专利名称：一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法
技术领域：
本发明涉及γ-聚谷氨酸的生产领域，具体地涉及一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是谷氨酸单体之间以其α-氨基和γ-羧基缩合而成的一种高分子聚合物，聚合度一般大于30万。γ-PGA可由微生物合成、水溶性好、吸水性强、且生物可降解、对人体无毒害作用，因而被广泛用于食品、化妆品、水处理、农业和医药等领域。例如，γ-PGA是一种理想的药物载体，γ-PGA分子链上具有高活性的羧基(-COOH)，可与一些药物结合生成较稳定的复合物，该复合物在体内可被降解为内源性谷氨酸并释放出药物。又如γ-PGA的两次重复吸水可达到1108.4倍，比市售的聚丙烯酸盐类树脂高2.85倍，因此γ-PGA可用于制备高吸水树脂，该树脂对土壤改良、促进土壤中团粒结构的形成、增强土壤通透性和防止土壤侵蚀具有很好的作用。
国内外对于γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。目前，芽孢菌属微生物发酵生产γ-PGA产量低、生产成本高，所以未能实现大规模工业生产。
本发明利用诱变技术筛选得到一株γ-PGA的高产菌株，并优化其发酵工艺，提高γ-PGA的产量，有效降低了生产成本，实现了γ-PGA的工业化生产。
发明内容
(一)要解决的技术问题 本发明的目的是提供一株γ-PGA的高产菌株，本发明的又一目的是提供该菌株的培养方法及适用的培养基。
(二)技术方案 本发明通过物理诱变，筛选出一株高产γ-PGA的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)，该菌株已于2007年7月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2108。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的形态学特征为 菌体形态杆状，数个菌体可连成链状，在细胞生长后期生成芽孢； 菌落特征乳白色，培养24小时后菌落直径大小为0.3-0.8cm，表面凸起、有褶皱，挑起时有粘稠感。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养特征为 好氧，在有氧条件下才能生长，在γ-PGA的合成阶段要有充足的氧气。最适生长温度为37℃，最适pH为7，在菌体的生长期pH会降低到5-6，当γ-PGA开始合成时pH升高，可达到8以上。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的诱变筛选方法为挑取出发菌株CICC 10023(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶内，加30毫升无菌水，以170r/min的转数振荡20min，将菌落打散，制成菌悬液。将装有菌悬液的平皿置于磁力搅拌器上，用40瓦的紫光灯分别照射1min、2min、3min，然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10-5和10-3，涂发酵培养基固体平板，避光培养24小时，然后筛选出菌落形态特征发生改变的突变株。将初步筛选得到的菌株反复诱变多次，最终得到本发明所述的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No..2108。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养方法为 (1)菌种的活化接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108至斜面培养基，在28℃下培养48小时或在37℃下培养24小时； (2)种子培养在500ml灭菌的三角瓶内装100ml液体种子培养基，然后将活化的菌种接至种子培养基中，在37℃下、以215-220r/min的转数振荡培养24小时，制得种子液； (3)发酵培养以体积比3％的接种量将种子液接入发酵培养基中，37℃，215r-220r/min振荡培养48-60小时。
其中，所用到的培养基组成为 (1)斜面培养基葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，马铃薯200g/l(制法为将200g马铃薯去皮洗净，切成直径1厘米小块加水800ml，用500瓦的电炉煮沸20分钟，纱布过滤，再用去离子水补足至1000ml)，pH自然； (2)种子培养基葡萄糖20-30g/l，酵母膏5-7g/l，谷氨酸钠20-30g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l，pH＝7； (3)发酵培养基葡萄糖40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸钠40-60g/l，磷酸氢二钾2-6g/l，硫酸镁0.25g/l，pH＝7。
(三)有益效果 本发明提供的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNO.2108是由购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的纳豆芽孢杆菌CICC10023经紫外诱变所得，原纳豆芽孢杆菌CICC 10023发酵生产γ-PGA的产量为10.2g/l，经过反复诱变筛选后，目前的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC NO.2108的最高产量可达34.1g/l，较原菌株的产量有飞跃性的提高，且该菌株营养要求简单，传代稳定，高于目前报道的发酵生产γ-PGA的产量。
本发明所述的培养方法简便易行，所用培养基的原料来源广泛，价格低廉，有效降低了生产成本，适合大规模的工业化生产。
本发明所述的γ-PGA的高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)LX-3，该菌株已于2007年7月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2108。
具体实施例方式 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1γ-PGA高产菌株的诱变筛选 挑取出发菌株纳豆芽孢杆菌CICC 10023(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌250ml三角瓶内，加入30毫升无菌水，在HZQ-X100摇床(尔滨东联电子公司)上以170r/min的转数振荡20min，将菌落打碎，制成菌悬液。将装有30ml菌悬液的平皿置于78-1磁力搅拌器(国华电器公司)上，用40瓦紫光灯分别照射1min、2min、3min，然后将三个不同照射剂量的菌悬液分别制成10-5和10-3的稀释液，涂板(发酵培养基固体平板的配方见技术方案部分)，避光培养24小时，筛选出菌落形态特征发生改变的突变株。对上述突变体进行发酵检测，复筛高产菌株。
本发明依此方法诱变筛选得到高产突变体枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108。经传代试验证明，在100代以内其生产性能稳定。
实施例2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 (1)菌种活化挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，斜面培养基成分为马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，pH值自然。将接种后的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时。
(2)种子培养取活化好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108一环接于种子培养基中(500ml三角瓶放100ml培养液)，种子培养基成分为葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠20g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l。将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
(3)发酵培养将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml发酵液)，发酵培养基成分为甘油40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸钠40-60g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
(4)γ-PGA产量的测定取20ml发酵液放于500ml三角瓶中，加入已经在冰箱中放置过夜的冰无水乙醇40ml，震荡，直至有沉淀产生，将沉淀取出，放入50℃烘箱中烘烤12小时，取出称取重量。
检测结果用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为6.5g/l。
实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中，将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中。其中，发酵培养基成分为柠檬酸40-60g/l，其余组分同实施例2。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为8.2g/l。
实施例4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中，发酵培养基成分为葡萄糖40-60g/l，其余组分同实施例2。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为26.5g/l。检测结果说明用葡萄糖作为碳源的培养方法最终获得的γ-PGA产量高。
实施例5枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 (1)菌种活化挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，斜面培养基成分为马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，pH值自然。将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时。
(2)γ-PGA种子培养取活化好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环接于种子培养基中(500ml三角瓶放100ml培养液)，种子培养基成分为葡萄糖20g/l，酵母膏5g/l，谷氨酸钠20g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l。将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
(3)发酵培养将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml发酵液)，发酵培养基成分为葡萄糖50g/l，氯化铵5-9g/l，谷氨酸钠40g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
(4)γ-PGA产量的测定取20ml发酵液放于500ml三角瓶中，加入已经在冰箱中放置过夜的冰无水乙醇40ml，震荡，直至有沉淀产生，将沉淀取出，放入50℃烘箱中烘烤12小时，取出称取重量。
检测结果用氯化铵为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为10.2g/l。
实施例6枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中，将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中，发酵培养基成分为硫酸铵5-9g/l，其余组分同实施例5。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果用硫酸铵为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为12.2g/l。
实施例7枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上，将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中，将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中，发酵培养基成分为酵母膏5-9g/l，其余组分同实施例5。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果用酵母膏为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为26.5g/l。检测结果说明用酵母膏为氮源的方法最终获得的γ-PGA产量高。
实施例8枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测 将发酵培养基中磷酸氢二钾调为2-6g/l，培养基其余成分和发酵工艺同实施例7。
检测结果用提高磷酸氢二钾的培养基和培养方法发酵获得的γ-PGA产量为34.1g/l。
权利要求
1.一株产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108。
2.根据权利要求1所述菌株的培养方法为
(1)菌种的活化接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No._2108至斜面培养基，在28℃下培养48小时或在37℃下培养24小时；
(2)种子培养在500ml灭菌的三角瓶内装100ml液体种子培养基，然后将活化的菌种接至种子培养基中，在37℃下、以215-220r/min的转数振荡培养24小时，制得种子液；
(3)发酵培养以体积比3％的接种量将种子液接入发酵培养基中，37℃，215r-220r/min振荡培养48-60小时。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所用到的培养基组成为
(1)斜面培养基葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，马铃薯200g/l，pH自然；
(2)种子培养基葡萄糖20-30g/l，酵母膏5-7g/l，谷氨酸钠20-30g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.25g/l，pH＝7；
(3)发酵培养基葡萄糖40-60g/l，酵母膏5-9g/l，谷氨酸钠40-60g/l，磷酸氢二钾2-6g/l，硫酸镁0.25g/l，pH＝7。
全文摘要
本发明提供了一株γ-聚谷氨酸的高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108，本发明还提供了该菌株的培养方法及适用的培养基。本发明提供的产γ-聚谷氨酸的菌株营养要求简单，传代稳定，γ-聚谷氨酸的最高产量可达34.1g/l，而且培养方法简便易行，所用培养基的原料来源广泛，价格低廉，有效降低了生产成本，适合大规模的工业化生产。
文档编号C12P13/00GK101109010SQ200710130248
公开日2008年1月23日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者颖 李, 孟永宏, 孙杉杉 申请人:秦皇岛领先科技发展有限公司