专利名称：低耗氧克拉维酸生产菌菌株的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种低耗氧克拉维酸生产菌株的筛选方法。
背景技术：
由于青霉素的广泛使用，某些细菌对它产生了耐药性。青霉素类和头孢菌素类药物均含
有一个共同的e—内酰胺结构，属e—内酰胺类抗生素。当使用具有这种结构的抗生素时，
部分病原菌通过产生e—内酰胺酶产生耐药性。克拉维酸(clavulanic acid， CA)又称棒 酸，是棒状链霉菌(分i-e/^咖7ces c7aw7ige/YA9)产生的一种高效0 —内酰胺酶抑制剂。 克拉维酸可以大大提高上述病原菌对e —内酰胺类抗生素的敏感性。克拉维酸本身的抗菌活
性很弱，但它是强力、广谱且不可逆的e—内酰胺酶抑制剂。不论在体外还是体内都能同耐 药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所产生的e」内酰胺酶生成牢固不可逆的结合物，从而抑
制耐药性细菌对e —内酰胺类抗生素的分解作用，恢复青霉素类及头孢菌素类抗生素对很多 产生P —内酰胺酶的耐药性细菌的抗菌活性。
自1976年英国Beecham公司Bromn等首次从棒状链霉菌(5Yrepto/77/ces c7aw/h>e/Y/s ATCC27046)的发酵液中发现了天然的P —内酰胺抑制剂克拉维酸以来，克拉维酸得到了广 泛的应用。在发酵生产中，棒状链霉菌对氧气要求较高，较高的搅拌转速和通气量消耗大量 的电能并且影响菌丝的生长形态。
在发酵过程中，发酵罐的能量消耗主要由如下三部分组成:搅拌器电机耗能、通入无菌 空气的制备能量及培养基消毒和冷却能量。培养基消毒和冷却能量主要取决于工艺过程和菌 种特性，而搅拌功率和无菌空气消耗能量两者的目的相同，主要是为了供应微生物足够的氧 气。因此，在发酵过程中需要不断地给发酵系统通入无菌空气，通过发酵罐的搅拌进一步分 散，使发酵液中保持适度的溶解氧浓度。长期以来，人们都只从加大通气量和搅拌转速这两 方面来改善发酵液的溶解氧，提高发酵单位。但是，过于激烈地搅拌会产生很大的剪切力， 导致微生物菌种和产物的失活。另外，搅拌功率过大，也会导致系统运行不经济，造成发酵 成本高。在一定限度的通气量范围内，Kla随通气量的增加而增大，但当超过一定限度时， 大量气体会不经分散而直接穿过搅拌器以大气泡形态向上浮升，出现"气泛"现象，搅拌功 率会大大下降，Kla也不再增加，盲目增加通气量不一定就能增加溶氧，反而会增加空气过 滤器的负担和染菌的可能。在发酵过程中，空压机供气需要消耗大量电能，约占发酵生产总用电量的30% 70%，机械搅拌也消耗大量的电能。在克拉维酸的发酵生产中，棒状链霉 菌对氧气要求较高，较高的搅拌转速和通气量消耗大量的电能并且影响菌丝的生长形态。显 然，降低棒状链霉菌菌种的耗氧量可以有效地降低发酵生产中的成本。发明内容本发明通过大量实验研究，目的在于为工业生产提供一种低耗氧菌株的方法，具体提供 了一种筛选低耗氧克拉维酸生产菌株的方法。本发明所涉及的一种低耗氧克拉维酸生产菌一 一棒状链霉菌(5Yr印"y^ces c&w/7iger^)菌株的筛选方法，包括初筛、复筛和小型发酵罐试验。(1) 初筛将诱变处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，在低氧培养箱中进行培 养，限制氧气的浓度在15%—21%之间，28T:培养10—12天，挑选生长和产孢良好 的菌株接种斜面，28'C培养10—12天，斜面产孢后制成孢子悬浮液，接种种子摇瓶， 28'C培养20—40小时后接种发酵摇瓶，28'C培养4天后测定效价，挑选出效价较高 的菌株；(2) 复筛将效价较高的菌株接种种子摇瓶，降低摇床的转速至50—100rpm， 28。C培养 40—48小时后，挑选菌丝生长良好的菌株接种发酵摇瓶，控制摇瓶中的氧气量。28 'C培养4天后测定效价；(3) 小型发酵罐试验将效价较高的菌株进行发酵罐发酵试验。将(2)中培养好的菌种 接到发酵罐中，接种量为5—10% (V/V)，在温度为28'C，搅拌转速为300—600转 /分，通气量0. 5VVM-1. 2VVM(体积/体积/分钟)，罐压0. 05—0. 08MPa， pH为6. 5-7. 5， 补入营养物质的条件下，培养90—100小时。(1)步骤中所用平板和斜面培养基成分和含量为葡萄糖4-10g/L,麦芽提取物 4-10g/L，酵母膏4-10g/L，琼脂20-25g/L， pH为6. 5-7. 5。 (1)和(2)步骤中所用的种子 摇瓶培养基成分和含量为蛋白胨3-10g/L，麦芽提取物3-10g/L，酵母膏3-10g/L， pH为 6.5-7.5。 (1)和(2)步骤中所用的发酵摇瓶培养基成分和含量为甘油10-20g/L，黄豆 粉20—30g/L，麦芽提取物10-20g/L， KH2P041. 0-3. 5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-1.5g/L， FeS04 7H20 0. 0005-0. 0015g/L， MnCl2'4H20 0. 0005-0. 0015g/L， ZnS04*7H20 0. 0005-0. 0015g/L， MOPS 10-20g/L， pH为6. 5_7. 5。 (3)步骤中所用的发酵培养基成分和含量为甘油10-20g/L， 棉籽粉40-60g/L，淀粉IO-20g/L， KH2P04 1. 0-3. 5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-2. 5g/L， FeS04.7H20 0. 005-0. 035g/L， MnCl2*4H20 0. 005-0. 015g/L， ZnS04'7H20 0. 005-0. 045g/L，消泡剂2_5g/L， pH为6. 5-7.5。本发明所提供的筛选低耗氧菌株的方法操作简便易行，所涉及的培养基原料来源广，成 本低，非常适合工业生产的需要。更重要的，在本发明中，筛选低耗氧的菌株，可以降低耗 氧量，有效地降低搅拌转速和通气量，降低用发酵中的电量，降低发酵生产中的成本。
具体实施方式
实施例l诱变将棒状链霉菌(5Yrepfoz/^ces c7ara7i'《eru5)孢子悬浮液通过NTG诱变。初筛按照如下配方配制平板培养基3. 5L:葡萄糖8g/L，麦芽提取物6g/L，酵母膏4g/L， 琼脂25g/L， pH为7.2。准备无菌培养皿100个。培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。将 诱变处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，在氧气浓度为16%的三气培养箱中进行 培养，28r培养10—12天。按照如下配方配制斜面培养基4L:葡萄糖8g/L，麦芽提取物 6g/L，酵母膏4g/L，琼脂25g/L， pH为7. 2。准备试管200支，制成斜面备用。挑选平板中 生长和产孢良好的菌株接种斜面，在氧气浓度为16%的三气培养缉中进行培养，28。C培养 10 — 12天，斜面产孢后制成孢子悬浮液，接种种子摇瓶。种子摇瓶培养基成分和含量为 蛋白胨3g/L，麦芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH为7. 2。 28'C培养20 — 40小时后接种发 酵摇瓶。发酵摇瓶培养基成分和含量为甘油15g/L，黄豆粉25g/L，麦芽提取物15g/L， KH2P042 . 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04'7H20 0. 001g/L， MnCl2*4H20 0. OOlg/L, ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH为7. 1。 28。C培养4天后测定效价，挑选出效价较高的菌株3个。 重复以上过程44次。将每次筛选出的菌株保存。复筛将效价较高的菌株接种种子摇瓶，控制摇床的转速为60rpm， 28。C培养40—48 小时后，接种发酵摇瓶，控制摇床的转速为60rpm， 28'C培养4天后测定效价。挑选效价较 高的菌株3个，保存，备用。小型发酵罐试验将效价较高的菌株NTGM0702进行发酵罐发酵试验。按如下配方配制 种子摇瓶培养基1.4L:蛋白胨3g/L，麦芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH为7. 2。将培养基 装入7个2L三角瓶中，每瓶200mU灭菌后接种孢子悬浮液2毫升，28'C培养40小时后， 选取5瓶生长良好并且无杂菌的种子，并瓶，备用。使用15L小型发酵罐进行发酵试验。按 照如下配方配制发酵培养基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L,麦芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04'7H20 0. Olg/L, MnCl2'4H20 0. 01g/L， ZnS04*7H20 0. 01g/L， 消泡剂4g/L， pH为7. 1。配后体积7. 6L，实消后体积为9L。将摇瓶种子接种到15升发酵 罐中，接种量为10% (V/V)。起始条件为温度28'C、转速300rpm、通气量为0. 5VVM、罐压0.05MPa。在发酵过程中，将溶氧维持在30%以上。搅拌转速为300 — 550转/分，通气量 0.5VVM-1. 1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05—0.07MPa， pH为6.9-7.4，补入营养物质的 条件下，培养110小时。将挑选出的菌株分别按如上步骤进行小型发酵罐试验，对搅拌转速、 通气量、OUR和效价等进行综合比较，筛选出耗氧少并且效价高的菌株1个。实施例2诱变将棒状链霉菌(5Yr印toz/7/ces c7ai^&e7^)孢子悬浮液通过紫外线诱变。初筛按照如下配方配制平板培养基3. 5L:葡萄糖8g/L，麦芽提取物5g/L，酵母膏4g/L， 琼脂24g/L， pH为7.2。准备无菌培养皿100个。培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。将 诱变处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，在氧气浓度为18%的三气培养箱中进行 培养，28'C培养10_12天。按照如下配方配制斜面培养基4L:葡萄糖8g/L,麦芽提取物 5g/L，酵母膏4g/L，琼脂25g/L， pH为7. 2。准备试管200支，制成斜面备用。挑选平板中 生长和产孢良好的菌株接种斜面，在氧气浓度为18%的三气培养箱中进行培养，28'C培养 10_12天，斜面产孢后制成孢子悬浮液，接种种子摇瓶。种子摇瓶培养基成分和含量为 蛋白胨3g/L,麦芽提取物7g/L，酵母膏5g/L， pH为7.2。 28'C培养20—40小时后接种发 酵摇瓶。发酵摇瓶培养基成分和含量为甘油15g/L，黄豆粉25g/L，麦芽提取物15g/L， KH2P042. 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04*7H20 0. 001g/L， MnCl2'4H20 0. 001g/L， ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH为7. 1。 28'C培养4天后测定效价，挑选出效价较高的菌株2个。 重复以上过程34次。将每次筛选出的菌株保存。复筛将效价较高的菌株接种种子摇瓶，控制摇床的转速为70rpm， 2S'C培养40—48 小时后，接种发酵摇瓶，控制摇床的转速为70rpm， 28X:培养4天后测定效价。挑选效价较 高的菌株3个，保存，备用。小型发酵罐试验将效价较高的菌株ZWM0603进行发酵罐发酵试验。按如下配方配制种子摇瓶培养基1.4L:蛋白胨3g/L，麦芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH为7.2。将培养基装入7个2L三角瓶中，每瓶200mL。灭菌后接种孢子悬浮液2毫升，28'C培养40小时后，选取5瓶生长良好并且无杂菌的种子，并瓶，备用。使用15L小型发酵罐进行发酵试验。按照如下配方配制发酵培养基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L，麦芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L，MgS04*7H20 0. 75g/L， FeS(V7H20 0. 01g/L， MnCl2*4H20 0. 01g/L， ZnS04'7H20 0. 01g/L，消泡剂4g/L， pH为7.1。配后体积7.5L，实消后体积为9L。将摇瓶种子接种到15升发酵罐中，接种量为10% (V/V)，起始条件为温度28°C、转速300rpm、通气量为0. 5VVM、罐压0. 05MPa。在发酵过程中，将溶氧维持在30%以上。搅拌转速为300 — 530转/分，通气量0.5VVM-L2VVM(体积/体积/分钟)，罐压0. 05—0. 07MPa， pH为6. 9-7. 4，补入营养物质的 条件下，培养110小时。将挑选出的菌株分别按如上步骤进行小型发酵罐试验，对搅拌转速、 通气量、OUR和效价等进行综合比较，筛选出耗氧少并且效价高的菌株l个。实施例3诱变将棒状链霉菌(分r印t^ /ces c7ara7&ei7AS)孢子悬浮液通过微波诱变。初筛:按照如下配方配制平板培养基3. 5L:葡萄糖8g/L，麦芽提取物6g/L，酵母膏4g/L， 琼脂25g/L， pH为7.2。准备无菌培养皿100个。培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。将 诱变处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，在氧气浓度为16%的三气培养箱中进行 培养，28。C培养10—12天。按照如下配方配制斜面培养基4L:葡萄糖8g/L，麦芽提取物 6g/L，酵母膏4g/L，琼脂25g/L， pH为7.2。准备试管200支，制成斜面备用。挑选平板中 生长和产孢良好的菌株接种斜面，在氧气浓度为17%的三气培养箱中进行培养，28'C培养 10—12天，斜面产孢后制成孢子悬浮液，接种种子摇瓶。种子摇瓶培养基成分和含量为 蛋白胨3g/L，麦芽提取物8g/L，酵肯膏5g/L， pH为7.2。 28'C培养20_40小时后接种发 酵摇瓶。发酵摇瓶培养基成分和含量为甘油15g/L，黄豆粉25g/L，麦芽提取物15g/L, KH2P042.5g/L, MgS04*7H20 0. 75g/L， FeS04,7H20 0. OOlg/L, MnCl2'4H20 0. 001g/L， ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH为7. 1。 28。C培养4天后测定效价，挑选出效价较高的菌株2个。 重复以上过程28次。将每次筛选出的菌株保存。复筛将效价较高的菌株接种种子摇瓶，控制摇床的转速为60rpm, 28'C培养40—48 小时后，接种发酵摇瓶，控制摇床的转速为80rpm， 28'C培养4天后测定效价。挑选效价较 高的菌株3个，保存，备用。小型发酵罐试验将效价较高的菌株WBM0703进行发酵罐发酵试验。按如下配方配制种 子摇瓶培养基1.4L:蛋白胨3g/L，麦芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH为7.2。将培养基装 入7个2L三角瓶中，每瓶200mL。灭菌后接种孢子悬浮液2毫升，28'C培养40小时后，选 取5瓶生长良好并且无杂菌的种子，并瓶，备用。使用15L小型发酵罐进行发酵试验。按照 如下配方配制发酵培养基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L，麦芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L， MgS04'7H20 0争75g/L, FeS04'7H20 0. 01g/L， MnCl2'4H20 0. 01g/L， ZnS04*7H20 0. 01g/L，消泡 剂4g/L, pH为7. 1。配后体积7. 6L,实消后体积为9L。将摇瓶种子接种到15升发酵罐中， 接种量为10% (V/V)。起始条件为温度28°C、转速300rpm、通气量为0. 5VVM、罐压0. 05MPa。 在发酵过程中，将溶氧维持在30%以上。搅拌转速为300 — 530转/分，通气量 0.5VVM-1. 1VVM(体积/体积/分钟)，罐压0. 05—0. 07MPa， pH为6. 9-7. 4，补入营养物质的条件下，培养no小时。将挑选出的菌株分别按如上步骤进行小型发酵罐试验，对搅拌转速、 通气量、OUR和效价等进行综合比较，筛选出耗氧少并且效价高的菌株1个。
权利要求
1. 一种低耗氧克拉维酸生产菌株的筛选方法，包括如下步骤(1)初筛将诱变处理的孢子悬浮液适当稀释后涂布于平板上，在低氧培养箱中进行培养，限制氧气的浓度在15％-21％之间，28℃培养10-12天，挑选生长和产孢良好的菌株接种斜面，28℃培养10-12天，斜面产孢后制成孢子悬浮液，接种种子摇瓶，28℃培养20-40小时后接种发酵摇瓶，28℃培养4天后测定效价，挑选出效价较高的菌株；(2)复筛将效价较高的菌株接种种子摇瓶，降低摇床的转速至50-100rpm，28℃培养40-48小时后，挑选菌丝生长良好的菌株接种发酵摇瓶，控制摇瓶中的氧气量，28℃培养4天后测定效价；(3)小型发酵罐试验将效价较高的菌株进行发酵罐发酵试验，将(2)中培养好的菌种接到发酵罐中，接种量为5-10％(体积百分比)，在温度为28℃，搅拌转速为300-600转/分，通气量0.5VVM-1.2VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05-0.08MPa，pH为6.5-7.5，补入营养物质的条件下，培养90-100小时。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)步骤中所用平板和斜面培养基成分 和含量为葡萄糖4-10g/L，麦芽提取物4-10g/L，酵母膏4-10g/L，琼脂20-25g/L， pH 为6. 5-7. 5。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)或(2)步骤中所用的种子摇瓶培 养基成分和含量为蛋白胨3-10g/L，麦芽提取物3-10g/L，酵母膏3-10g/L， pH为6. 5-7. 5。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)和(2)步骤中所用的发酵摇瓶培 养基成分和含量为甘油10-20g/L，黄豆粉20—30g/L，麦芽提取物10-20g/L， KH2P04 1.0-3. 5g/L， MgS04'7H20 0. 5%-1.5g/L， FeS04'7H20 0. 0005-0. 0015g/L ， MnCl2*4H20 0.0005-0.0015g/L， ZnS04*7H20 0.0005-0. 0015g/L， MOPS 10-20g/L， pH为6. 5-7. 5。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(3)步骤中所用的发酵培养基成分和含 量为甘油10-20g/L，黄豆粉40-60g/L，麦芽提取物10-20g/L， KH2P04 1.0-3.5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-2. 5g/L， FeS04*7H20 0. 005-0. 035g/L， MnCl2*4H20 0. 005-0. 015g/L， ZnS04 7H20 0. 005-0. 045g/L，消泡剂2-5g/L， pH为6. 5-7. 5。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，公开了一种低耗氧克拉维酸生产菌菌株的筛选方法，其包括初筛、复筛和小型发酵罐试验等步骤。本发明所提供的筛选低耗氧菌株的方法操作简便易行，所涉及的培养基原料来源广，成本低，非常适合工业生产的需要。
文档编号C12Q1/04GK101280336SQ20081001641
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者赵志全 申请人:鲁南制药集团股份有限公司