专利名称：：一种苄嘧磺隆高效降解菌株的筛选及降解活性的鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及生物降解农药残留
技术领域：
，具体地说是一种节嘧磺隆高效降解菌株的筛选及降解活性的鉴定方法。技术背景苄嘧磺隆，又称节磺隆、亚磺隆，商品名为农得时(Londax)，化学名称2-{[(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基羰基氨基]磺酰基甲基]}苯甲酸甲酯(Methyl-2-{[(4,methyl}benzoate)。分子式为ClbH18N40;，分子量为410.40，化学结构式为:节嘧磺隆是20世纪80年代中期美国杜邦公司开发的一种新型磺酰脲类除草剂，具有高效、低毒、广谱、用量少、价格低廉等优点，是目前广泛用于稻田、麦田杂草防治的主要除草剂之一。但是它在土壤中的残留周期较长(在黏土中半衰期4~20周)，难挥发，不易降解，易对后茬敏感作物造成危害。因此，解决节嘧磺隆残留的降解问题已成为当前农残降解领域研究的热点。目前，国内外很多专家采取了一系列措施来减少节嘧磺隆残留所造成的危害，主要有添加复配剂降低节嘧磺隆的用量，开发抗药性转基因作物等，但这些措施并不能从根本上解决农药残留问题。因此，研制苄嘧磺隆生物降解菌剂具有十分重要的意义，但由于很难筛选出苄嘧磺隆的高效降解菌株，目前仍未见节嘧磺隆降解菌剂的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种高效、廉价的节嘧磺隆高效降解菌株的筛选及其降解活性的鉴定方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下高效降解菌株的筛选方法包括以下步骤l)降解菌的富集驯化取810g接种源置入三角瓶中，加入80~100ral节嘧磺隆浓度为50~100mg/L的富集培养基和5~10g玻璃珠(将接种源充分打匀)，于283(TC,150~180r/min摇床培养条件下振荡培养57天，备用将培养液按体积百分比5~10/的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100~150mg/L的新的富集培养基中，于283(TC,6-dimethoxy—pyrimidin—2—y1)aminocarbonylamino]sulfonyl150180r/min条件下振荡培养5~7天，而后将富集培养中的窄嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3~4次，得到富集菌液，待用；2)分离筛选在80~100ml苄嘧磺隆浓度为100~150mg/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比5~10%的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于283(TC,180200r/min条件下振荡培养5-7天；而后将培养液按体积百分比5~10%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100~150mg/L的新的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3~4次，得到以节嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用；3)复壮、纯化将分离筛选所得的混合菌液，稀释106~108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，283(TC培养23天，挑选不同性状的单菌落在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；4)验证降解菌将步骤3)中纯化好的菌株在选择性无机盐培养基固体平板上划线，其中选择性培养基内添加节嘧磺隆至终浓度为100~150mg/L,28~3(TC培养3~4天，能够生长的菌株即为能够以节嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株。5)鉴定降解菌株的降解活性利用玉米生测法初筛出高活性的降解菌株，再利用高效液相色谱法确定高效菌株的降解率。所述步骤l)中的富集培养基的组成为蛋白胨8.0-10.Og,NaCl0.8~1.0g,KH2PO40.8~1.Og,C6H12061.~2.Og,水1000ml，pH=6.0~7.2。所述步骤2)和4)中的选择性培养基的配方为NH4N030.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g，(NH4)2S040.5~0.8g,KH2P040.5~0.8g，NaCl0.5~0,8g,K2HP042.0~2.5g,FeCl30.005~0.Olg，CaCl20.01~0.02g，蒸馏水1000ml,pH=6.0-7.2。所述步骤3)中的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏2.5~5.Og，蛋白胨8.0~10.Og，NaCl2.5~5.Og,琼脂15.0~20.Og，水1000ml，pH=7.0~7,2。所述釆用节嘧磺隆时用少量甲醇助溶，并在灭菌后加入培养基中。菌株降解活性的鉴定方法根据玉米生测实验主根长抑制率y—一节嘧磺隆浓度对数x的标准曲线y=ax+b，初步得出步骤4)中所得的以苄嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株的降解活性，筛选出高活性菌株，而后利用高效液相色谱得出高效菌株的精确降解率。所述高效液相色谱的色谱条件为流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为60~80:20~40:0~0.5;流速为0.6~1.Oml/min;检测波长;230~260nm;柱温为283(TC;进样量为510iil。本发明所具有的优点1.本发明釆用的筛选方法简单易行、经济廉价，所得菌株可以用来制备节嘧磺隆的降解菌剂，在实践中有很好的应用潜力。2.本发明利用长期受节嘧磺隆污染的田间土壤为处理对象，所得的降解菌是田间土壤中的土著菌，制成菌剂后田间应用不易被排斥，效果会更好。3.本发明提供的生测实验法初筛与高效液相色谱法复筛相结合鉴定降解菌株降解活性的方法，成本低，且高效精确，具有很好的可行性。4.本发明提供的节嘧磺隆高效降解菌株的筛选方法可以用于其它磺酰脲类除草剂降解菌株的筛选，在农药残留降解菌株的筛选方面提供了一定的理论指导。图1为节嘧磺隆玉米生测实验标准曲线图。图2为笮嘧磺隆高效液相色谱试验标准曲线图。具体实施方式实施例1节嘧磺隆降解菌株的筛选1)降解菌的富集驯化取10g接种源(苏家屯丰收农药厂周边水稻田土样)置入250ml三角瓶中，加入100ml节嘧磺隆浓度为50mg/L的富集培养基和5g玻璃珠(将土样充分打匀)，于30°C，150r/min条件下振荡培养7天，将培养液按体积百分比10%的接种量接种于节嘧磺隆浓度为100mg/L的新配置的富集培养基中，于3(TC,150r/min条件下振荡培养7天，而后将富集培养基中的节嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3次于富集培养基中，转接3次节嘧磺隆浓度分别为150mg/L、200mg/L和250mg/L,得到富集菌液，待用；所述采用节嘧磺隆时用少量甲醇助溶。2)分离筛选在100ml苄嘧磺隆浓度为100rag/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比10%的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于3(TC,180r/min条件下振荡培养7天；而后将培养液按体积百分比10%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度不变的新配置的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3次，得到以节嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用；所述节嘧磺隆浓度不变与第一次分离筛选时采用的节嘧磺隆浓度相应。3)复壮、纯化将分离筛选所得的混合菌液，稀释106~108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，28-3(TC培养23天，挑选不同性状的单菌落在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；4)验证降解菌将步骤3)中纯化好的菌株在选择性培养基固体平板上划线，其中选择性培养基内添加节嘧磺隆至终浓度为100mg/L，28-3(TC培养3~4天，能够生长的菌株即为能够以节嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株。所述步骤l)中的富集培养基的组成为蛋白胨8.0-10.Og,NaCl60.8~1,0g,KH2P040.8~1.0g,C6H12061.0~2.0g,水1000ml，pH=6.0~7.2，UrC,30min，高压蒸汽灭菌后加入节嘧磺隆，根据实验步骤调整相应的浓度。所述步骤2)和4)中的选择性培养基的配方为NH4N030.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g,(NH4)2S040.5~0.8g,KH2P040.5~0.8g，NaCl0.5~0.8g，L线2.0~2.5g,FeCl30.005~0.Olg,CaCl20.01~0.02g,蒸馏水1000ml，pH=6.0~7.2,为防止产生沉淀，含磷的成分与其它成分，分别12rC,30min,高压蒸汽灭菌后再混合，固体平板，每升培养基加入20g琼脂，节嘧磺隆浓度根据实验步骤相应调整。所述步骤3)中的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏2.5~5.Og，蛋白胨8.0~10.Og，NaCl2.5~5.Og,琼脂15.0~20.Og,水1000ml，pH=7.0~7.2。实施例2降解菌株降解活性的鉴定利用玉米生测法初筛出高活性的降解菌株，再利用高效液相色谱法确定高效菌株的降解率。l.玉米生物测定法利用玉米对节嘧磺隆的敏感性，以中金736号玉米为处理对象。1)生测用玉米种子的前处理挑选色泽、大小力求一致的扁长形玉米种子，在25i:下浸种12h，使种子吸足水份，经催根处理后挑选根长为1.0~2.Ocm的种子备用。2)标准曲线的绘制在直径9cm的玻璃培养皿内放2张滤纸，分别加入20ml不同浓度(0.5,1,2.5，5，10，20,40ug/L)的以选择性培养基溶液配制的节嘧磺隆药液，每皿中放入8粒大小均匀，形态正常，籽粒饱满催根后的玉米种子，将玉米种子均勾排列在培养皿的滤纸上，胚芽向上，置于25'C培养箱内避光培养5天，培养结束后，将种子取出，分离根系，测量主根长，以没有加入节嘧磺隆的选择性培养基溶液作对照，每一处理组和对照组均设3个重复，将处理组与对照组进行显著性差异检验，计算处理组玉米主根长抑制率。古祸錢制蜜=对照组玉米主根长-处理组玉米主根长很引刺牛_对照组玉米主根长将节嘧磺隆浓度取对数,进行回归分析，可得主根长抑制率y—一节嘧磺隆浓度对数x的线性回归方程y=0.178x+0.2568(R2=0.9767)(参见表1和图1)。表i<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)鉴定降解活性将筛选出的能够降解苄嘧磺隆的菌株活化，接入100ml选择性液体培养基中，按体积百分比计，接种量10%，并添加节嘧磺隆至终浓度为20mg/L,于3(TC,180r/min条件下摇床振荡培养5天，取菌液过滤除菌，用上述生物测定法测定玉米主根长，然后将玉米根长数据代入标准曲线，计算降解后节嘧磺隆的浓度，初步得出降解活性。(由于玉米对节嘧磺隆很敏感，样品测定时，应该稀释至0~40ug/L的范围内)2.高效液相色谱法1)样品的预处理取20ml含节嘧磺隆的培养菌液，12000r/min离心5min，取上清液于100ml三角瓶中,加入25mlCH2C12,剧烈振荡后静置分层，弃水相收集有机相，有机相过无水硫酸钠柱，收集液体，N2吹干CH2Cl2,用甲醇定容至lml,待测。2)降解率的测定a)色谱条件色谱柱phe訓enexC主(4.6x150mm，5jum);流动相按体积份数比甲醇水冰醋酸(70:29.5:0.5,V:V:V);流速0.8ml/min;检测波长250nrn;柱温3(TC;进样量10|il;釆用外标法按峰面积定量。b)标准曲线的绘制准确称取节嘧磺隆标样，用甲醇溶解，流动相定容，配成1.0,5.0,10.0,15.0，20.Omg/L系列标准溶液，按上述色谱条件测定。得出峰面积y—一节嘧磺隆质量浓度x的直线回归方程为y-12.192x+4.0967,(R2=0.9994)(参见表2和图2)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>c)样品上机检测，得出精确的降解率。通过该方法筛选得到了4株以节嘧磺隆为唯一碳源的高效降解菌株，在节嘧磺隆初始浓度为20mg/L的选择性培养基中，接种量10%,温度3(TC,180r/min摇床培养条件下培养5天，菌株的降解率都能达到60%以上。所得的4株以节嘧磺隆为唯一碳源的高效降解菌株，其与伯杰鉴定手册(第八版)[M].北京，科学出版社；黄星，噻吩磺隆降解菌FLX的分离鉴定及降解特性[J].中国环境科学，2006,26(2):214-218;邵劲松，一株绿磺隆降解菌的分离鉴定及其特性研究[J].土壤学报，2003,40(6):952-956的专利附文献中的菌种理化性质相当，经其16SrDNA测序和理化性质初步鉴定为土壤中常规的野油菜黄单胞菌、粘质沙雷氏菌、寡养单胞菌和乙酸钩不动杆菌。实施例3与实施例1不同之处在于l)降解菌的富集驯化取8g接种源置入三角瓶中，加入80ml节嘧磺隆浓度为100mg/L的富集培养基和10g玻璃珠(将接种源充分打匀)，于28T,150r/min摇床培养条件下振荡培养5天，备用；将培养液按体积百分比5%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为150mg/L的新配置的富集培养基中，于28°C,150r/min条件下振荡培养5天，而后将富集培养基中的苄嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3次于富集培养基中，得到富集菌液，待用；2)分离筛选在80ml苄嘧磺隆浓度为150mg/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比5%的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于28°C,200r/min条件下振荡培养7天；而后将培养液按体积百分比5~10%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为150mg/L的新配置的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3次，得到以苄嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用；1)降解菌的富集驯化取9g接种源置入三角瓶中，加入90ml节嘧磺隆浓度为80mg/L的富集培养基和8g坡璃珠(将接种源充分打匀),于28°C，180r/min摇床培养条件下振荡培养5天，备用；将培养液按体积百分比8%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为130mg/L的新配置的富集培养基中，于28°C,180r/min条件下振荡培养5天，而后将富集培养基中的苄嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3次于富集培养基中，得到富集菌液，待用；2)分离筛选在90ml苄嘧磺隆浓度为130mg/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比5%的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于30°C,200r/min条件下振荡培养7天；而后将培养液按体积百分比8%的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为130mg/L的新配置的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3次，得到以节嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用。实施例权利要求1.一种苄嘧磺隆高效降解菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)降解菌的富集驯化取8～10g接种源置入三角瓶中，加入80～100ml苄嘧磺隆浓度为50～100mg/L的富集培养基和5～10g玻璃珠，于28～30℃，150～180r/min摇床培养条件下振荡培养5～7天，备用；将培养液按体积百分比5～10％的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的新的富集培养基中，于28～30℃，150～180r/min条件下振荡培养5～7天，而后将富集培养基中的苄嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3～4次，得到富集菌液，待用；2)分离筛选在80～100ml苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比5～10％的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于28～30℃，180～200r/min条件下振荡培养5～7天；而后将培养液按体积百分比5～10％的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的新的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3～4次，得到以苄嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用；3)复壮、纯化将分离筛选所得的混合菌液，稀释106～108倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，28～30℃培养2～3天，挑选不同性状的单菌落在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；4)验证降解菌将步骤3)中纯化好的菌株在选择性无机盐培养基固体平板上划线，其中选择性培养基内添加苄嘧磺隆至终浓度为100～150mg/L，28～30℃培养3～4天，能够生长的菌株即为能够以苄嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株；5)鉴定降解菌株的降解活性利用玉米生测法初筛出高活性的降解菌株，再利用高效液相色谱法确定高效菌株的降解率。2.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述步骤l)中的富集培养基的组成为蛋白胨8.0~10.Og,NaCl0.8~1.()g,KH具0.8~1.0g,CbH.i20,,1.0~2.Og,水1000ml,pH=6.0—7.2。3.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述步骤2)和4)中的选择性培养基的配方为NH,NO;0.5~1.Og,MgS04.7H200.5~0.8g，(NH4)2SO40.5~0.8g,KH2PO40.5~0.8g,NaCl0.5~0.8g,K風2.0~2.5g，FeCl;O.005~0.Olg,CaCl'0.01~0.02g，蒸馏水1000ml，pH=6.0~7.2。4.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述步骤3)中的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为牛肉膏2.5~5.0g,蛋白胨8.()~10.Og，NaCl2.5~5.0g，琼脂15.0~20.Og，水1000ml,pH=7.0~7.2。5.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述釆用节嘧磺隆时用少量甲醇助溶，并在灭菌后加入培养基中。6.—种按权利要求1所述的节嘧磺隆高效降解菌株降解活性的鉴定方法，其特征在于根据玉米生测实验主根长抑制率y_—节嘧磺隆浓度对数x的标准曲线y=aX+b,初步得出步骤4)中所得的以节嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株的降解活性，筛选出高活性菌株，而后利用高效液相色谱得出高效菌株的精确降解率。7.按权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于所述高效液相色谱的色谱条件为流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为60~80:20~40:0~0.5;流速为0.6~1.Oml/min;检测波长为230~260腿;柱温为28-3(TC;进样量为510jjl。全文摘要本发明涉及生物降解农药残留
技术领域：
，具体地说是一种苄嘧磺隆高效降解菌株的筛选及其降解活性的鉴定方法。具体为1)降解菌的富集驯化；2)分离筛选；3)复壮、纯化；4)验证降解菌；5)鉴定降解菌株的降解活性，通过玉米生测法初筛出高活性降解菌，再利用高效液相色谱法最终确定高效降解菌株的降解率。本发明提供的方法能够高效，廉价地筛选出以苄嘧磺隆为唯一碳源的高活性降解菌株，可以为降解菌剂的制备提供有效的菌种资源。文档编号C12Q1/04GK101328467SQ200710011800公开日2008年12月24日申请日期2007年6月20日优先权日2007年6月20日发明者张惠文,张成刚,张晓黎,旭李,苏振成申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所