过灌注收集的胎盘干细胞是至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或至少99.5%的胎 儿的细胞。
在另一特定的实施方案中，本发明提供了一种包括通过灌注收集的分离 的胎盘干细胞群组合物，其中所述的组合物包括用于收集胎盘干细胞的至少 一部分灌注溶液。
本发明进一步提供了一种在此描述的分离的胎盘干细胞群，其根据以下 方法生成，包括用组织裂解酶消化胎盘組织以获得包含胎盘干细胞的胎盘细 胞群，并从所述胎盘细胞的剩余物中分离大量的胎盘干细胞。全部胎盘，或 胎盘的任何部分均可消化以获得胎盘干细胞。在特定的实施方案中，例如， 所述胎盘组织是全部胎盘、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或任何上 述的组合。在其它的特定实施方案中，组织裂解酶是胰蛋白酶或胶原酶。在 不同的实施方案中，包含在从消化胎盘中获得的细胞群内的胎盘干细胞，是 所述胎盘细胞群的至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或至少 99.5%。
基因分布图证实了分离的胎盘干细胞和分离的胎盘干细胞群可和其它的 细胞，例如间充质干细胞，例如骨髓来源的干细胞区别开。这里描述的胎盘 干细胞，可根据一种或多种基因的表达与间充质干细胞区别开，相较于骨髓 来源的间充质干细胞，该表达是胎盘干细胞或脐带干细胞特异性的。特别 地，胎盘干细胞可根据一种或多种基因的表达与间充质干细胞区分开，该表 达在胎盘干细胞中显著高于(也即，至少高两倍)在间充质干细胞中，其中一 种或多种基因是ACTG2、 ADARB1、 AMIG02、 ARTS-1 ， B4GALT6、 BCHE、 Cllorf9、 CD200、 COL4A1 、 COL4A2、 CPA4、 DMD、 DSC3 、
DSG2、 ELOVL2、 F2RL1、 FLJ10781、 GATA6、 GPR126、 GPRC5B、 HLA-G、 ICAM1、 IER3、 IGFBP7、 IL1A、 IL6、 IL18、 KRT18、 KRT8、 LIPG、 LRAP、 MATN2、 MEST、 NFE2L3、 NUAK1、 PCDH7、 PDLIM3、 PKP2、 RTN1 、 SERPINB9 、 ST3GAL6 、 ST6GALNAC5 、 SLC12A8 、 TCF21 、 TGFB2、 VTN、 ZC3H12A，或任何上述的组合，其中当干细胞在相同条件下 生长时，这些基因在胎盘干细胞或脐带干细胞中的表达高于在骨髓来源的干 细胞中。在特定的实施方案中，胎盘干细胞特异性基因或脐带干细胞特异性 基因是CD200。这些基因的表达水平可用于确认胎盘细胞群的身份，确定包含至少大量 胎盘干细胞的细胞群，等等。其身份被确认的胎盘干细胞群，可以是纯系 的，例如，从单个胎盘干细胞扩增的胎盘干细胞群，或混合的干细胞群，例 如，仅含有从多个胎盘干细胞扩增的胎盘干细胞的细胞群，或含有胎盘干细 胞和至少一种其它类型的细胞的细胞群。这些基因的表达水平可被用于选择胎盘干细胞群。例如，如果一种或多 种这些基因的表达在来自细胞群的样本中显著高于等同的间充质干细胞群， 可以选择该细胞群，如纯系扩增的细胞。这种选择可以是从大量胎盘干细胞 群中选择群体，从身份未知的大量细胞群中选择群体等。可以相较于间充质干细胞对照中所述一种或多种基因的表达水平，根据 一种或多种这种基因的表达水平来选择胎盘干细胞。在一实施方案中，含有 等量间充质干细胞的样本中所述一种或多种基因的表达水平被作为对照。在 另一实施方案中，用于在一定条件下测试胎盘干细胞的对照，是表示在所述 条件下间充质干细胞中所述一种或多种基因的表达水平的数值。本发明的胎盘干细胞，在原代培养中，或在包含60% DMEM-LG(Gibco)、 40% MCDB-201 (Sigma)、 2。/。胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、 lX胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、 1X亚油酸牛血清白蛋白(LA-BSA)、 10-9 M地 塞米;j^(Sigma)、 l(T4 M抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、 10 ng/ml表皮生长因子 (EGF) (R&D Systems)、 10 ng/ml血小板来源的生长因子(PDGF-BB) (R&D Systems)和100U青霉素/1000U链霉素的培养基中增殖期间，显示上面的特 性(例如，细胞表面标记和/或基因表达分布图的組合)。如上所述分离的胎盘干细胞群和胎盘干细胞群一般可包含大约、至少、 或至多lx105、 5xl05、 lx106、 5xl06、 lx107、 5xl07、 lx108、 5xl08、 lx109、 5xl09、 lx1010、 5xl010、 lxlO"或更多的胎盘干细胞。5丄3培养中的生长这里描述的胎盘干细胞的生长，对于任何哺乳动物细胞，部分地取决于 选择用于生长的特定培养基。在适宜条件下，胎盘干细胞在3-5天内一般会 数量倍增。在培养期间，本发明的胎盘干细胞附着于培养中的基质，例如组 织培养容器的表面(例如，组织培养皿塑料、纤粘连蛋白涂层的塑料等等)， 而且形成单细胞层。当在合适的条件下培养时，包含本发明的胎盘干细胞的分离的胎盘细胞 群形成拟胚体，也即细胞的三维簇生长在附着的干细胞层的顶上。拟胚体内 的细胞表达与极早期干细胞相关的标记，例如，OCT-4、 Nanog、 SSEA3和 SSEA4。拟胚体内的细胞一般不附着于培养基质，如这里描述的胎盘干细胞 那样，但是在培养期间仍然附着于粘附细胞。拟胚体细胞的活力依赖于附着 的胎盘干细胞，因为在缺乏附着的干细胞时不能形成拟胚体细胞。附着的胎 盘干细胞因此促进胎盘细胞群中一种或多种拟胚体的生长，该胎盘细胞群包 含附着的胎盘干细胞。不希望受理论的约束，拟胚体的细胞被认为在附着的 胎盘干细胞上生长，4艮4象胚胎干细胞生长于细胞的滋养层。间充质干细胞， 例如，骨髓来源的间充质干细胞，在培养中不生长拟胚体。5.2获得胎盘干细胞的方法 5.2.1干细胞收集組合物本发明进一步提供了收集和分离胎盘干细胞的方法。通常，使用生理学 可接受的溶液，例如，干细胞收集组合物，可从哺乳动物胎盘中获得干细 胞。干细胞收集組合物详细描述于2005年12月29日提交的，题目为 "Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs" 的相关美国临时申请号60/754,969中。干细胞收集组合物可包含适于收集和/或培养的干细胞的任何生理学可接 受的溶液，例如，盐溶液(例如、磷酸緩冲盐溶液、Kreb's溶液、改良的 Kreb，s溶液、Eagle's溶液、0.9% NaCl等等)，培养基(例如，DMEM、 H.DMEM等等)，等等。干细胞收集组合物可包含一种或多种組分，其有助于保藏胎盘干细胞， 也即，从收集的时间到培养的时间内，防止胎盘千细胞死亡，或延迟胎盘干 细胞的死亡，降低细胞群中死亡的胎盘干细胞的数目等等。这种組分可以 是，例如，凋亡抑制剂(例如，半胱氨酸蛋白酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管 扩张剂(例如，疏酸镁、抗高血压药物、心钠素(ANP)、促肾上腺皮质激素、 促肾上腺皮质激素释放激素、硝普酸钠、肼苯哒溱、腺苦三磷酸、腺噤呤核 苷、疏酸p引哚氯甲酰或疏酸镁、磷酸二酯酶抑制剂，等等)；坏死抑制剂(例 如，2-(lH-吲哚-3-基)-3-戊烷基氨基-顺丁烯二酰亚胺、二疏代氨基甲酸吡咯
烷，或氯硝安定)；TNF-a抑制剂；和/或携带氧的全氟化碳(例如，全氟代辛 基溴、全氟代癸基溴，等等)。干细胞收集组合物可包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、 丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNA酶、或DNA酶，等等。这些酶包括但不 限于，胶原酶(例如，胶原酶I、 II、 III或IV、来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶 原酶，等等)；中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、 LIBERASE、透明质酸酶，等等。干细胞收集组合物可包含杀菌的或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非 限制性实施方案中，抗生素是大环内酯(例如，托普霉素)、头孢菌素(例如， 头孢氨千、头孢拉定、头孢氨呋將、头孢丙烯、氯头孢菌素、头孢克肟或头 孢羟氨千)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如，青霉素V)或喹诺酮(例如，氧 氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素，等等。在特定的实施方案 中，抗生素对革兰氏(+)和/或革兰氏(-)细菌，例如，铜绿假单胞菌、金黄色 葡萄球菌，等等有效。干细胞收集组合物还可以含有一种或多种下列化合物腺嘌呤核苷(大约 1 mM到大约50mM); D-葡萄糖(大约20 mM到大约100 mM);镁离子(大约 1 mM到大约50 mM);分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一实施方案 中，以足以保持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如，合成的或天然存在的 胶体，多糖如右旋糖酐或聚乙二醇，以大约25 g/1到大约100 g/1，或大约 40 g/1到大约60 g/1存在)；抗氧化剂(例如，丁基羟基苯甲醚、2,6-二叔丁基 对甲酚、谷胱甘肽、维生素C或维生素E、以大约25一到大约IO(VM存 在)；还原剂(例如，N-乙酰半胱氨酸，以大约O.l mM到大约5 mM存在)； 防止钙进入到细胞中的试剂(例如，维拉帕米，以大约2|oM到大约25|oM存
在)；硝化甘油(例如，大约0.05 g/L到大约0.2 g/L);抗凝血药，在一实施方 案中，以足以帮助防止残余血液凝固的量存在(例如，肝素或水蛭素，以大约 1000单位/1到大约100,000单位/1的浓度存在)；或含有阿米洛利的化合物(例 如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、环六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛 利或异丁基阿米洛利，以大约1.0jJVl到大约5)JV[存在)。5.2.2胎盘的收集和处理一般，人胎盘在出生后胎盘排出后不久回收。在优选的实施方案中，在 告知同意以后，而且在取得患者的完整病史且将其与胎盘相关联以后，从患 者中回收胎盘。优选地，病史在产后继续。这种病史可用于协调胎盘或从其 收获的千细胞的随后的应用。例如，根据病史，人胎盘干细胞可用作与该胎 盘相关的嬰儿或嬰儿的双亲、同胞或其它的亲属的个性化药物。回收胎盘干细胞之前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方案中，在产 后回收胎盘中脐带血。胎盘可以进行常规的脐带血回收程序。 一般，使用针 或套管，借助于重力，给胎盘放血(参见，例如，Anderson,美国专利号 5,372,581; Hessel等，美国专利号5,415,665)。针或套管通常放入脐静脉 中，而且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。这种脐带血回收 可以商业化地进4亍，例如，LifeBank USA, Cedar Knolls, N. J., ViaCord， Cord Blood Registry and Cryocell。优选地，胎盘通过重力排空而不进行进一步操 作，以便在脐带血回收期间将組织破坏最小化。一般，胎盘从分娩或出生房间被转移到另一个位置，例如，实验室，用 于回收脐带血和通过，例如，灌注或组织解离来收集干细胞。胎盘优选在无 菌的，隔热的转运装置中进行转运(保持胎盘的温度为20-28°C)，例如，通过 把近端脐带夹紧的胎盘放在无菌的拉链-锁塑料袋中，然后放入保温容器中。在另一实施方案中，基本上如未决美国专利号7,147,626所述，把胎盘放在 脐带血收集试剂盒中转运。优选地，在分娩之后4至24小时内把胎盘转运 到实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收之前，近端脐带被夹紧，优选 在插入到胎盘圆盘的4-5 cm(厘米)内。在其它的实施方案中，在脐带血回收 以后，但是在胎盘的进一步处理之前，夹紧近端脐带。在干细胞收集之前，胎盘可以储存在无菌条件下，而且是室温或者5到 25。C(^聂氏度)的温度。在灌注胎盘以除去任何残余的脐带血之前，胎盘可以 储存4到24小时、高达48小时、或长于48小时。在一实施方案中，从娩 出后大约0小时到大约2小时收获胎盘。胎盘优选于5到25。C(摄氏度)储存 在抗凝血溶液中。适合的抗凝血溶液是本领域公知的。例如，可以使用肝素 或华法林钠的溶液。在一优选实施方案中，抗凝血溶液包括肝素溶液(例如， 1% w/w，在1 : 1000溶液中)。在收集胎盘千细胞之前，被放血的胎盘优选 储存至多36小时。哺乳动物胎盘或其部分， 一旦通常如同上述收集和制备，可采用本领域 已知的任何方式处理，例如，可以灌注或裂解，例如，用一种或多种組织裂 解酶消化，以获得干细胞。5.2.3胎盘组织的物理裂解和酶消化在一实施方案中，通过物理裂解完整器官的部分，从哺乳动物胎盘中收 集干细胞。例如，胎盘或其部分可以净皮例如压碎、剪切、切碎、切割成小 片、斩碎、浸渍等等。然后可以培养組织以获得千细胞群。 一般地，使用例 如干细胞收集组合物来裂解胎盘組织(参见5.2.1节和下文)。
在物理裂解和/或酶消化以及干细胞回收之前，可以把胎盘解剖成4艮多部 分。胎盘干细胞可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘子叶，或其任何组合的全 部或部分，包括从全部胎盘中获得。优选地，胎盘干细胞可从包括羊膜和绒 毛膜的胎盘组织中获得。
一般地，通过裂解一小块胎盘組织，例如，大约1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900或大约1000立方毫米体积 的一块胎盘組织，来获得胎盘干细胞。可以使用任何物理裂解方法，只要该 裂解方法能保持所述器官中大量，更优选大多数，更优选至少60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 98%或99%的细胞存活，如通过例如台盼蓝排除法所确 定的。干细胞通常在胎盘娩出后的大约第一个3天内的任何时间内从胎盘或其 部分中收集，但是优选娩出后的大约8小时到大约18小时。在特定的实施方案中，裂解的组织在适于胎盘干细胞增殖的組织培养基 中培射参见，例如以下5.3节，描述了胎盘干细胞的培养)。在另一特定的实施方案中，通过胎盘组织的物理裂解来收集干细胞，其 中物理裂解包括酶消化，其可能使用一种或多种组织消化酶来实现。胎盘或 其部分，也可被物理裂解和用一种或多种酶消化，得到的物质然后浸于，或 混合到干细胞收集組合物中。优选的干细胞收集组合物包括一种或多种組织裂解酶。酶消化优选使用 酶的组合，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，如月交原酶和分散酶 的组合。在一实施方案中，胎盘組织的酶消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋 白酶和用于消化透明质酸的粘液分解酶的组合，如胶原酶、分散酶和透明质 酸酶的组合，或LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp" Indianapolis, Ind.)和
透明质酸酶的组合。可用于裂解胎盘組织的其它酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核 糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶。丝氨 酸蛋白酶可以被血清中的a2微小球蛋白抑制，因此用于消化的培养基通常是 无血清的。EDTA和DNA酶通常用于酶消化，以增加细胞回收的效率。消 化物优选地进行稀释，以便避免截留粘性消化液内的干细胞。可以4吏用組织消化酶的任何组合。组织消化酶的典型浓度包括，例如， 胶原酶I和胶原酶IV为50-200 U/mL ，分散酶为1 -10 U/mL ，弹性蛋白酶为 10-100 U/mL。蛋白酶可以组合^f吏用，也即，两种或多种蛋白酶处于相同的 消化反应中，或可以连续使用以便释放胎盘干细胞。例如，在一实施方案 中，胎盘或其部分，在37。C下，首先用大约1到大约2 mg/ml的合适量的胶 原酶I消化例如30分钟，接着用浓度为大约0.25%的胰蛋白酶消化例如10 分钟。丝氨酸蛋白酶优选在使用其它酶之后接连应用。在另一实施方案中，在用干细胞收集组合物分离干细胞之前，可通过将 螯合剂，例如乙二醇双(2-氨乙基醚)-N,N,N，N，-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙 酸(EDTA)，添加到包含干细胞的干细胞收集組合物中，或添加到组织在其中 被裂解和/或消化的溶液中，来进一步裂解組织。在一实施方案中，消化可以如下进行。获得大约1克胎盘组织，并切 碎。在含有大约1 mg/mL胶原酶1A和大约0.25%胰蛋白酶的10 mL溶液 中，在振荡器中以大约100RPM在37。C下消化组织。消化物用培养基洗涤3 次，将洗涤过的细胞接种到2个T-75培养瓶中。然后通过差异性贴壁来分 离细胞，并表征例如活力、细胞表面标记、分化等等。应当理解，当整个胎盘，或胎盘的部分包含胎儿和母亲的细胞时(例如， 胎盘的部分包含绒毛膜或子叶)，收集的胎盘干细胞将包括来源于胎儿和母亲
来源的胎盘干细胞的混合物。当胎盘的部分不含有，或含有可以忽略数量的 母亲的细胞(例如，羊膜)时，收集的胎盘干细胞几乎只包括胎儿胎盘干细 胞。干细胞可通过差速胰蛋白酶消化(参见以下5.2.5节)，接着在新鲜的增殖 培养基中，在一个或多个新的培养容器中培养，可选地接着进行第二次差速 胰蛋白酶消化步骤，从裂解的组织中分离。5.2.4胎盘灌注胎盘干细胞也可以通过哺乳动物胎盘的灌注来获得。灌注哺乳动物胎盘 以获得干细胞的方法公开于，例如，Hariri ，美国申请
发明者克利斯登·S·拉巴左, 倩 叶, 王佳伦, 罗伯特·J·哈黎里, 萨沙·道恩·阿布拉门逊, 詹姆士·W·爱丁格, 赫伯特·费莱克, 马里安·佩雷拉 申请人:人类起源公司