专利名称：：一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法
技术领域：
：本发明涉及一种宏基因组文库的构建，尤其是涉及一种红树林土壤大片段宏基因组文库的构建方法。技术背景在环境宏基因组文库的构建过程中，原位裂解提取法较间接提取法所获得的环境DNA(environmentalDNA，eDNA)具有产量高，更真实代表环境中微生物群落的真实信息等优势。目前，已有许多基于原位裂解提取法的小片段(插入片段为3-10kbp)环境宏基因组文库的报道(1、HenneA,SchmitzRA,BomekeM,etal.ScreeningofenvironmentalDNAlibrariesforthepresenceofgenesconferringlipolyticactivityon￡^c/2er/c//aco"[J].Appl.Environ.Microbiol"2000，66(7):31133116;2、GaborEM，deVriesEJandJanssenDB.Construction,characterization,anduseofsmall-insertgenebanksofDNAisolatedfromsoilandenrichmentculturesfortherecoveryofnovelamidases[J].Environ.Microbiol.,2004,6(9):948958;3、YunJ，KangS,ParkS，etal.Characterizationofanovelamylolyticenzymeencodedbyagenefromasoil-derivedmetagenomiclibrary[J].Appl.Environ.Microbiol"2004,70(12):72297235;4、RanjanR，GroverA,KapardarRK，etal.Isolationofnovellipolyticgenesfromunculturedbacteriaofpondwater[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005,335(1):5765;5、FerrerM,GolyshinaOV，ChernikovaTN,etal.Novelhydrolasediversityretrievedfromametagenomelibraryofbovinerumenmicroflora[J].Environ.Microbiol"2005,7(8):19962010)。然而迄今，运用原位裂解法提取eDNA构建大片段DNA插入文库仍然存在特殊困难，通过直接裂解法获得能满足于构建大片段文库质量所需DNA的报道很少(PatrickRobe,RenaudNalin,CarmelaCapellano，etal.ExtractionofDNAfromsoil[J].EuropeanJournalofSoilBiology,2003，39(4):183190)，尤其，当研究对象为粘质及有机质含量高的土壤样品时，更加困难(ZhouJ,BrunsMA,andTiedjeJM.DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition[J].Appl.Environ.Microbiol.,1996,62(2):316322)。具体表现为(1)即使采用最温和的裂解方法，所得的土壤eDNA片段大小仍无法突破100kb(1、PatrickRobe,RenaudNalin,CarmelaCapellano，etal.ExtractionofDNAfromsoil[J].EuropeanJournalofSoilBiology,2003，39(4):183190;2、ZhouJ,BrunsMA,andTiedjeJM.DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition[J].Appl.Environ.Microbiol.,1996,62(2):316322)。裂解微生物细胞所释放的DNA，尤其是大片段的DNA极易重新吸附于土壤颗粒(clay)并易遭受核酸酶袭击，造成eDNA产量虽高，实际上大片段DNA所占比率低下，不足以构建宏基因组文库。(2)土壤中腐质酸、黄腐酸及腐质酸类等抑制性物质与eDNA共提取、共纯化问题难以解决(1、KrsekM,WellingtonEM.ComparisonofdifferentmethodsfortheisolationandpurificationoftotalcommunityDNAfromsoil[J].JMicrobiolMethods"1999,39(1):116;2、TsaiYLandOlsonBH.RapidmethodforseparationofbacterialDNAfromhumicsubstancesinsedimentsforpolymerasechainreaction[J].Appl.Environ.Microbiol.,1992,58(7):22922295;3、VogetS,LeggewieC,UesbeckA,etal.Prospectingfornovelbiocatalystsinasoilmetagenome[J].Appl.Environ.Microbiol.,2003，69(10):62356242;4、DanielR.Thesoilmetagenome—arichresourceforthediscoveryofnovelnaturalproducts[J].Curr.Opin.Biotechnol.,2004,15(3):199-204;5、PettitRK.SoilDNAlibrariesforanticancerdrugdiscovery[J].Cancer.Chemother.Pharmacol"2004，54(1):16)。因此，在土壤宏基因组文库的构建过程中，不同提取及纯化方法的比较研究及优化，提取与纯化方法的不同组合研究及优化，到最终确定一个行之有效的方案，不仅费时费力，且不一定能得到满意的结果。当前商业化的eDNA提取试剂盒也无力解决这些问题，通过试剂盒得到的DNA片段往往小于20kb，最终只能产生小片段的插入文库(1、GaborEM,deVriesEJandJanssenDB.Construction,characterization,anduseofsmall-insertgenebanksofDNAisolatedfromsoilandenrichmentculturesfortherecoveryofnovelamidases[J].Environ.Microbiol"2004,6(9):948958;2、RanjanR,GroverA,KapardarRK,etal.Isolationofnovellipolyticgenesfromunculturedbacteriaofpondwater[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005,335(1):5765)。红树林土壤微生物处于"海洋-陆地"交汇处的潮间带特殊生境，孕育了产生新颖次级代谢产物的可能途径，是拓展新型抗生素的天然宝库。由于红树林土壤中高粘质及高有机质含量的性质，从中难以获得适于构建大片段文库的高品质eDNA，至今，国内仅有数篇来源于红树林土壤的小插入片段质粒型文库报道，该文库克隆子的插入片段平均大小仅为3.2Kb(刘峰，洪葵.红树林土壤宏基因组文库构建和生物活性筛选[A].全国海洋生物技术与海洋药物学术会议论文集[C].2006,667669)。国外尚未见大片段红树林土壤宏基因组文库相关报道。众所周知，小片段的环境基因组文库无法捕捉编码抗生素等物质的完整基因簇，对新药开发的价值不大。因此，有必要建立一种适用于高效构建红树林土壤大片段宏基因组文库的eDNA提取与纯化最优组合方案，以加快潮间带特色微生物资源的开发应用研究
发明内容本发明的目的是提供一种快速、经济、高效构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，用于红树林土壤未培养微生物的药用价值开发。本发明包括以下步骤1)选定菌株、克隆载体和培养基菌株为大肠杆菌五^/^^/'^0//￡1-100，克隆载体为pWEBTM，培养基为LB肉汤及LB琼脂，均添加氨苄西林，培养温度为37。C。2)提取红树林土壤eDNA:称取36份土壤样品，分别置于离心管中，每管加入DNA提取缓冲液，漩涡至土壤颗粒分散于缓冲液中，将土壤样品振摇至土壤匀质化，每管加入十二垸基磺酸纳(SDS)，混匀，5565'C水浴，加入氯仿/异戊醇溶液抽提，离心，收集上清，在上清中加入异丙醇，沉淀，离心，收集沉淀得红树林土壤eDNA。3)红树林土壤eDNA的处理通过脉冲场电泳选择适合构建大片段文库的eDNA片段，采用电洗脱回收、纯化，得3545kb的红树林土壤eDNA片段。4)红树林土壤eDNA末端补平将3545kb的红树林土壤eDNA片段进行末端补平反应，在冰上依次加入末端补平反应体系各组分，室温下孵育，7(TC下灭活末端补平酶。5)末端补平物与载体连接将末端补平的红树林土壤eDNA连接到pWEBTM载体，在冰上依次加入连接反应体系各组分，室温下孵育，7(TC下灭活连接酶，得cosmidDNA连接物。6)连接产物体外包装将cosmidDNA连接物用MaxPlaxLambdaPackagingExtracts进行体外包装反应。反应条件为30°C,90min。反应结束后，再次加入MaxPlaxLambdaPackagingExtracts,30°C，继续孵育90min。然后加入噬菌体稀释液，混匀，加入氯仿，混匀后得包装好的cosmids，保存于4'C。7)包装产物的效价测定用包装好的cosmids感染宿主细胞Esc/zm'c/n'flco//EPI-IOO，37°C孵育，将感染后的宿主细胞涂布于已添加氨苄西林LB琼脂平板，37°C，过夜培养，所有生长出的菌落均为阳性克隆子，计算克隆子数目，得红树林土壤大片段宏基因组文库。8)克隆子插入片段的验证随机挑取至少10个LB-氨苄西林平板上的菌落，接种于LB-氨苄西林肉汤，37'C下培养，提取克隆子质粒，用BamHI限制性内切酶(TaKaRa)酶切，计算文库插入片段的大小。9)阳性克隆子的保存将所有的阳性克隆子接种于细胞培养板，每孔含LB肉汤、氨苄西林和甘油，待克隆子长好后，将细胞培养板复制一份，均保存于-8(TC。在选定菌株、克隆载体和培养基中，克隆载体购于Epicentre公司，氨苄西林的浓度为100—200jxgm匸1。在提取红树林土壤eDNA中，每份土壤样品的质量为38g，DNA提取缓冲液为100mMTris-HCl[pH8.0],100mMsodiumEDTA[pH8.0],100mMsodiumphosphate[pH8.0]，1.5MNaCl,1%CTAB,2%PVPP[polyvinylpolypyrrolidone]。5565。C水浴的时间最好为2~3h，按体积比，氯仿/异戊醇溶液的氯仿异戊醇为24:1，在上清中加入0.61倍体积的异丙醇。在红树林土壤eDNA末端补平中，末端补平反应体系的组成见表l。表l末端补平反应体系(pL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在末端补平物与载体连接中，室温下孵育的时间最好为218h，连接反应体系见表2。表2连接反应体系(pL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在连接产物体外包装中，MaxPlaxLambdaPackagingExtracts的用量最好为25|xL。反应结束后，加入的MaxPlaxLambdaPackagingExtracts的用量为25pL，继续孵育的时间最好为90min。噬菌体稀释液为IOmMTris-HCl[pH8.3],100mMNaCl,10mMMgC12，10mMTris-HCl[pH8.3]，100mMNaCl,10mMMgC12的用量最好为500|iL。氯仿的用量最好为25mL。在包装产物的效价测定中，cosmids的用量最好为10pL。宿主细胞Esc/m'c/n'flco/z'EPI-100的用量最好为1OOpL。在阳性克隆子的保存中，LB肉汤的用量最好为120160jiL，氨苄西林的用量最好为100200mgml/1，甘油最好为20%。与现有的土壤文库构建方法相比，本发明的突出优点如下。1)提取红树林土壤eDNA缓冲液的优点本发明所用提取缓冲液添加了2。/。PVPP。采取此措施后，红树林土壤eDNA中高分子量杂质的共提取量明显降低，简化了后续对红树林土壤eDNA纯化过程，降低了大片段红树林土壤eDNA在多步纯化过程中被降解和流失的可能性。2)提取红树林土壤eDNA过程中氯仿/异戊醇溶液抽提方式的优点本发明在提取红树林土壤eDNA过程中采用"原位抽提"方式。已发表的众多文献中，土壤宏DNA的提取过程中有关"抽提"步骤是如下描述的，对裂解后的土壤液先离心收集上清，对上清液用氯仿/异戊醇溶液抽提后，再次离心收集上清，然后对上清液沉淀。本发明采用"原位抽提"方式，即对裂解后的土壤液直接用氯仿/异戊醇溶液抽提，离心收集上清，然后对上清液沉淀。"原位抽提"方式降低了已裂解的，呈裸露状态的大片段红树林土壤eDNA重新吸附于土壤颗粒的可能性，及时使得更多的大片段红树林土壤eDNA分配于水相，以提高大片段DNA在总红树林土壤eDNA中的比例，从而提高了大片段宏基因文库构建成功的可能性。此外，"原位抽提"方式减少了一个离心过程，降低了因人工操作导致DNA分子断裂的风险，同样提高了大片段宏基因文库构建成功的可能性。3)红树林土壤eDNA纯化方式的优点本发明采用电洗脱纯化方式。纯化试剂盒及低熔点琼脂糖电泳是经常用于纯化eDNA的方案，eDNA通过试剂盒纯化易被剪切，很难满足构建大片段宏基因文库的要求；低熔点琼脂糖电泳能避免eDNA被剪切，但实际操作过程中，琼脂糖颗粒不易完全去除，残留的琼脂糖颗粒易干扰连接反应等后续实验，导致结果不尽人意，而且其价格昂贵。电洗脱纯化方式纯化红树林土壤eDNA的同时维持了其片段大小。图l为本发明实施例的红树林土壤eDNA提取结果(a)本发明方法所得结果泳道14为4个季节的红树林土壤eDNA(eDNA上样量分别为36^L，24^L，12^L，6pL);Mi,X-历"dIIImarker;M2，XDNA;(b)常规方法所得结果泳道1为红树林土壤eDNA(eDNA上样量为24pL);M,，XDNA;M2，X-州"dIIImarker。图2为本发明实施例的红树林土壤文库克隆子插入片段的准确性验证结果(a)限制性酶切图谱，泳道1~8，随机挑选克隆子的；(b)限制性酶切图谱，泳道1~4,随机挑选的克隆子；MhX-￡coRImarker;M2,2-丄ogDNAladder。具体实施方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。1)选定菌株、克隆载体和培养基菌株为大肠杆菌五w^en'c/n'flco"EPI-100，克隆载体为pWEB，购于Epicentre公司，培养基为LB肉汤及LB琼脂，均添加浓度为200mL一1的氨苄西林，培养温度为37'C。2)采集红树林土壤样品红树林土壤采集于福建省云霄县东厦镇境内的福建省漳江口红树林国家级自然保护区，该保护区地处东经117。24'07"117。30'00"，北讳23。53'45"23。56'00"，海拔-68m，总面积2360hm2。一年中4个季节均采样。具体采样方案如下退潮后，在红树林区设置9个采样位点(低、中、高潮带，各潮带分别设3个采样点)，每个采样点设置lmxlm的样方，除去表面约lcm厚的薄层后，用专用采泥器钻取得到550cm层次的土壤样品，随机多点钻取的土样拣去根系并混合均匀后装入做好标记的灭菌的塑料袋，密封，为一个样点样品，所有位点样品均匀混合成为一个季节的样品，随冰块带回实验室分析，剩余样品于-8(TC保存。所有采样器具均事先灭菌处理。每个季节采样时，所有采样位点均保持一致。3)提取红树林土壤eDNA:在无菌操作台中，称取每个季节土壤样品各5g(湿重)，分别置于50mL无菌离心管中，每管加入13.5mLDNA提取缓冲液(100mMTris-HCl[pH8.0],100mMsodiumEDTA[pH8.0],100mMsodiumphosphate[pH8.0],1.5MNaCl,1%CTAB,2%PVPP[polyvinylpolypyrrolidone]),剧烈漩涡510min，使土壤颗粒充分分散于缓冲液中。将上述样品置于37°C，225rpm，水平振摇45min，使得土壤匀质化。每管加入1.5mL20%SDS，上下颠倒混匀，65t水浴3h,其间尽可能温和颠倒混匀。水浴裂解过程结束后，待裂解物理稍稍冷却至室温，立即加入预冷的氯仿/异戊醇(24:l，vol/vo1)，上下颠倒，充分混和均匀后，室温下，于8000xg离心15min。收集上清，加入0.6体积的经预冷的异丙醇，室温下沉淀1h。室温下，U000xg离心20min收集沉淀。核酸沉淀用70%冰乙醇洗涤两次，11000xg离心5min,重悬于100pL无菌TE缓冲液(10mMTris，lmMEDTA,pH8.0)。四个季节的红树林土壤样品，eDNA总量为400^L。4)红树林土壤eDNA的处理通过脉冲场电泳(Genenavigatorelectrophoresissystem)分离、选择大小合适的插入片段(1.5%的琼脂糖胶；0.15xTBE缓冲液；电压250V;脉冲值:8s;电泳时间4h)。电泳结束后，切下两侧带DNAmarker的胶带，于0.15xTBE/EB缓冲液染色20min,紫外灯下做好标记，以识别目的片段在胶块上的位置。根据标记，切下含目的DNA片段的胶块。采用电洗脱(electro-elutermodulesystem)的方法回收、纯化目的DNA片段(lxTAEbuffer;电流30mA;运行时间3h)。程序完毕后，反转电极，继续运行3min,以释放底部小室膜上所吸附的DNA片段；尽可能吸干装有胶块玻璃小管中的TAE缓冲液，以保证小室中DNA溶液体积小于50pL;轻轻吸取回收的DNA溶液于无菌EP管，通过普通琼脂糖凝胶电泳评估回收目的DNA片段的品质，剩余DNA暂时存放于4°C冰箱中待用。5)红树林土壤eDNA末端补平将3545kb的红树林土壤eDNA片段进行末端补平反应，在冰上依次加入末端补平反应体系各组分，室温下孵育60min，7(TC下灭活末端补平酶。末端补平反应体系的组成见表3。表3实施例末端补平反应体系(pL)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>6)末端补平物与载体连接将末端补平的红树林土壤eDNA连接到pWEBTM载体，在冰上依次加入连接反应体系各组分，室温下孵育6h，7(TC下灭活连接酶，得cosmidDNA连接物。连接反应体系见表4。表4实施例连接反应体系(pL)无<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7)连接产物体外包装将10nLcosmidDNA连接物用25pLMaxPlaxLambdaPackagingExtracts进行体外包装反应。反应条件为30°C，90min。反应结束后，再次加入25^LMaxPlaxLambdaPackagingExtracts,30°C，继续孵育90min。然后加入500|xL噬菌体稀释液(10mMTris-HCl[pH8.3],lOOmMNaCl,10mMMgC12)，混匀。加入25ml氯仿，混匀后得包装好的cosmids，保存于4。C。8)包装产物的效价测定用10包装好的cosmids感染lOOpL宿主细胞Eyc/zeWcWaco//EPI-IOO，37'C孵育，将感染后的宿主细胞涂布于已添加氨苄西林LB琼脂平板，37°C,过夜培养，所有生长出的菌落均为阳性克隆子，计算克隆子数目，得红树林土壤大片段宏基因组文库。9)克隆子插入片段的验证随机挑取12个LB-氨节西林平板上的菌落，接种于5mLLB-氨苄西林肉汤，37°C，225rpm，培养18h。根据分子克隆实验指南(第二版)，提取克隆子质粒，经0.9%琼脂糖电泳验证后，用BamHI限制性内切酶(TaKaRa)，以计算插入片段的大小。10)阳性克隆子的保存每一个阳性cosmid克隆子均接种于96孔细胞培养板，每孔含150pLLB肉汤，200mgmL"氨苄西林，20%甘油，待克隆子长好后，将每个96孔板复制一份，均保存于-80。C。结果分析与讨论如下。1)红树林土壤eDNA提取结果如图1所示，运用本发明方法所得红树林土壤eDNA片段大小多集中在2350kb，显示大片段DNA在总eDNA中的比率明显增加。0.9%普通琼脂糖凝胶电泳估算粗提物产量为2.6吗g"(湿重)。2)红树林土壤大片段宏基因组文库构建结果:用l(HtL包装好的cosmids侵染100pL制备好的宿主细胞&c/ien'c/H'aco/!'EPI100，LB-氨苄西林平板上平均能生长87个克隆子，包装效率为8.7x103，包装总体积为1100pL，得到9570个携带红树林土壤微生物基因组片段克隆子的文库。3)红树林土壤文库克隆子插入片段的准确性验证结果所有随机挑选的克隆子质粒经BamHI消化后，0.9%琼脂糖电泳显示每个克隆子的平均插入片段均〉35kb，而且每个插入片段均呈现不同带型(见图2)，说明了该文库插入片段的多样性。结论本发明的应用能提高红树林土壤环境总的eDNA中大片段DNA的比例，高效构建红树林土壤微生物大片段宏基因组文库，为开发红树林土壤未培养微生物的药用资源提供了有力工具，并为探索其它生境的未培养微生物资源提供借鉴。权利要求1.一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于包括以下步骤1)选定菌株、克隆载体和培养基菌株为大肠杆菌EscherichiacoliEPI-100，克隆载体为pWEBTM，培养基为LB肉汤及LB琼脂，均添加氨苄西林，培养温度为37℃；2)提取红树林土壤eDNA称取3～6份土壤样品，分别置于离心管中，每管加入DNA提取缓冲液，漩涡至土壤颗粒分散于缓冲液中，将土壤样品振摇至土壤匀质化，每管加入十二烷基磺酸纳，混匀，55～65℃水浴，加入氯仿/异戊醇溶液抽提，离心，收集上清，在上清中加入异丙醇，沉淀，离心，收集沉淀得红树林土壤eDNA；3)红树林土壤eDNA的处理通过脉冲场电泳选择适合构建大片段文库的eDNA片段，采用电洗脱回收、纯化，得35～45kb的红树林土壤eDNA片段；4)红树林土壤eDNA末端补平将35～45kb的红树林土壤eDNA片段进行末端补平反应，在冰上依次加入末端补平反应体系各组分，室温下孵育，70℃下灭活末端补平酶；5)末端补平物与载体连接将末端补平的红树林土壤eDNA连接到pWEBTM载体，在冰上依次加入连接反应体系各组分，室温下孵育，70℃下灭活连接酶，得cosmidDNA连接物；6)连接产物体外包装将cosmidDNA连接物用MaxPlaxLambdaPackagingExtracts进行体外包装反应，反应条件为30℃，90min，反应结束后，再次加入MaxPlaxLambdaPackagingExtracts，30℃，继续孵育90min，然后加入噬菌体稀释液，混匀，加入氯仿，混匀后得包装好的cosmids，保存于4℃；7)包装产物的效价测定用包装好的cosmids感染宿主细胞EscherichiacoliEPI-100，37℃孵育，将感染后的宿主细胞涂布于已添加氨苄西林LB琼脂平板，37℃，过夜培养，所有生长出的菌落均为阳性克隆子，计算克隆子数目，得红树林土壤大片段宏基因组文库；8)克隆子插入片段的验证随机挑取至少10个LB-氨苄西林平板上的菌落，接种于LB-氨苄西林肉汤，37℃下培养，提取克隆子质粒，用BamHI限制性内切酶(TaKaRa)酶切，计算文库插入片段的大小；9)阳性克隆子的保存将所有的阳性克隆子接种于细胞培养板，每孔含LB肉汤、氨苄西林和甘油，待克隆子长好后，将细胞培养板复制一份，均保存于-80℃。2.如权利要求1所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在选定菌株、克隆载体和培养基中，氨苄西林的浓度为100200pgmL一1。3.如权利要求1所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在提取红树林土壤eDNA中，每份土壤样品的质量为38g;DNA提取缓冲液为100mMTris-HCl[pH8.0],100mMsodiumEDTA[pH8.0],100mMsodiumphosphate[pH8.0],1.5MNaCl,1%CTAB,2%PVPP[polyvinylpolypyrrolidone];5565。C水浴的时间为2~3h，按体积比，氯仿/异戊醇溶液的氯仿异戊醇为24:1，在上清中加入0.61倍体积的异丙醇。4.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在红树林土壤eDNA末端补平中，末端补平反应体系的组成如表l所示。表l末端补平反应体系(pL)<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>5.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在末端补平物与载体连接中，室温下孵育的时间为218h，连接反应体系如表2所示。表2连接反应体系(pL)<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在连接产物体外包装中，MaxPlaxLambdaPackagingExtracts的用量为25pL。7.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在连接产物体外包装中，反应结束后，加入的MaxPlaxLambdaPackagingExtracts的用量为25^L，继续孵育的时间为90min。8.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在连接产物体外包装中，噬菌体稀释液为IOmMTris-HCl[pH8.3],100mMNaCl,10mMMgC12;10mMTris-HCl[pH8.3],100mMNaCl，10mMMgC12的用量为500^L;氯仿的用量最好为25mL。9.如权利要求l所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在包装产物的效价测定中，cosmids的用量为10^L;宿主细胞￡^/^/^/'0(:0//￡1-100的用量为100pL。10.如权利要求1所述的一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，其特征在于在阳性克隆子的保存中，LB肉汤的用量为120160nL，氨节西林的用量为100200mgmL"，甘油为20%。全文摘要一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，涉及一种宏基因组文库的构建，尤其是涉及一种红树林土壤大片段宏基因组文库的构建方法。提供一种快速、经济、高效构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法。选定菌株、克隆载体和培养基；提取红树林土壤eDNA；红树林土壤eDNA的处理；红树林土壤eDNA末端补平；末端补平物与载体连接；连接产物体外包装；包装产物的效价测定；克隆子插入片段的验证；阳性克隆子的保存。文档编号C12N15/31GK101148676SQ200710009528公开日2008年3月26日申请日期2007年9月12日优先权日2007年9月12日发明者蒋云霞,郑天凌申请人:厦门大学