专利名称：：重组鼻病毒载体的制作方法重组鼻病毒栽体
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：当一种新型流感病毒亚型出现而全人类对其没有或几乎没有免疫力时，就会出现流感大流行。20世纪期间，流感大流行造成全世界范围内上百万人死亡、社会混乱并造成严重的经济损失。研究流感的专家们认为可能还会发生流感，但却不知道什么时候会发生。全世界范围内在下一次大流行爆发时所做的准备工作的水平决定了这种疾病对公共健康和经济的影响。现在世界卫生组织(WHO)估计，在很短的时间内全球将会有至少几百万次门诊、2500多万次住院和几百万死亡。这个问题在2003年时尤其显著，当时在很多亚洲国家，家禽中禽H5N1病毒达到了兽疫流行水平，然后传播到欧洲和非洲。幸运的是，迄今这种病毒在人类中的传播已受到控制，记录有246次感染，其中死亡数高达144(世界卫生组织(WHO)网站，2006年9月14日)。传统的流感疫苗设计用于引发对流感病毒血凝素蛋白(HA)的中和抗体反应。由于HA蛋白中总是发生抗原漂移，所以必须每年改变疫苗组成以匹配预期的流通(circulating)病毒株。这种免疫方法对大流行而言是不可取的，因为大流行病毒林的分离和鉴定以及合适疫苗的构建和生产需要很长时间。控制或预防流感大流行的一种更有效的方法考虑构建"通用"疫苗，它能够引发对近来鉴定的高度保守性流感病毒免疫决定簇的保护性免疫。这种疫苗应该提供对A型流感病毒抹的广泛保护。此外，这种疫苗应该全年都能够生产，能够储存，和/或全年都能够给药。已证明流感基质蛋白M2是开发疫苗的有效靶标(DeFilette等，Virology337:149-161,2005)。M2是A型流感病毒的一种975个氨基酸组成的跨膜蛋白(Lamb等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A78:4170-4174，1981;Lamb等，Cell40:627-633,1985)。成熟的蛋白形成同源四聚体(Holsinger等，Virology183:32-43,1991;Sugme等，Virology180:617-624,1991),具有可被pH诱导的离子通道活性(Pinto等，Cell69:517-528，1992;Sugrue等，Virology180:617-624,1991)。M2四聚体在受感染细胞的质膜中高密度表达，同时也以较低的频率整合到成熟病毒颗粒膜中(Takeda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:14610-14617，2003;Zebedee等，J,Virol.62:2762-2772,1998)。在A型流感病毒中，M2N末端24个氨基酸的胞外域(M2e)高度保守(Fiers等，VirusRes.103:173-176,2004)。M2e与Ml(这种病毒中最保守的蛋白)(Ito等，J.Virol.65:5491-5498，1991)的遗传关系形成的限制以及天然感染期间缺少M2e特异性抗体(Black等，J.Gen.Virol.74(Pt.1):143-146，1993)可以解释M2e的高度保守性。如下文利用NCBI流感It据库(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cgi)的序列进行的比对所示，禽流感H5N1病毒的M2e似乎朝着典型的人H1、H2、和H3病毒中的共有序列进化，表明可能能够利用"人"流感M2e表位进行广谱性(免疫)保护，包括针对新型禽病毒的(免疫)保护人H1N1MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD人H5N12001-2006......................T..........E........S........人H5N11997-2000.....................LT….G.............S........禽H5N11983-1998.....................LT….G.............S........基于对分离自印尼和越南的人和鸟类的800个H5H1病毒林序列的分析，最近报道了H5N1M2e朝着H1N1M2e序列进化这一现象(Smith等，Virology350:258-268,2006)。用抗人M2e单克6隆抗体(Mab)成功地识别进化的禽M2e肽EVETPTRN，^f旦未识别其"前身"EVETLTRN(Liu等，Microbes.Infect.7:171-177，2005)。这一发现非常重要，因为之前已发现某些"禽流感样"变化会降低人M2e特异性Mab提供的保护的有效性。非常有趣的是，M2e中某些"禽流感样"氨基酸变化降低了人H1N1病毒在小鼠中的致病性(Zharikova等，J.Virol.79:6644-6654,2005)。WHO已强调，有可能在不同国家同时发生不同危险水平的流感大流行，2004年爆发的加拿大H7N3和亚洲的H5N1禽流感就是如此(http:〃www.who.int/en/)。如下面的比对所示，M2eH7N7与H5N1的"人源化，，变体仅相差一个氨基酸。已证明H7N7亚型能够在多物种之间传播(Koopmans等，Lancet363:587-593,2004)，并且对人类是致死性的(Fouchier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:1356-1361,2004)。已证明其他病毒林(H9N2)也能够感染家禽并传播到人类中(Cameron等，Virology278:36-41，2000;Li等,J.Virol.77:6988-6994,2003;Wong等，Chest129:156-168，2006)。人H1N1MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD家禽/马H7N7......................T.…G…E.......S.........家禽H9Nx1966-1996......................T....G...E..K...S.........家禽H9Nx1997-2004....................HT….G...........S.........人H9N21999-2003....................LT....G....E..K..S........已证明基于M2e的重组蛋白疫苗能够引发对同源和异源A型流感病毒攻击的保护性免疫反应(Fiers等，VimsRes.103:173-176,2004;Slepushkin等，Vaccine13:1399-1402,1995)。近来利用偶联于钥孔血蓝素和脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白的M2e肽进行的研究表明，M2e肽不仅能在小鼠中引发良好的免疫应答，而且也能够在雪貂和恒河猴中引发良好的免疫应答(Fan等，Vaccine22:2993-3003,2004)。最近发现脂质体M2e疫苗在小鼠中7具有针对Hl、H5、H6和H9A型流感病毒的保护作用(Fan等,Vaccine22:2993-3003，2004)。开发用于流感抗原的递送系统对于开发针对流感病毒感染的疫苗例如大流行流感疫苗非常重要。发明概迷本发明第一方面提供包含如本文所述的抗原例如流感病毒抗原(例如，M2e肽)的鼻病毒载体。所述载体可以是对人类无致病性的(例如，人鼻病毒14(HRV14))。所述抗原可以插入到本发明载体中，插入位点可以是选自中和免疫原I(Niml)、中和免疫原II(NimII)(例如，NimII的第158位氨基酸和160位氨基酸之间)、中和免疫原III(Nimin)、中和免疫原IV(NimIV)或其组合的中和免疫原的位点。所述抗原(例如，流感病毒抗原)任选在其一端或两端侧接接头序列。本发明的鼻病毒载体可以是活的或灭活的。本发明第二方面提供药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的鼻病毒载体和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。所述药物组合物任选可进一步包含佐剂(例如基于铝或几丁质的佐剂)和/或一种或多种其他活性成分(例如，与抗原序列例如M2e序列融合的乙肝病毒核心蛋白)。本发明第三方面提供一种在受试者(例如，所述受试者是人)中诱导对抗原(例如，流感病毒抗原)的免疫应答的方法，包括给予所述受试者本文所述的药物组合物。一个实施例中，所述受试者未患有感染，但有感染的风险，例如流感病毒感染。另一个实施例中，所述受试者被感染(例如流感病毒感染)，而所述载体可诱导对该感染的免疫。在多个实施例中，所述药物组合物鼻内给予所述受试者。本发明第四方面提供一种制备如本文所述的药物组合物的方法，包括将本文所述的鼻病毒载体和一种或多种药学上可接受的载8体或稀释剂混合。任选所述方法可包括加入佐剂、重建冻干的材料、和/或与其他活性成分混合。本发明第五方面提供一种核酸分子，该核酸分子编码或对应于本文所述的鼻病毒载体的基因组。本发明第六方面提供包含一种或多种异源抗原序列例如插入的流感病毒抗原序列(例如，M2e序列)的NimII肽。本发明第七方面提供一种生产如本文所述的鼻病毒载体的方法，所述鼻病毒载体包含抗原例如流感病毒抗原(例如，流感病毒M2e)。所述方法可包括以下步骤(i)产生基于感染性cDNA克隆的重组鼻病毒载体文库，所述感染性cDNA克隆含有插入的抗原序列(例如，流感病毒抗原序列)，(ii)从文库中选择符合以下条件的重组病毒(a)传代后能保留插入序列，和(b)能被针对插入序列的抗体中和。这些方法的一个实施例中，所述鼻病毒载体是人鼻病毒14(HRV14)。其他实施例中，所述插入的抗原序列的插入位置选自Niml、NimII、NimIII和NimIV。如本文所述，插入的抗原序列任选在其一端或两端侧接随机接头序列。本发明第八方面l是供一种培养含有插入的抗原(例如，流感病毒抗原)序列的鼻病毒载体的方法。这些方法包括在HeLa或MRC-5细胞中传代所述载体。本发明提供几种益处。例如，利用活的载体系统递送抗原如M2e有以下优势，包括(i)仅单剂疫苗即可引发非常强烈和持久的抗体应答，(ii)与亚单位或灭活疫苗相比，更容易扩大生产(即，成本较低的情况下可获得更多剂量)。因此，在发生大流行的情况下，活疫苗在较短时期内能够免疫接种的人数要多得多。此外，本发明的HRV载体可鼻内递送，因此既可引发全身性的免疫应答，也可引发粘膜免疫应答。使用HRV14提供了另外的优势，因为该病毒对人无致病性，并且很少在人群体中发现该病毒(Andries等，J.Virol.64:1117-1123,1990;Lee等，Virus9Genes9:177-181,1995)，这减少了在疫苗接受者中预先存在抗载体免疫力的可能性。另外，感染人类所需的HRV的量非常小(1个组织培养物感染剂量(TCID5Q)(Savolainen-Kopra,"人鼻病毒的分子流行病学(MolecularEpidemiologyofHumanRhinoviruses),，，国家公共健康研究院出版物，2/2006,Helsinki,芬兰，2006))，这对于基于HRV的疫苗生产成本有效性而言是有利的。根据下文的发明详述、附图和权利要求，很容易发现本发明的其他特点和益处。附图简述图1图示了HRV14的病毒颗粒(上栏)和基因组(下栏)。人鼻病毒14(HRV14)衣壳具有假-T=3(P-3)二十面体(isochedral)对称性，由60个拷贝的病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP4蛋白位于RNA-衣壳界面处(Rossmann等，Nature317:145-153,1985)。VP1-3蛋白形成一个峡谷，包含细胞受体(细胞内粘连分子l(ICAM-l))的受体结合位点(Cokmno等，J.Virol.63:36-42，1989)。在所述峡谷边缘的表面鉴定到三种主要的中和免疫原性(Nim)位点NimI(AB)、NimII和NimIII,它们是中和抗体的结合位点(Sherry等，J.Virol.57:246-257,1986)。在嵌合体(Chimera)程序中基于HRV14的晶体结构与Niml特异性抗体mAbl7(蛋白质数据库弁lRVF)进行HRV14颗粒的重建。图2如下所述(A)本研究中制备的HRV14-M2e构建物。使用HRV14cDNA克隆的衍生物即质粒pWRl构建M2e-插入突变体。(B)HRV14-NimlI-XXX17AA和HRV14-NimlI-XXX23AA病毒文库以及衍生自pWRl的野生型HRV14产生的噬斑。如本文所述和其他数据(图3和4)所支持的，构建物#1不产生噬斑，表明随机接头策略是在HRV中工程化新表位的有效手段。图3显示M2e插入物在不同的HRV14-M2e构建物中的稳定10性。用引物对Pl-upl00Fw、VPl-dwn200Rv(绿色)或14FAfllI-1730Rv(红色)对含插入物的片段进行RT-PCR,分别产生"PCRB"(绿色)或"PCRA"(红色)DNA片段。用Xhol消化这些片段。示出了第2、3、4代HRV14-M2e嵌合体和第4代HRV14-NimlI-XXX17AA、HRV14-NimlI-XXX17AA病毒文库的琼脂糖凝胶电泳结果。两个酶切片段(箭头所示)代表含有插入物的病毒。图4显示NimII位点处23个氨基酸的M2e插入物可能给HRV14受体结合域带来的空间干扰。如图中所示，没有接头的插入物可以乂人NimII位点伸出，几乎伸到山夹谷结构的对面一边(即Niml位点处)。该障碍能够有效地阻碍受体进入到峡谷结构中。N末端接头能够改变该插入物的位置(箭头示出了方向)，打开通4主山夹谷的通3各。用AccelrysDiscoveryStudio4欠i"牛(AccelrysSoftware,Inc)创建HRV14-NimlI-M2e(23AA)的VP1-VP4亚基的分子模型。这表明我们能够根据现有的结构数据和建模软件将新表位工程化到HRV14中。图5显示HRV14、HRV14-NimlI-XXX23AA文库和HRV14-NimlI-XXX17AA文库与抗-M2eMab14C2(Abcam，Inc;Cat#ab5416)的噬斑减少中和测验(PRNT)的结果。结果证明，两种文库均有效中和，但载体病毒(HRV14)不能中和。从结果中也可明显看出两种文库的纯度(没有野生型污染)。图6显示在攻击之前经免疫小鼠中的M2e特异性IgG抗体免疫应答(合并的样本)。终点效{介(Endpointtiter)(ET)显示在相关组标题之后。括号中显示相应免疫接种的时间(d0和d21分别表示第0天和第21天)。图7显示在攻击之前经免疫小鼠中的HRV14特异性IgG抗体免疫应答(合并的样本)。(A)-用1、2或3剂量的HRV14-M2e(17AA)病毒免疫的组；(B)-用1或2剂量的亲代iiHRV14病毒免疫的组。图8显示经免疫的小鼠中各自的M2e特异性IgG抗体免疫应合。图9显示根据表4所述进行免疫接种的小鼠中M2e特异性抗体同种型IgGl和IgG2a:(A)IgGlELISA(组中合并样本)；(B)IgG2aELISA(组中合并样本)；(C)图9A和9B的标题；(D)第4组(红色；第1和第3组数据)和第7组(绿色；第2和第4组数据)小鼠中各血清样本(稀释度1:2,700)的M2-e-特异性IgGl(圆点)和IgGh(菱形)的水平(见表4)。图10显示根据表4所述免疫接种的小鼠中M2e特异性抗体的IgG2a同种型。(A)用1VQe肽(组中合并样本)进行ELISA;(B)检测ELISA中第4组(红色；第1组数据)和第7组(绿色；第2组数据)小鼠中的各血清样本(稀释度1:2,700)抗M2e特异性肽的情况(见表4)。图11显示根据表4所述免疫接种的小鼠中M2e特异性抗体的IgG2a同种型(上栏)。图12显示用A型流感病毒抹PR8攻击后28天所有组的存活率。图13显示用A型流感病毒4朱PR8攻击后28天所有组的发病率(图13A);第4组(图13B)和第7组(图13C)的各小鼠体重。图14显示在攻击之前经免疫小鼠中的M2e特异性IgG抗体免疫应答(合并的样本)(对组而言见表5)。图15显示用A型流感病毒抹PR8非致死攻击后17天中所有组的发病率(体重的百分数)。图16显示HRV14和HRV6与小鼠抗-HRV14-NimlvHRv6血清的噬斑减少中和测验(PRNT)结果。这些数据证明了NimIVHRV6在HRV14衣壳背景中的免疫显性，提示了可用于插入外源表位的新位点。12图17显示了Balb/c小鼠中针对流感病毒致死性鼻内攻击的保护A)攻击后存活百分数，B)攻击后体重减轻。图18图示了HRV14病毒粒子蛋白中的插入位点。可将M2e引入到NimI、NimII、NimIII和NimIV中的指定位点。XXXM2e代表本文所述的M2e文库。图19图示HRV14的结构性区域，示出了根据本发明制备的两种嵌合体中所用的VP2中NimII内的插入位点。还提供了这些嵌合体HRV14-M2e(17AA)和HRV14-M2e(23AA)的核苷酸序列。发明详述本发明提供一种通用的(universal)(大流行)流感疫苗，该疫苗利用人鼻病毒(HRV)作为载体进行通用流感病毒决定簇的有效递送和呈递。如下文进一步描述的，4艮据本发明，流感病毒基质蛋白2(M2e)的胞外域是一种"通用"表位，可包含在通用流感(A型流感)疫苗中。该方法提供了一种有效的流感大流行疫苗，可鼻内给予该疫苗以诱导局部粘膜免疫。图9图示了根据本发明的两种疫苗实例HRV14-M2e(17AA)和HRV14-M2e(23AA)，还示出了这些病毒的核苷酸序列。这些疫苗是通用流感疫苗候选物的实例。例如根据这些信息，本领域技术人员可构建包含如这些实例所示的M2e序列或其他流感表位的疫苗候选物。如下文进一步描述的，也可构建基于其他非流感表位的疫苗候选物。下文进一步描述了本发明的载体、疫苗組合物和方法。HRV栽体本发明的载体基于人鼻病毒，例如非致病血清型人鼻病毒14(HRV14)。图1图示了HRV14病毒颗粒和基因组结构，示出了病毒结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和非结构蛋白(P2-A、P2-B、P-2C、P3-A、3B(VPg)、3C和3D)以及HRV14中主要中13和免疫原位点(Nims:Niml、NimII、NimIII和NimIV)的位置。可用于本发明的一种示例性HRV14分子克隆是pWR3.26(美国典型培养物保藏中心ATCC⑧号VRMC-7TM)。下文进一步描述了该克隆，Lee等，J.Virology67(4):2110-2122,1993(也可参见序列附录3)也详细描述了该克隆。HRV14的其他来源也可用于本发明(例如，ATCC登录号VR284;也可参见GenBank登录号L05355和K02121;Stanway等，NucleicAcidsRes.12(20):7859隱7875,1984;Callahan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(3):732國736，1985)。除HRV14之外，其他人鼻病毒血清型也可用于本发明。本领域已知100多种人鼻病毒血清型，所有这些血清型均可通过与HRV14同样的方式衍生感染性克隆以用于本发明。虽然本文参考HRV14进行描述，但本发明也适用于其他鼻病毒血清型。根据本发明，可将抗原序列插入HRV载体，如下文所述，可插入不同位点。一个实施例中，所述序列插入到一种血清型例如HRV14的NimII位点。NimII(中和免疫原II)是HRV14中的一个免疫显性区域，包括VP1的第210位氨基酸和VP2的第156、158、159、161和162位氨基酸(Savolainen-Kopra,"人鼻病毒的分子流行病学(MolecularEpidemiologyofHumanRhinoviruses)，，，国家公共健康研究院出版物，2/2006,Helsinki,芬兰，2006))。在下文描述的一个具体实施例中，所述序列插入到VP2的第158和160位氨基酸之间。也可在NimII表位的其他位点插入。例如，可在VP2的第156、158、159、161或162位、VP1第210位或它们的组合中的任意位置插入。可插入的其他位点(单独或与其他位点(例如NimII位点)的插入组合)包括NimI(A和B)、NimIII和NimIV。因此，例如可在以下位置插入VP1的第91和/或95位(NimIA)、VP1的第83、85、138和/或139(NimlB)、和/或VP1的第287位(NimIII)14(参见，例如图18)。NimIV是VP1的羧基末端区，该区包含的序歹'J代表HRV14VP1的第274-289位氨基酸NTEPVIKKRKGDIKSY。该区域内任何氨基酸之间的插入均包括在本发明范围内。因此，本发明包括例如在以下氨基酸之间的插入274和275;275和276;276和277;277和278;278和279;279和280;280和281;281和282;282和283;283和284;284和285;285和286;286和287;287和288;以及288和289。除这些插入外，本发明包括该区域中一个或多个(例如，3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸被删除的插入。因此，例如，本发明包括在以下氨基酸之间的插入274和276;275和277;276和278;277和279;278和280;279和281;280和282;281和283;282和284;283和285;284和286;285和287;286和288j287和289;288和290;以及289和291。使用分子生物学中的标准方法构建本发明的载体，下文以在HRV14的NimII中包含插入的载体为例解释构建过程。此外，如下文进一步描述的，本发明的载体可以活病毒形式给药，或在给药之前用福尔马林灭活或紫外线处理灭活，灭活方法都是本领域技术人员已知的。所述载体任选在氨基端和/或羧基端包含HRV载体序列和插入的流感病毒序列之间的接头序列。这些接头序列可用于为插入的序列提供柔性，使插入的序列能够以引发免疫应答的方式呈递插入的表位。下文提供了此类接头序列的例子。可用例如本文所述的本发明文库筛选方法来鉴定与特定插入物一起使用的接头序列。简言之，在该方法中，构建的文库在适于鉴定有效的接头序列的区域中有随机序列。4企测文库产生的病毒的活力和插入序列的免疫原性以鉴定有效接头。外源肽15本发明的病毒载体可用来传递任何具有预防或治疗价值的肽或蛋白。例如，本发明的载体可用来诱导针对插入到HRV蛋白中的任何基于蛋白的抗原的免疫应答(预防性或治疗性)。本发明的载体可各自包括单个表位。或者，可以将多个表位插入到所述载体的单个位点(即作为多表位，其中不同的表位可以被一个柔性的接头隔开，诸如氨基酸的一个多聚甘氨酸延伸)或不同位点(例如不同的Nim位点)或其任何组合。所述不同的表位可来源于一种病原体，或者可来源于不同的种和/或不同的属。所述载体可包含多个肽，例如，例如本文所述肽的多个拷贝或本文所述肽的组合。作为例子，所述载体可包含人和禽M2e肽(和/或其共有序列)。可用于本发明的抗原可来源于如病毒、细菌和寄生虫等感染性因子。此类感染性因子的一个具体例子是流感病毒，包括感染人的流感病毒(例如A、B和C病毒抹)和禽流感病毒。来源于流感病毒的抗原的例子包括衍生自以下物质的抗原M2、血凝素(HA;例如，Hl-H16中任何一个或其亚基)(或HA亚基HA1和HA2)、神经氨酸酶(NA;例如，Nl-N9中任何一个)、Ml、核蛋白(NP)和B蛋白。可包含在本发明载体中的其他序列是流感病毒M2e序列。说明书全文和序列附录1中提供了此类序列的例子。此类序列的具体例子包括MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;MSIXTEVETPTRNEWECRCSDSSD;MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD;EVETPTRN;SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;和SLLTEVETPIRNEWGCR。可用于本发明的其他M2e序列包括来自B型流感病毒BM2蛋白的胞外域的序列(共有序列MLEPFQ)和来自H5N1禽流感16病毒的M2e肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD)。包含在本发明载体中的肽可包括如上所述的完整序列，或者包括能诱导所需免疫应答的表位的片段。这些片段可包括这些肽中的例如2-20、3-18、4-15、5-12或6-10个氨基酸的片段。另夕卜，这些肽中还可包含另外的氨基和/或羧基末端氨基酸序列。因此，这些肽可包括例如1-10、2-9、3-8、4-7或5-6个此类氨基酸，这些氨基酸可以是天然存在的、连续序列或是人工接头(参见下文)。以上所述序列的所有可能的肽片段都包括在本发明内。流感病毒中的其他保守性肽也可用于本发明，包括B型流感病毒的NBe肽(共有序歹'JMNNATFNYTNVNPISHIRGS)。可用于本发明的流感病毒肽的其他例子以及可衍生这些肽的蛋白(例如通过片段化)描述于以下文献US2002/0165176、US2003/0175290、US2004/0055024、US2004/0116664、US2004/0219170、US2004/0223976、US2005/0042229、US2005/0003349、US2005/0009008、US2005/0186621、美国专利号4,752,473、美国专利号5,374,717、U.S.6,169,175、美国专利号6,720,409、美国专利号6,750,325、美国专利号6,872,395、WO93/15763、WO94/06468、WO94/17826、WO96/10631、WO99/07839、WO99/58658、WO02/14478、WO2003/102165、WO2004/053091、WO2005/055957,和序列附录1和附录2(包括其中引用的文献)，这些文献的内容均通过参考纳入本文。另夕卜，可,人www.immuneepitope.org凄丈寺居库中选择流感病毒的保守性免疫原性/保护性T细胞和B细胞表位，最近从该数据库中已筛选到很多很有前景的交叉保护表位(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A104:246-251,2007，及其增补表)。本发明可利用线上IEDB资源中的任何肽，例如包括如上所述Bui等描述的保守性B细胞表位和T细胞表位的流感病毒表位。本发明载体中还可包含来自其他人/兽病原体的保护性表位，所述病原体例如寄生虫(例如，疟疾)、其他致病性病毒(例如，人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱瘆病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV;例如，gag)、丙肝病毒(HCV))、以及细菌(例如，结核分枝杆菌(Af7c06a"er^w&6en^/cw\s)、？艮难冲炎状芽孢杆菌(C/oWn'A'Mmc^j^'"7e)禾口幽门螺牙干菌(Z/e〃coZa"erp少/on')。文献中很容易找到这些以及其他一些病原体的各种合适表位。例如，Schiller及其同事从乳头瘤病毒L2蛋白中鉴定到的交叉保护性表位/肽，该交叉保护性表位/肽诱导的广谱交叉-中和抗体能够提供针对不同HPV基因型的保护，所述表位/肽例如HPV16病毒L2蛋白的第1-88位、1-200位或17-36位的氨基酸(WO2006/083984Al;QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV)。可用于本发明中的其他病原体以及这些病原体中的抗原和表位的例子可参见WO2004/053091、WO03/102165、WO02/14478和US2003/0185854，这些文献的内容均通过参考纳入本文。下表1列出了可从中得到抗原的其他病原体的例子，这些抗原的具体例子包括下表2列出的抗原。此外，表3提供了可插入本发明载体中的表位的具体例子。如表3所示，用于本发明载体的表位可以是B细胞表位(即中和表位)或T细胞表位(即T辅助细胞和细胞毒性T细胞特异性表位)。例如，本发明的载体可用来传递肿瘤相关抗原，以用于抗癌免疫疗法。本领域已知许多胂瘤相关抗原，并且可将其根据本发明给药。癌症(和相应的肿瘤相关抗原)的实例如下黑素瘤(NY-ESO-l蛋白(准确地讲是位于氨基酸位置157-165的CTL表位)、CAMEL、MART1、gp100、酪氨酸相关蛋白TRP1和2、和MUC1));腺癌(ErbB2蛋白)；结肠直肠癌(17-1A、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌(PSA1和PSA3)。热激蛋白(hspllO)也可用作这样的抗原。在本发明的另一个实施方案中，可以使用编码需要对其产生18免疫应答的诱导变态反应的抗原表位的外源蛋白。另外，本发明的载体可包括用于靶向所述载体的配体，以将诸如抗原的肽传递至接受所述载体给药的受治疗者的特定细胞(例如包括所述配体的受体的细胞)。本发明载体中所插入的肽或蛋白大小的长度范围可以例如为3-1000个氨基酸，例如5-500个、IO-IOO个、20-55个、25陽45个或35-40个氨基酸，本领域技术人员可确定合适的长度。因此，长度为10-25、12-22或15-20个氨基酸的肽可用于本发明。此外，本文所述的肽可包括其他序列或可缩短其长度，本领域技术人员能够合适地确定。本文所述的肽可以是本文所述的本发明载体形式，或者可以经过修饰，例如通过替代或删除一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多氨基酸)。此外，所述肽存在于载体中时可以是在更大的肽内。如上所述，任选所述肽例如上述肽或本文所述的其他肽在氨基末端和/或羧基末端包含其他序列，这些序列可以是与所述肽序列天然相连的(即所述序列与所述肽在流感病毒(或其他来源)基因组中是毗连的)，或者不是天然相连的(例如合成的接头序列)。因此所述肽可在一个末端或两个末端含有1-25、2-20、3-15、4-10或4-8个氨基酸的序列。作为一个具体的例子，所述肽可在氨基末端和/或羧基末端含有l-3个接头序列。给药当用于免疫方法时，可以将本发明载体作为一级预防药给予有感染特定病原体危险的成人或儿童。所述载体也可以用作二级受感染患者。当进行抗癌免疫时，可将疫苗给予有患癌风险或已罹患癌症的受试者。对于疫苗应用，可以任选使用本领域技术人员已知的佐剂。19根据给药途径选择佐剂。对于鼻内给药，可用几丁质微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等，MicrobesandInfection8:2706-2714,2006;Ozdemir等，ClinicalandExperimentalAllergy36:960-968，2006;Strong等，ClinicalandExperimentalAllergy32:1794-1800,2002)。适用于通过粘膜途径(例如鼻内或口腔途径)给药的其他佐剂包括大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)及其突变衍生物。对于灭活的病毒而言，可用胃肠外佐剂，包括例如铝化合物(例如，氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷酸铝化合物)、脂质体制剂、合成佐剂例如(例如，QS21),胞壁酰二肽、单磷酸类脂A或聚磷腈。此外，可将具有佐剂活性的编码细胞因子的基因插入本发明载体中。因此，可将编码细胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因与外源抗原基因一起插入以产生具有增强的免疫应答的疫苗，或调节所针对的免疫性使其更特异于细胞免疫应答、体液免疫应答或粘膜免疫应答。或者，可通过公知方法(例如直接接种、棵DNA、在病毒载体中递送等)独立于重组疫苗病毒、与重组疫苗同时或按顺序递送细胞因子。本发明的病毒可与其他免疫接种方法組合使用。例如，本发明的病毒可与含有相同或不同抗原的亚单位疫苗组合给药。本发明的组合方法可包括本发明的病毒与所述抗原的其他形式(例如，亚单位形式或包含乙肝病毒核心蛋白的递送载体(例如大肠杆菌产生的表面上含有M2e的乙肝病毒核心蛋白(HBc-M2e;Fiers等，VimsRes.103:173-176,2004;WO2005/055957;US2003/0138769Al;US2004/0146524A1;US2007/0036826Al)),或灭活的完整病毒或部分病毒)共同给药(co-administration)。或者，本发明载体可与其他方式(例如亚单位或HBc方式)以引发-加强策略组合使用，其中本发明的载体或所述其他方式用于引发免疫应答，然后使用所述其他方式加强免疫，或相反。另外，本发明包括本发明载体既用作引发剂又用作加强剂的引发-加强20策略。因此，这些方法可包括先给予本发明载体，之后一周或多周、一月或多月、一年或多年再进行后续的一次或多次(例如，1、2、3或4次)给药。可用标准方法将本发明载体给予受试者例如哺乳动物(例如人)。鼻内给药时，可以鼻内滴剂形式给药或通过吸入气溶胶或喷雾制剂给药。病毒可以是冻干形式或溶解在生理相容性溶液或緩冲液例如盐水或水中。可使用例如《雷明顿药物科学(第18版)》，A.Gennaro主编,1990,MackPublishingCompany,Eastern,PA中所述的标准生产和制剂方法。另外，本领域技术人员容易确定合适的剂量和给药方案。本发明载体可以活疫苗或灭活疫苗形式给予受试者例如人。可用本领域技术人员已知方法鼻内给予活疫苗(参见，例如，Griinberg等，Am.J.Respir.Crit.Car.Med.156:609-616，1997)。本领域技术人员容易确定合适的剂量和给药方案。例如剂量可以是103-10spfu/剂。有利地，可以单剂形式给予疫苗，但如果本领域技术人员认为需要的话也可进行加强免疫。至于灭活疫苗，可用例如福尔马林或UV处理杀死病毒，以108pfu/剂的剂量鼻内给药，任选与合适的佐剂(例如几丁质或突变体LT;见上文)一起给药。这些方法中，给予多于一剂(例如2-3剂)可能是有利的。本发明部分地基于以下实施例。实验实施例I.HRV14-NimlI-M2e嵌合体的构建我们已构建了HRV14Nimll-M2e重组病毒。抗M2e单克隆抗体能够中和该重组病毒的感染性，因此证明该病毒在病毒粒子表面上表达M2e。构建了三种类型的HRV14-M2e构建物(图2)。1.在VP2的第159位和160位氨基酸(NimII位点)之间插入携带M2e的23AA的HRV14-NimlI-23AA;2.HRV14-NimlI-XXX23AA文库。这组构建物(质粒文库)类似于第一构建物，但肽上融合有3-AA的随机N末端接头。用5，(直接(direct)引物(含有编码接头氨基酸的9个随机核普酸)在M2e序列旁产生随机接头；3.HRV14-NimlI-XXX17AA文库。用与第一构建物相同的方式构建该文库，但该文库含有缩短的M2e肽，该肽只含有M2e的开头17个氨基酸。为有利于向HRV14感染性克隆中进行克隆，我们通过将pWR3.26感染性克隆的pUC质粒主链替换为pEt载体的(Novagen)从而对pWR3,26进行了修饰。产生的质粒pWRl(图2)能够在大肠杆菌中更稳定地维持并更易于操作。病毒文库#2和弁3的噬斑形态与HRV14亲本的不同(图2B)。这些文库的噬斑大小似乎与野生型相似，但噬斑不透明。构建物#1转染时不形成为监测所构建病毒的遗传稳定性，我们通过沉默突变在M2e序列中部插入了Xhol酶切位点。从含有突变M2e基因的病毒中获得的RT-PCR片段被Xhol酶切，但野生型HRV14上产生的相应DNA产物未一皮消化(图3)。HRV14-NimlI-23AA嵌合构建物(弁1)产生有活力但相当不稳定的病毒。如图3所示，仅在第2代检测到"PCRA"片段的两个Xhol消化产物，以后各代未检测到。相反，文库(#2)和(#3)稳定保留了M2e插入物HlHeLa细胞中的第4代病毒文库中获得的"PCRB"片段被Xhol完全消化(图3)。构建物#1的不稳定性可能是由于插入的肽与受体结合域的空间干扰造成的(图4)，在构建物#2和#3中，简并接头的存在可能削弱了这种空间干扰。随机的N末端接头可能已经改变了肽的方向，使其离开含有受体结合域的峡谷，从而使病毒有效结合到其受体(图4)。22我们用抗M2e单克隆抗体(14C2MAb,Abeam,Inc.Cat#ab5416)进行了病毒文库的中和试验。病毒中和试验也可用作检验文库纯度(即，不存在野生型HRV14)的工具。噬斑减少中和测验(PRNT)的结果证明Mab14C2对两个文库均具有极高的特异性和中和能力(图5)。即使对于最低的单克隆抗体稀释度1:10,两个文库均极易被抗M2e单克隆抗体中和(图5),而对照病毒(pWRl)未被中和。约1:2,000,000的抗体稀释度(14C2的储液浓度是1mg/ml)时，两个文库均观察到50%的中和。这种对重组病毒的高效中和表明，HRV14的NimII中呈递的M2e肽具有合适的构象，易于^皮抗体识别。II.鉴定稳定的HRV14-NimlI-M2e重组子在HlHeLa细胞中传代4代之后，各文库中选择6个单独的克隆进行p蓝斑纯化，再过4代之后，对携带的插入物测序进行鉴定。各文库产生一个显性和稳定复制的病毒克隆。分离自HRV14-NimII-XXX23AA文库的所有病毒均具有相同的插入序列GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSD，GHT作为N末端接头，而分离自HRV14-NimlI-XXX17AA文库的所有病毒具有相同的序列QPASLLTEVETPIRNEWGSR,QPA作为N末端接头。携带23AA插入物的所有活克隆在第7位氨基酸处具有酪氨酸至赖氨酸的取代(在M2e外源插入物中是第4位)。携带17AA插入物的克隆均含有野生型M2e序列。这些结果表明可分离到遗传稳定的重组HRV-M2e病毒。在进一步的体内研究中，用腹膜内给药途径评估HRV14-M2e(17AA)提供针对A型流感病毒株PR8的保护的可能性。III.HRV14-NimlI-M2e重组子的体内研究23A.体内试验#1:腹膜内免疫接种1.试-验i殳计第0天，用在500pL体积中与100pg佐剂(氢氧化铝)混合的蔗糖纯化的HRV14-M2e(17AA;参见表4的注脚(4))病毒(5.0xl06pfu的HRV14-M2e(17AA)，1.3x107pfu的亲本HRV14,或作为阴性对照的模拟物(mock)(PBS)通过腹膜内途径免疫引发9周龄雌性Balb/c小鼠(8只小鼠/组)，第21天加强免疫。作为黄金标准，使用了现在是疫苗候选物的ACAM-FluA(带有3个M2e拷贝的重组乙肝病毒核心颗粒)。后者单独或与HRV14-M2e或HRV14联合用于引发/加强免疫(表4)。为了验证免疫接种所提供的保护，第35天用4LD5Q的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒攻击所有的小鼠。监测发病率和致死率21天。为了检测针对所携带肽的小鼠血清抗体，免疫接种前(基线)和第33天分别取血。用涂覆有合成的M2e肽的微量滴定板进行规定的ELISA试验，测定血清中M2e特异性抗体的效价。测定了M2e特异性总IgG、Ig2a和Ig2b的效价。2.结果a.免疫原性i.免疫接种动物中的总IgG用合并的血清样本(图6)以及单独的动物样本(图7)冲企测了各组中M2e特异性抗体的效价。合并样本的结果(图6)显示，用携带17AAM2e的重组HRV14引发并用ACAM-FluA加强免疫与用两剂量的乙肝病毒核心蛋白-M2e重组病毒样颗粒(IO(xg/剂)引发的抗体水平相同(终点效价(ET)-218,700)。用ACAM-FluA加强免疫时，用HRV14-M2e(17AA)(组4;ET=218，700)比用HRV14载体(组6;ET-2，700)引发产生的M2-e特异性免疫应答高约100倍。因此，HRV14-M2e的引发作用仅依赖于M2e插入24物而不依赖于载体。基于Arnold等，2006(Arnold,G.F.和Arnold,E.嵌合病毒疫苗(ChimericVimsVaccine).11/176,182[US2006/0088549Al],1-57.4-27-2006.US.7-7-2005)的假设，109pfuHRV14的免疫接种剂量约相当于10pg蛋白。我们粗略地估计，l免疫接种剂量的重组HRV-M2e病毒相当于10ng蛋白。考虑到分子量和重组乙肝病毒核心颗粒中亚基数目的多重性，我们推测l免疫接种剂量的HBc-M2e比HRV-M2e含有的M2e蛋白约多10,000倍。用HRV载体获得的相当的抗体水平可能能够用较低价的生产方法提供更具免疫原性的呈递系统。M2e抗体水平与HRV14-M2e(17AA)的剂量数目成反比。实际上，3剂HRV14-M2e(17AA)病毒(组l)引起了最低的M2-e特异性应答(ET二2.700),而2剂方案引起的应答高IO倍(组2;ET=24,300)，1剂比2剂高3倍(组5;ET=72，900)。为验证该(剂量-应答)关系是否是抗-载体免疫引起的，我们独立地检测了HRV14载体所有组的免疫应答(图7)。所有3种类型的HRV"-M2e(17AA)给药(l、2或3剂)均显示相当的HRV14-特异性免疫应答水平(ET=72》00)(图7A)。这说明抗-载体免疫不是引起对M2-e免疫应答降低的原因，同时说明l剂的给药可能已经足够。单独的血清样本的M2e特异性ELISA(图8)检测到与用合并的样本所示相同的组内差异如在两个血清稀释度(1:300和l:2,700)所示，第4组和第7组中各小鼠的平均抗体水平显著高于所研究的任何其他组。ii.免疫接种动物中抗体的IgG2a、IgG2b和IgGl亚型已证明M2e免疫接种小鼠中的显性M2特异性Ab同种型是IgG2b,还有一些IgG2a(Jegerlehner等，J.Immunol.172.9:5598-5605,2004)。已证明这两种同种型是小鼠中抗体依赖25性细胞毒性(ADCC)最重要的介导物(Denkers等，J.Immunol.135:2183，1985)，据信这也是M2e依赖性保护的主要机制。本研究中，我们检测了合并组样本和单独的血清样本中的IgGl、IgG2a和IgG2b同种型效价。在所有组中，第4组(HRV14-M2e(17AA)引发/ACAM-FluA加强)和第7组(ACAM-FluA引发和加强)的IgGl、IgG2a抗体效价最高(图9)。第7组的IgGl效价显著高于第4组(图9A和9D)，IgG2a效价在第4组中较高(图9B和9D)，而第7组动物的IgG2b效价高于第4组(图10)。图11显示了免疫接种小鼠中的IgG2a同种型的M2e特异性抗体。b.发病率和致死率用PR8病毒林攻击之后，监测小鼠的发病率和致死率28天。如图12所示，与本研究中所有其他组相比，第4组显示出最高的存活率(80%)，而第7组与阴性对照(PBS)没有显著差别。第4组的发病率最低该组体重变化显著低于所有其他组(图13A,B)。因此，HRV14-M2e(17AA)病毒在小鼠中具有高度免疫原性和保护性。将传统重组蛋白方案的免疫应答和引发-加强方案中两者组合引起的免疫应答进行比较。后者与单独的重组蛋白相比具有明显不同的免疫应答2剂携带M2e的重組HBc(Acam-FluA)诱导出显性IgGl抗体亚型，而用HRV14-M2e(17AA)引发和用Acam-FluA加强免疫产生IgG2a作为显性同种型，已证明其对ADCC非常重要。此外，后组与所有其他各组相比都显示出最高的保护。很重要的一点是要注意到，因为HRV不在小鼠中复制，在该模型中接种HRV-M2e重组子是和合适的胃肠外佐剂联合进行的，模拟了灭活疫苗的免疫接种。我们提议最终在人中进行评价，有两种选择方案给予活的重组HRV14-M2e病毒疫苗和/或灭活疫苗(福尔马林灭活)与经批准的胃肠外佐剂例如氬氧化铝共同给药。B.体内试验#2.鼻内免疫接种1.用于接种的病毒该体内研究中，用鼻内给药途径评估HRV14-M2e(17AA)针对A型流感病毒抹PR8的非致死攻击提供保护的可能性。注意上文已描述了HRV14-M2e(17AA)序列。2.试一验设计第0天，用在50pL体积中与5pg大肠杆菌热不稳定性毒素(LT)佐剂混合的、蔗糖纯化的HRV14-M2e(17AA)或HRV14(参见表5的注脚(3))(1()Spfu/剂，第3-6组)病毒通过鼻内途径免疫引发9周龄雌性Balb/c小鼠(8只小鼠/组)，第21天加强免疫。作为黄金标准，使用了包含带有3个M2e拷贝的重组乙肝病毒核心颗粒的疫苗(ACAM-FluA)。后者单独或与HRV14-M2e或HRV14联合用于引发/加强免疫(表5)。为了验证免疫接种所提供的保护，第35天用4LD5o的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒攻击所有小鼠。监测发病率和致死率21天。为了检测针对所携带肽的小鼠血清抗体，免疫接种前(基线)和第33天分别取血。用涂覆有合成的M2e肽的微量滴定板进行规定的ELISA试验，测定血清中M2e特异性抗体的效价。测定了M2e特异性总IgG、Ig2a和Ig2b的效价。3.结果a.免疫原性i.M2e特异性抗体的效价用合并的血清样本检测各组的抗体效价(图14)。用1剂携27带17AAM2e的重组HRV14(引发)并用ACAM-FluA加强免疫与用2剂乙肝病毒核心蛋白-M2e重组病毒样颗粒(IO)ig/剂)引发的总IgG抗体水平相当(终点效价(ET)〉218,700;图14A)。后面的结果与通过IP途径免疫接种获得的数据一致。1剂HRV14-M2e与1剂AcamFluA诱导产生的M2e特异性总IgG水平相当(ET=24,300)。HRV14-M2e病毒负载降低2倍对总IgG水平无太大影响(第7组；ET-=24，300)。与用IP途径给药一样，用HRV14-M2e引发和用AcamFluA加强免疫产生了最高的IgG2a水平(图14C;ET》218,700)。l剂HRV14-M2e比1剂AcamFluA诱导产生的IgG2a水平稍高(ET=72,900对ET=24,300)。2剂AcamFluA产生了最高效价的IgG2b(图14B)和IgGl(图14D)。b.发病率用PR8病毒抹非致死性攻击之后监测小鼠的发病率17天(图15)。1剂HRV14-M2e提供的保护水平与2剂AcamFluA或用HRV14-M2e引发并用AcamFluA加强免疫提供的免疫保护水平相当。第2组小鼠(1剂AcamFluA)出现了明显的疾病症状。对照组(组4)在攻击后头9天中出现了严重的体重减轻。IV.HRV14病毒中新的显性中和免疫原(NimIV)，一个新发现的外源表位插入位点我们已鉴定到一种新的HRV中和免疫原中和免疫原IV(NimIV)。其可用于开发表位-插入重组疫苗。NimIV具有高度免疫原性，在小鼠中诱导很高的病毒中和滴度。HRV的NimIV包括结构蛋白VP1的C末端区域。该表位可在不同的HRV血清型之间交换。如果一种HRV的NimIV被引入另一种血清型病毒中，它会给产生的嵌合重组子带来供体血清型的中和特性。已证明在28ELISA和Western印迹试验中，合成的NimIV肽能够被相应的血清型特异性抗体有效识别。特别地，通过将HRV14中的NimIVHRV14替换为HRV6病毒的NimIV而产生了HRV14-NimlvHR^嵌合体。该病毒被抗HRV6多克隆抗体有效中和并在小鼠中诱导了抗-HRV6中和免疫应答。用HRV14-NimlvHR"免疫的小鼠血清中的50%中和滴度对于HRV6病毒约是1:800，而对于HRV14只有l:400(图16)。相比之下，小鼠抗-HRV14血清的50%中和滴度对于同源病毒而言是1:1400，表明HRV6特异性NimIV显著降低了抗其余HRV14Nims(1、II和ni)的抗体中和病毒的中和有效性。V.流感病毒小鼠攻击模型可用合适的病毒抹在小鼠流感病毒攻击模型中检测疫苗候选物的保护效力。我们研究中所用的原型流感攻击病毒株是适合于小鼠的病毒林A/PR/8/34(H1N1)。该病毒获自美国典型培养物保藏中心(目录号VR-1469,编号2013488),适合通过连续传代在Balb/c小鼠中生长。对于小鼠传代，鼻内免疫接种病毒，3天后制备肺组织匀浆。匀浆被盲法传代(blind-passaged)到其他小鼠中传至5代。然后另外传代用于制备肺匀浆等份，用作攻击储液。对于小鼠的攻击，鼻内免疫接种50pL给药。接种时麻醉小鼠以抑制咽反射，使病毒进入肺中。用致死剂量的病毒感染的小鼠体重减轻很快，大多数在接种后7-9天死亡。适合小鼠的A/PR/8/34病毒的中值致死剂量(LDso)在成年Balb/c小鼠中测定为7.5噬斑形成单位(pfu)。图17显示了典型的保护试验的结果。10个小鼠/组的小鼠用氢氧化铝佐剂假免疫(sham-immunized)或用混合有氢氧化铝的10i!g流感病毒M2e肽免疫原免疫。所述免疫原由表达M2e肽的乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒组成。以3周间隔免疫接种小鼠两次，4周后用4LDso适合小鼠的A/PR/8/34病毒鼻内免疫攻击。攻击后第10天假免疫组所有小鼠均死亡，而免疫组只有l只小鼠死亡。两组中攻击后均出现体重减轻，但假免疫组中体重减轻更大。可类似地使其他流感病毒抹适应在小鼠肺中生长。某些情况下，病毒抹可不经过体内适应即可使用，或者即使经过肺内连续传代也不具有足够的致病性。这种情况下，我们不检测发病率和死亡率，而是检测肺中和鼻曱组织中病毒的复制。攻击后3天收获组织，在lml组织培养基中超声波破碎，用噬斑试验或TCIDso试验滴定病毒的浓度。30表1-可从中衍生表位/抗原/肽的病原体例子列表病毒黄病毒科黄热病病毒日本脑炎病毒登革热病毒，1、2、3和4型西尼罗病毒虫皁传脑炎病毒(TickBorneEncephalitisvirus)丙肝病毒(例如，基因型la,lb，2a,2b，2c，3a，4a，4b,4c和4d)乳多空病毒科(Papoviridae):乳头瘤病毒反转录病毒科(Retroviridae)人免疫缺陷病毒，I型人免疫缺陷病毒，II型猿免疫缺陷病毒人亲T淋巴细胞病毒(Tlymphotropievirus),I&II型肝炎病毒科(Hepnaviridae)乙肝病毒小斗亥jf唐核酸病毒牙斗(Picornaviridae)曱肝病毒鼻病毒脊髓灰质炎病毒疱渗病毒科单纯疱渗病毒，I型单纯疱疹病毒，II型巨细月包病毒爱泼斯坦-巴尔(EpsteinBarr)病毒水痘-带状疱疹病毒披膜病毒科(Togaviridae)a病毒风渗病毒副粘病毒科呼吸道合胞体病毒副流感病毒麻渗病毒流行性腮腺炎病毒正粘病毒牙牛流感病毒丝状病毒科(Filoviridae)马尔堡病毒埃博拉病毒4仑习犬病毒f牛(Rotoviridae):轮状病毒冠状病毒科冠状病毒腺病毒科腺病毒弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒(Rabiesvirus)细菌肠毒性大肠杆菌致肠道疾病的大肠杆菌空肠弯曲杆菌(Cam;y/ofofl"er)幽门承累才f菌(//e//co6crCerjoy/or/)伤寒沙门氏菌(5Wmowe〃a(y;/n')霍乱弧菌(c/io/e麼)艰难才炎状芽孑包杆菌(C7oW"Wwmt/(/rz"7e)破伤风杆菌(C7oWnWwmf"am')^f匕脓'f生链3求菌(iS7rep^)coccciw/joge"es)百日咳杆菌f5ord"e〃ape由肌、J刀S刀莫炎奈瑟氏菌fiVe/^wer/oJ淋病奈瑟氏菌f7Ve^en.agcmor/joe"J月^炎军团菌fZ^g7'cme〃a打e"mo/7/^7wi1,衣原体嗜血杆菌志贺氏菌寄生虫虫虫虫虫体子虫曼原吸虫形孢囊什疾血锥弓隐肺利表2-从所列病毒中选择抗原的例子病毒抗原黄病毒黄热病病毒核壳体，M&E糖蛋白日本脑炎病毒"登革热病毒，1、2、3和4型"西尼罗病4"蜱传脑炎病毒"丙肝病毒乳多空病毒科:乳头瘤病毒反转录病毒牙斗人免疫缺陷病毒，I型人免疫缺陷病毒，II型猿免疫缺陷病毒人亲T淋巴细胞病毒，I&II型核壳体，El&E2糖蛋白L1&L2衣壳蛋白，E6&E7转化蛋白(致癌基因)gag,pol,vif,tat，vpu,env,nefgag,pol,env表3-所列病毒/抗原的B细胞和T细胞表位的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表4.免疫接种组(腹膜内研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表4注脚(1)ACAM-FluA是现有的一种通用A型流感疫苗候选物，基于携带3拷贝23AAM2-e肽的乙肝病毒核心抗原(HBc);用作黄金标准(goldenstandard);剂量=每只小鼠10|ug。(2)HBcAg是一种"棵，，HBc抗原；用作ACAM-FluA的载体对照；剂量=每只小鼠10pg。(3)HRV14是从pWR3.26感染性克隆(ATCC)中产生的"野生型，，HRV14;用作HRV14-M2e(17AA)的载体对照。(4)HRV14M2e(17AA)是在VP2的第159位和第160位氨基酸之间(NimII位点)携带QPASLLTEVETPIRNEWGSR序列的HRV14病毒。该插入物的头三个氨基酸(QPA)代表如前所述选自HRV14M2eXXX(17AA)文库的独特接头。(5)ADJ二佐剂(所有免疫中均使用铝)(6)所有组均采用腹膜内免疫。表5.免疫接种组f鼻内研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>(1)ACAM-FluA是现有的一种通用A型流感疫苗候选物，基于携带3拷贝23AAM2-e肽的乙肝病毒核心抗原(HBc);用作黄金标准(goldenstandard);剂量=每只小鼠10|tig。(2)HRV14是从pWR3.26感染性克隆(ATCC)中产生的"野生型，，HRV14;用作HRV14-M2e(17AA)的载体对照。(3)HRV14M2e(17AA)是在VP2的第159位和第160位氨基酸之间(NimII位点)携带QPASLLTEVETPIRNEWGSR序歹'J的HRV14病毒。该插入物的头三个氨基酸(QPA)代表如前所述选自HRV14M2eXXX(17AA)文库的独特接头。("AD卜佐剂(LT-热不稳定大肠杆菌毒素)(6)所有组均采用鼻内免疫。(7)第3、4、5和6组用1()8pfu/剂的相应病毒免疫接种。其它实施方式本说明书中引用的所有出版物和专利均通过参考纳入本文，如同具体和单独地说明将各独立的出版物或专利通过参考纳入本文一样。本文使用单数形式，例如"一种"和"这种"，不排除表示相应复数形式，除非上下文有其它明确表示。虽然为使本发明能被清楚地理解，以阐释和举例的方式详细描述了本发明，但本领域技术人员理解，鉴于本发明的教导，可对本发明进行一些变化和改动而不脱离所附权利要求书的精神或范围。其它实施方式在以下所述权利要求中。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>序列附录2流感病毒T细胞表位表l.A型流感病毒核蛋白的CTL表位<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>参考文献(1)McMlohael，A.J.,Gotah,F.M.&Rothbard,J.HLAB37determinesaninfluenzaAvirusnucleoproteinepitopesrecognizedbyhumancytotoxicTlymphocytes(HLAB37决定了由人细月包毒T淋巴细胞识别的A型流感病毒核蛋白表位).J.Bxp.Med，164,1397-1406，1986.(2)Townsend，A.R.M.,Rothbard,J.,Gotoh,F.M,,Bahadur,Q.,Wraith，D.&McMichael,A.J.TheetipoesofinfluenzanucleoproteinrecognizedbycytotoxioTlymphocytescanbedefinedwithshortsyntheticpeptides(由人细月包毒T'淋巴细月包识别的流感病毒核蛋白表位可用短合成肽确定).Cell44,959-968，1986.(3)Bastin,J.,Rothbard,J.,Davey,J.,Jones,I&Townsend,A.UseofsyntheticpeptidesofinfluenzanucleoproteintodefineepitopesrecognizedbyclassI-restrictedcytotoxioTlymphocytes(用流感病毒核蛋白的合成肽确定I型限制性细胞毒T淋巴细胞识别的表位)丄Exp.Med,165，1508-1223，1987.(4)Gotch,F.，Rothbard,Hciwland，IL，Townsend,A.&McMichael，ACytotoxicTlymphocytesrecognizeafragmentofinfluenzavirusmatrixproteininassociationwithHLA-A2(人纟田胞毒T淋巴细胞识别与HLA-A2相关的流感病毒核蛋白片段).Nature326,881-882,1987.(5)Bodmer，H.C,Pemberton，R,M,Rothbard,J.B.&Askcmas，B.A.EnhancedRecognitionofaModifiedPeptideAntigenbyCytotoxicTCellsSpecificforInfluenzaNuoleoprotein(流感病毒核蛋白特异性细胞毒T淋巴细胞对修饰肽的识别增强).Cell52,253-258,1988.(6)Ceppelini，R.,Fmmentn.G.,Ferrara,0.B.，Tosi,KJ,Chersi，A.&Perais，B.BindingoflabelledinfluenzamatrixpeptidetoHLADRinlivingBlymphoidcells(在活B淋巴样细胞中的标记的流感病毒基质肽与HLADR的结合).Nature339,392-394,1989.(7)Sweeter,M.T.，Morrison,L.A.Braciale,V.L.&Brariale,T:J.Recognitionofpre-processedendogenousantigenbyclassIbutnotclassIIMHC-restrictedTcells(是I类而不是II类MHC-限制性T细胞识别域加工的内源抗原).Nature，342,180-182,1989.(8)Gao，X-M,,Liew,F.Y.&The,J.P.IdentificationandCharacterizationofTHelperEpitopesintheNueleoproteinofInfluenzaAVirus(A型流感病毒核蛋白中T辅助细胞表位的鉴别和鉴定片段).J.Immunol143，3007-3014，1989.(9)Rotzschke,O.，FaBc,IL,Deres，KX,Schfld，H.,Norda,M,Metzger,J.Jung,G.&Rammensee,H.G.IsolationandanalysisofnaturallyprocessedviralpeptidesasrecognizedbycytotoxicT-cels(细胞毒T细胞识别的自然加工病毒肽的分离与分析).Nature348,252-254,1990.(10)Milligan,G.N"Morrison,L.A"Gorka,J,Braciale,V.L.&Braciale,T.J.TneRecognitionofaViralAntigenicMoietybyClaasIMHC-RestrictedCytolyticTLymphocytesisLimitedbytheAvailabilityoftheEndogenouslyProcessedAntigen(I类MHC-卩艮制性细胞毒T淋巴细胞对病毒抗原部分的识别受内源性加工的抗原有效性的限制).J，Immunol.145,3188-3193，1990.(11)Brett,S.J.,Blan,J,Hughes-Jenkms,C.M,Rhodes,J.，Liew，F.Y.&Tite，J.P.HumanTCellRecognitionofInfluenzaANucleoprotein(A型流感病毒核蛋白的人T细胞识别).SpecificityandGeneticRestrictionofImmunodominantTHelperCellEpitopes(免疫显性T辅助细胞表位的特异性和遗传限制).J.Immunol.147，_984-991,1991.(12)Bednarek，M.A.,Sa歸a,S.Y.，，Gammon,M.C,Porter,G.，Tanhankar,S.，Williamson,A.R.&Zweerink,H.J.Theminimumpeptideetitopefromtheinfluenza-virusmatrixprotein(流感病毒基质蛋白的最小月太表^f立).ExtraandintracellularloadingofHLA-A2(HLA-A2的额外和细胞内装载).J.Immunol.147,4047-4053，1991.(13)Cer飄dolo，V，tse,A.G.D.，Salter,R.D.，parham，P&Townsend，A.CD8independenceandspecificityofcytotoxicT-lymphocytesrestrictedbyHLAAw68.1(HLAAw68.1限制的细胞毒T淋巴细胞的CD8独立性和特异性).Proc.Roy.SecLond.SeriesBboilSci.244,169-177,1991.(14)DiBrino,M.,Tuuchida,T.Turner,R.V,Parker,ELC,Coligan,J.E.&Biddison，W.B.HLA-AlandHLA-A3T-cellepitopesderivedfrominfiuenza-vimsproteinspredictedfrompeptiebindingmotifs(由肽结合基序预测的流感病毒蛋白衍生的T-细胞表位)J.Immunol.151,5930-5935,1993.(15)Dong,T.,Boyd,D.,Rosenberg,W.,Alp,N,,TaMgucM,M.,McMJchael，A.&Rowland-Jones,S.AnHLA-B35-restrictedepitopemodifiedatananchorresidueresultsinanantagonistpeptide(在锚残基的HLA-B35限制性表位修饰产生拮抗剂肽).Eur.J.Immunol.26,335-339，1996.(16)Parker,C.E.&Gould,K.G.InfluenzaAvims.AmodelforviralantigenpresentationtocytotoxicTlymphocytes(病毒抗原递呈于细月包毒T'淋巴细月包的才莫式).SeminarsinVirology7,61-73,1996。序列附录3人鼻病毒14(HRV14);通过以下序列(SEQIDNO:50)中核苷酸629-7168的翻译获得所编码的氨基酸序列。1ttaaaacagcggatgggtatcccaccattcgacccattgggtgtagtactctggtactat61gtacctttgtacgcctgtttctccccaaccacccttccttaaaattcccacccatgaaac121gttagaagctgtacaataggtggrcgccatatccaatggtgtctatgtaca181agcacttctgtttccccggagcgaggtataggctgtacccgcctttaacc241gttatccgccgtaacagttagtaccatcttgttcttgact301tcaggtggattttccctccactagtttggtcgatgaggctaggaattccccacgggtgac361cgtgtcctagcctgcgtggcggccaacccagcttatgctgggacgcccttttaaggacat421ggtgtgasgactcgcatgtgcttggttgtgagtcctccggcccctgaatgcggctaacct481taaccctggagccttatgccacgstccagtggttgtaaggcaactccggg541acgggaccgactactttgggtgtccgtgtttctcatttttcttcatattgtcttatggtc601acagcatatatatacatatactgtgatcatgggcgctcsggtttctacac661atctcacgaattttgaccaatggstcaaatcagactttcacagttataaa721ttactataaggatgcagcaagtacatcatctcactgtcaatggacccatc781taagtttacagaaccagttaaagatctcatgcttasgggtgcaccagcattgaattcacc841caatgttgaggcctgtggttatagtgatagstcacactcgggaattcaac901ccaacgctgttgtgtgttatgctgaatggccagagtacct961tccagatgtggacgctagtgatgtcaataaccagaicacttctgtctgtag1021gttttacacattggatagt这sgacatggacaacaggttctaaaggctggtgctggaaatt1081accagatgceictcaaiagatatgggtgtgttatgtttttccactcactagg1141tacac这gtacacgttcagtgc站tgccacagcggttgtct1201acttgtagttgtaataccagggcttcacatatgtttcagt1261taaatacacattcacgcatccaggtgaacgtggtateigstttatcatctgcaaatgaagt1321gtcaaggatgtcaitatacaatatgaatggtactttattaggaaatctgct1381C3ttttCCCtcaccagttcaaaccaataattagtgatacc1441atacataaactcagtacccattgattcaatg3c3cgtc3caacaatgtctcactgstggt1501C3tCCCtSttgcccctcttacagtaccaacccctcactcccta仁aacagt1561cacaatagcacctatgtgcactgagttctctgggataa的tccasgtcsattgtgccaca1621aggtttgccaactacaactttgccggggtcaggacaattcttgaccacagatgacaggca1681atcccccagtgcactgccaaattatgagccaactccaagaatacacatac1741tcataacttgctagaaattatacaggtagatacactcattcctatgaacaacacgcatac1801aaaagatgaggttaacagttacctcataccactaaatgcaaacaggcaaaatgagcaggt1861ttttgggacaiaacctgtttattggtgatggggtcttcaaaactactcttctgggtgaaat1921tgttcagtactatacacattggrtctggatcacttagattctctttgatgtatactggtcc"81tgccttgtccsgtgcta站ctcattctagcatacaccccgcct的tgctcgt的tccaca2041ggacaggagagaagcaatgctaggtactcatgttgtctgggatattggtctgcaatccac2101catagtaatgac3ataccatggacatcaggggtgcagtttagatatactgatccagatac2161gctggctttctatcatgttggtatcaaacttctcttatacttcccccaga2221aacgaccggccaggtctacttattatcattcataagtgcatgtccagatttt站gctt3g2281gctgatgaaagaitactcaasictatctcacagactgttgcactcactgaaggcttaggtga2341tgsattagaagaagtcatcgttgagaaaacgtggcctcaatctcatctgg2401tccaaaacactccccatactgaaacagg的ccacsstgcc2461tgttcttccatcagacagcatagaaaccag33ct3cctacatgcactttaatggttcaga2521aactgatgtaigaatgctttttgggtcgtgcagcttgtgtgcatgtaactg2581caaagatgctataaitcacagttgttcaatgattggaaaat2641caacctgtccagccttgtccgaaactagaactcttcacttatgttaggtt2701tgaittctgagtatsicc3tactggccactgcatctc站cctgattcagcaaactattcaag2761caatttggtggtcc3agccatgtatgttccacctggtgccccgsLatcceiaaagagtggga2821cgattacacatggcaaagtgCttC333CCCcagtgtattcttc站ggtgggggatacatc2881caggtttagtgtgccttsitgtaggattggcatcagcatataattgtttttatgatggtta2941ctcacatgatgatgcagaaactcagtatggcataactgttctaaaccatatgggtagtat3001ggcattcagaatagtaaatgaacatgatgaacata站sctcttgtcaagatcagagttts3061tcacagggcaaagcacgttgaagcatggattccaagagcacccagagcactaccctacac3121atcaatagggCgCSC333ttatcctaagaagtaattaagaagagg33agg47<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>4861aagtga仁ttctgcaaattacagattccctagaaacactgtttcaaggacc4921agtgtataaattgatgtttgcctccagaatgtatcaacga4981tttactgaaatctgtagattcagaagagattaggg站tsttgtaagaagaagaaatggat5041tatacctgaaattcctaccaacatagaaagggctatgaatcaagccagcatgattattaa5101tactattctgatgtttgtcagtacattaggtattgtttatgtcatttataaattgt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