专利名称：：三重荧光定量rt-pcr检测a、b和h5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种能够同时检测A型、B型和H5亚型流感病毒的三重荧光定量RT-PCR技术及其应用。
背景技术：
：禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一种烈性传染病，给养禽业造成巨大损失，我国农业部和国际兽医局都将其定为A类传染病。禽流感其病理变化因感染病毒毒抹毒力的强弱、病程长短和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒抹的毒力和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。自1878年禽流感在意大利爆发和流行到如今已有IOO多年的历史。禽流感已成为具有重要公共卫生意义的传染病，该病不仅具有发生突然、传播迅速、发病率高、致死率高等特点，而且禽流感病毒是几乎所有A型流感病毒的基因库，其自然宿主的广泛性及遗传变异给禽流感的及时定性诊断和预防带来很大困难。由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁，使得该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。以往认为禽流感病毒对人群无致病力，但1997年"香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷兰H7至2004年亚洲的H5均发生感染人，甚至导致人员死亡，死亡率约30%左右。其危害性比2003年的SARS还大、还难于预料。给整个国民经济和社会的发展造成了严重的影响。长期以来禽流感的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来相继建立的禽流感琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELAISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(RT-PCR),已经远远满足不了我国禽流感及呼吸道疾病的流行病学监测及现场诊断与防制的迫切需要。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国A卯liedBiosystems公司推出，是集PCR扩增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技术于一体的新兴技术，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，目前欧美、日本一些国家已广泛应用。荧光定量PCR技术的原理是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，具有普通的PCR扩增技术无法比拟的优点1、特异性高。因为只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5'-3，端的外切酶活性，将探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题。2、敏感度高。荧光PCR技术可检出极低拷贝数的核酸，使真正意义上的早期诊断成为现实。3、高通量、高效率。1~2小时可全自动同步完成近百个样品的扩增及^r测，且结果重现性好。4、无须凝胶电泳，采用全封闭反应管及光电传导系统，无管道内污染。5、可对DNA和RNA的PCR产物进行定量分析。近几年欧美、日本一些国家也进行RT-PCR和多重荧光定量PCR的研究。国内未见多重荧光定量PCR检测流感病毒文献报道。目前国内常用的快速检测方法为传统PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷，如传统PCR或半巢式-MPCR技术易出现假阳性、交叉污染、操作步骤多和费时。而多重荧光定量PCR具有的操作简单、可定量、污染少、检测速度快，同时检测出多个不同型及亚型流感病毒(A型、B型、H5亚型和H9亚型)。检出病毒的最小量为l(T5TCID50等优点越来越受学者的认同和研究。"多重荧光定量PCR快速检测流感人(禽)病毒和准确分型"，这一研究不仅在国内属于首次，而且在国际上也属于先进水平。在我国流感快速诊断研究方面仍停留在传统PCR或半巢式-MPCR技术中，这与我国作为流感多发地来说是极不相称，因此，研究开发多重荧光定量PCR检测流感病毒技术，为使我国的流感病毒快速诊断技术尽快的与国际接轨，适应当今快速前进社会的发展，确保人们的生命安全和国家的利益具有重要意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物、探针、检测试剂盒及方法，以使能够同时检测A型、B型和H5亚型流感病毒，而且操作简单、可定量、污染少、检测速度快。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案本发明三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物及探针，其DAN序列如下A型上游引物5，CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC,下游引物5，CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan^M十5，FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1;B型上游引物5，AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA,下游引物5'CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA,TaqMarU果4十5，CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2;H5亚型上游引物5，CCTTTACGACAAGGTCCGACT,下游引物5，CCACTTATTTCCTCTCTTTTTARTCTTGCTTC,TaqMan^罙4十5，ROX-ACGGAACGTATGACTACCCG-BHQ2。本发明三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，包含上述的所有？I物及探针。进一步，上述三重焚光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，其引物及探针和buffer、MgCl25mM、dNTPs各lmM装于一个容器内构成RT-PCR反应buffer,各引物的浓度均为5mM,A型探针的浓度为250nM,B型、H5型的探针的浓度均为200nM;还包括Tap酶、反转录酶、DEPC水、阳性对照和阴性对照。更进一步，上述三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒可以做成48人份试剂盒，该48人份试剂盒含有RT-PCR反应Buffer1mlTap酶12ul反转录酶12ulDEPC水1ml阳性对照1ml阴性对照1ml。上述试剂盒中的反转录酶为鼠源反转录酶(即M-MLVRtase)。试剂盒中的DEPC水，也即二乙基焦碳酸酯水或焦碳酸二乙酯水，采用行业内通用的DEPC水，是用DEPC处理过的水。利用上述引物和探针对A型、B型和H5流感病毒进行荧光定量RT-PCR的方法，过程包括利用所迷引物、探针建立RT-PCR反应体系，从待测标本中提取DNA或提取RNA,加入前述反应体系中，和在荧光定量PCR仪上设定反应条件，进行RT-PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于(1)利用所述引物、探针建立的50plRT-PCR反应体系包括:10倍反应緩沖液5^1,MgCl25mM,dNTPs各lmM,RNA酶抑制剂(Rnaseinhibiter)40U,反转录酶25U，Taq酶5U,A型流感病毒上、下游引物各0.5mM，B型流感病毒上、下游引物各O.5mM,H5亚型流感病毒上、下游引物各O.5mM,A型探针250nM，B型探针200nM，H5型探针200nM，A型、B型、H5亚型模板隨各2pl;(2)所述反应条件为48°C30分钟反转录后，95°CIO分钟热启动，然后进入45个PCR扩增循环，循环温度控制为95°C15秒后6(TC退火1分钟。与现有技术相比，本发明具有以下优点1、采用多重荧光定量RT-PCR，操作简单、可定量、污染少、检测速度快，能同时检测出A型、B型、H5亚型流感病毒，检出病毒的最小量达l(T5TCID50。2、技术效果好建立"多重荧光定量RT-PCR技术快速检测A型、B型和H5亚型流感病毒"的检测试剂盒，可在3-4小时内从被检测标本中，快速、准确、特异、安全、简便的鉴定出流感病毒的A型、B型和H5亚型。检出病毒的最小量分别为2.56X10—5,5.0X10-5,1.49X10—5个TCID50,可定量分析，比巢式RT-PCR灵敏度高、灵敏，而且不容易污染，而传统PCR或半巢式-MPCR检出病毒的最小量只有0.01-0.1TCID50。3、适用范围广非常的适用于目前各种呼吸道病毒疾病及流感、禽流感的检测和鉴别，同时也可检测被禽流感病毒污染，而病毒含量级少，一般方法不容易检测到的禽类产品和半成品。图1为A型、B型H5亚型流感病毒三重荧光RT-PCR检测图；图2为A型、B型H5亚型流感病毒三重荧光RT-PCR十倍稀释标准曲线图。具体实施例方式以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述。A、原理概述采用不同的荧光基团标记的A.B和H5亚型Tacpar^冢针，在经过三重PCR扩增后可以利用多通道荧光定量PCR仪器的多通道检测功能，同时对三种病毒进行荧光信号收集和分析。B、实施详情1、材料A型、B型和H5亚型流感病毒由本实验室培养保存；RNA提取试剂盒购自ROCHE公司；OneStepReal-timeRT-PCR购自大连宝生物公司；引物及相应TaqMan^笨4十均由本发明人设计，并由上海博亚公司合成；荧光定量PCR仪是Stratagene公司的MX4000型。2、方法2.1利用PrimerExpress软件分别设计针对A型、B型和H5亚型流感病毒保守序列的引物及其相应TaqMan探针。具体DNA序列如下A型上游引物5，CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC,下游引物5，CTACGCRGCAGTCCTCGCTC,TaqMan^果针5'FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1,扩增片段大小154bp;B型上游引物5，AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA,下游引物5，CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探4十5，CY5-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2，扩增片段大小170bp;H5亚型上游引物5，CCTTTACGACAAGGTCCGACT，下游引物5，CCACTTATTTCCTCTCTTTTTARTCTTGCTTC,TaqMan才果针5，ROX-ACGGAACGTATGACTACCCG-BHQ2,扩增片段大小174bp。2.2A型、B型和H5亚型荧光定量RT-PCR反应条件(引物、探针、酶、dNTP、Mg2+)的建立及优化。2.2.1取A型、B型和H5亚型流感病毒培养液各200^1，用ROCHE公司的RNA提取试剂盒分别提取总RNA,用ElutionBuffer溶解。2.2.2耳又大连宝生物7^司OneStepReal-timeRT-PCR试剂盒，50^1反应体系包括IO倍反应緩冲液5[xl,MgCl25mM,dNTPs各ImM(dNTPs包括了四种组分，每种组分的浓度为lmM),RNA酶抑制剂(Rnaseinhibiter)40U,M-MLVRtase25U，Taq酶5U,A型流感病毒上、下游引物各0.5mM,B型流感病毒上、下游引物各O.5mM,H5亚型流感病毒上、下游引物各O.5mM,A型探针250nM，B型探针200nM，H5型探针200nM，A型、B型、H5亚型模板RNA各2jlU。2.2.3FQ-PCR反应条件48°C3Q分钟反转录后，95°CIO分钟热启动，然后进入45个PCR扩增循环，循环温度控制为95°C15秒后6(TC退火1分钟。2.2.4灵敏度分析及标准曲线的建立取适当滴度的流感取A型、B型和H5亚型病毒培养液抽提RNA,然后将RNA进行10倍梯度稀释，最高稀释度为10—6。各浓度梯度MA同时进行荧光RT-PCR反应，由荧光定量PCR仪计算出标准曲线。2.2.5特异性检验取腺病毒，呼吸道合胞病毒，衣原体，支原体培养液200u1分别才是取RNA和DNA,4姿2.2,2反应体系进行Rea卜timeRT-PCR賴、验。2.2.6检验试剂盒的研发及推广将反应体系中相应的引物、探针、酶、dNTP、Mg"等分别按比例进行混合及包装，并在相关机构进行中试及推广。3、结果3.1取A型、B型和H5亚型流感病毒三重荧光RT-PCR检测灵敏度及标准曲线根据流感毒抹A,B和H5TCIDs。法的滴定结果，分别取2.56,5.0和1.49个TICDs。的病毒RNA,分别十倍梯度稀释，最大稀释度分别为2.56Xl(T5，5.0X10—5,1.49X1(T5。将相同稀释度A、B和H5病毒RNA混合加入同一个三重反应体系管中，焚光RT-PCR反应结果见图1和图2。从图1中可以看到在同一个检测反应体系中成功的检测到了FAM,CY5，ROX三个阳性荧光信号，说明三种不同的流感病毒A,B和H5的RNA在体系中被同时检测出来。体系中的三对51物和探针特异性的对各自的病毒RNA进行了良好的PCR扩增，相互之间没有发现明显的干扰现象。从图中可以看出，FAM,CY5,ROX三条荧光曲线的荧光值均有所不同，这可能是由于三种焚光基团本身的差异所造成。而且三条曲线的CT值均有所差异，这可能与三种病毒加入的RNA含量不一有关，也可能与这三种引物在同一条件下的反应效率不一致所导致。分别以A型、B型和H5亚型流感病毒的TCIDs。浓度为横坐标，以各自RT-PCT循环的CT值为纵坐标作图，可以得到三重荧光RT-PCR反应对A型、B型病毒进行相对定量的三条标准曲线，见图2。其中A型标准曲线的斜率为-3.062,扩增效率为112.1%，相关系数为1.000，;B型标准曲线的斜率为-3.142，扩增效率为108.1%,相关系数为0.998,其中H5亚型标准曲线的斜率为-3.238，扩增效率为103.6%,相关系数为0.999。三条标准曲线的相关系数R均大于0.998,斜率均在3.0-3.6之间，而且扩增效率也介于90%-110%之间说明整个扩增反应的线性关系相当好，扩增也相当充分。说明此三重反应体系相当稳定，能快速准确的对A型、B型和H5亚型流感病毒进行定性和定量检测。3.2对于用腺病毒，呼吸道合胞病毒，衣原体，支原体进行的检验中，均无阳性反应，说明此多重反应检验体系具有良好的特异性。3.3将上述反应体系中相应的引物、探针、酶、dNTP、Mg"等分别按比例进行混合(即将可以混合的成分都预先混合好)及包装，制成商品化的试剂盒，该试剂盒为48人份试剂盒，试剂盒的构成见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中的RT-PCR反应Buffer含有10xbuffer,MgCl25mM,dNTPs各ImM,A型上、下游引物各5mM,B型上、下游引物各5mM,H5亚型上、下游引物各5mM、A型才果4十250nM,B型、H5型纟笨针各250nM。上述48人份试剂盒只是一个实施例，实际应用中可以按上述反应体系中的比例做成其它规格的试剂盒，如100人份试剂盒等。本实施例中的反转录酶采用M-MLVRtase(即鼠源反转录酶)，也可以采用AMVRtase(即禽类成髓细胞性白血病病毒反转录酶)。核苷酸序列表<110>吴春利，程小雯<120>三重荧光定量RT-PCR检测A、B和H5亚型流感病毒的引物、探针、试剂盒及<160>9〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>23〈212〉DNA<213>Homosapiens<400>1cagagacttgaagatgtttttgc23〈210>2〈211〉20〈212〉DNA<213〉Homosapiens<400>2ctacgcrgcagtcctcgctc20<210〉3〈211〉24<212>DNA<213〉Homosapiens<400>3caagaccaatcctgtcacctctga24〈210〉4<211>26<212〉DNA<213>Homosapiens<400>4aaatacggtggattaaataaaagcaa26〈210>5〈211〉21<212〉DNA<213>Homosapiens<400〉5ccagcaatagctccgaagaaa21<210〉6〈211〉26<212>DNA<213>Homosapiens〈400〉6cacccatattgggcaatttctatggc26〈210〉7〈211>21〈212〉DNA〈213〉Homosapiens<400〉7cctttacgacaaggtccgact21<210〉8<211〉32〈212〉廳〈213>Homosapiens<400>8ccacttatttcctctctttttartcttgcttc32〈210〉9<211>20〈212〉腿<213〉Homosapiens<400>9acggaacgtatgactacccg20权利要求1、三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物及探针，其DAN序列如下A型上游引物5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，下游引物5’CTACGCRGCAGTCCTCGCTC，TaqMan探针5’FAM-CAAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-BHQ1；B型上游引物5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA，下游引物5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA，TaqMan探针5’CYS-CACCCATATTGGGCAATTTCTATGGC-BHQ2；H5亚型上游引物5’CCTTTACGACAAGGTCCGACT，下游引物5’CCACTTATTTCCTCTCTTTTTARTCTTGCTTC，TaqMan探针5’ROX-ACGGAACGTATGACTACCCG-BHQ2。2、三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于包含权利要求l所述的所有引物及探针。3、根据权利要求2所述的三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于所有引物及探针和buffer、MgCl25mM、dNTPs各lmM装于一个容器内构成RT-PCR反应buffer，各引物的浓度均为5mM,A型探针的浓度为250nM,B型、H5型的探针的浓度均为200nM;还包括Tap酶、反转录酶、DEPC水、阳性对照和阴性对照。4、根据权利要求3所述的三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒为48人份试剂盒，它含有RT-PCR反应Buffer1mlTap酶12ul反转录酶12ulDEPC水1ml阳性对照1ml阴性对照1ml。5、根据权利要求3或4所述的三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于所述反转录酶是鼠源反转录酶。6、利用权利要求1所述引物和探针对A型、B型和H5流感病毒进行荧光定量RT-PCR的方法，过程包括利用所述引物、探针建立RT-PCR反应体系，从待测标本中提取DNA或提取RNA，加入前述反应体系中，和在荧光定量PCR仪上设定反应条件，进行RT-PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于(1)利用所述引物、探针建立的50^1RT-PCR反应体系包括IO倍反应緩沖液5(il,MgCl25mM，dNTPs各ImM,RNA酶抑制剂40U,反转录酶25U，Taq酶5U，A型流感病毒上、下游引物各0.5mM,B型流感病毒上、下游引物各0.5mM，H5亚型流感病毒上、下游引物各0.5mM,A型探针250nM,B型4罙针200nM,H5型4罙针200nM，A型、B型、H5亚型才莫才反RNA各2^1;(2)所述反应条件为48°C30分钟反转录后，95°CIO分钟热启动，然后进入45个PCR扩增循环，循环温度控制为95°C15秒后6(TC退火1分钟。全文摘要本发明公开了一种三重荧光定量RT-PCR检测A型、B型和H5亚型流感病毒的引物及探针、含有该引物和探针的检测试剂盒、以及利用该引物和探针对A型、B型和H5流感病毒进行荧光定量RT-PCR的方法。试剂盒包括RT-PCR反应缓冲液、Taq酶、反转录酶、DEPC水、阳性对照、阴性对照。过程包括利用该引物、探针建立RT-PCR反应体系，从待测标本中提取DNA或RNA加入前述反应体系中，设定反应条件，进行RT-PCR扩增和荧光信号测定。它可在3-4小时内从被检测标本中，快速、准确、特异、安全、简便的鉴定出流感病毒的A型、B型和H5亚型，可定量分析，灵敏度高，不容易污染，且适用范围广。文档编号C12N15/11GK101363063SQ20071007558公开日2009年2月11日申请日期2007年8月10日优先权日2007年8月10日发明者吴春利,程小雯申请人:程小雯;吴春利