专利名称：添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法
技术领域：
本发明涉及一种添加a-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)抑制剂实现a-酮戊二酸 (KG)过量积累的方法。通过研究KGDH抑制剂对代谢流流向及相应的代谢通 量的影响，达到a-酮戊二酸的大量积累。属于蛋白质水平的代谢调控优化发酵 过程技术领域。
技术背景a-酮戊二酸，又称a-胶酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸 (TCA)循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也 是合成多种氨基酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为〇 Oa-酮戊二酸结构式a-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景， 目前主要应用领域为作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测 肝功能的配套试剂；体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在 脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体；同时研究还表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用， 与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用。oc-酮戊 二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病进行治疗。过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠和羟基硫氨对KGDH的抑制作用在人类神 经和心脏疾病中的研究广泛，而在微生物尤其是酵母中的研究鲜见报道。本研 究确定了这四种物质对KGDH的抑制作用，同时明确了抑制浓度和添加时间， 为TCA循环中间代谢产物的发酵研究提供了一个新的思路。 发明内容本发明的目的是提供一种添加a-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现a-酮戊二酸过 量积累的方法。利用多重营养缺陷型的光滑球拟酵母(T. g/Wrato)CCTCC M202019发酵生产KG，在发酵过程中添加适量的KGDH抑制剂，有目的的抑 制KGDH活性，达到大量积累KG的目的。本发明的技术方案 一种添加a-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现ot-酮戊二酸过 量积累的方法，是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T. g/Wrato)CCTCCM202019为生产菌株，通过在培养基中添加KGDH抑制剂过氧化氢、 甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨调节KGDH活性，有目的的减少KG的降解， 使碳流截止在KG这一节点上，实现oc-酮戊二酸过量积累；调控方法为发酵40h，在发酵培养基中添加过氧化氢达5mM时，a-酮戊二酸积累量达 到23.2g/L，比对照提高了 12.2%;或发酵初期Oh，在发酵培养基中添加甲氨蝶呤达0.08)LiM时，a-酮戊二酸 积累量达到22.7g/L，比对照提高了 10.1%;或发酵初期Oh，在发酵培养基中添加次氯酸钠达0.4 mM时，oc-酮戊二酸 积累量达到22.2 g/L，比对照提高了 7.5%;或发酵初期Oh，在发酵培养基中添加羟基硫氨达0.48pM时，a-酮戊二酸 积累量达到22.0 g/L，比对照提高了 6.1%。1、 菌种光滑球拟酵母(7:g/a6rato) CCTCC NO. M 202019，为烟酸、生物素、硫 胺素、盐酸吡哆醇4种维生素营养缺陷型菌株，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低， 为本研究室选育菌株，专利号ZL 02113142.2。2、 培养基和培养方法种子培养基种子和斜面培养基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P041， MgSO(7H2O0.5;琼脂20 (斜面培养基)，pH5.5。发酵培养基葡萄糖100 g/L; NH4C1 7 g/L; KH2P04 5 g/L; MgS04'7H20 0.8 g/L;烟酸8mg/L;盐酸吡哆醇0.4mg/L;硫胺素0.02mg/L;生物素0.04mg/L; CaC03 60 g/L;根据实验要求添加不同浓度的KGDH抑制剂。摇瓶培养将30'C、 200rpm下培养24h的种子以10%的接种量转入发酵 培养基于3(TC、 200rpm条件下培养72h。3、 分析方法葡萄糖的测定3，5-二硝基水杨酸法。丙酮酸(PYR)和a-酮戊二酸(KG)的测定采用高效液相色谱(HPLC) 测定。参考Agillent有机酸测定方法。色谱条件为ZORBAXSB-Aq反相柱， 柱温35 。C，检测器UV210nm，流动相19.7 g/LNa2HP04 + 1.2°/。H3P04 + 1% 乙腈，pH2.0，流速1.0mL/min，进样体积5 pL。细胞干重(DCW)测定根据细胞干重和对应OD值绘制标准曲线，得1 OD=0.29g/LDCW。本发明的有益效果本发明利用调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向 分布，使碳代谢流截止在KG这一节点上，其中KG最大产量达到23.2g/L，比 对照提高了 12.2%。
具体实施方式
实施例1添加过氧化氢对对r g/"6rato CCTCC NO. M 202019发酵产酸的影响发酵初期添加过氧化氢，随着过氧化氢添加量的增加，丙酮酸产量呈现上 升趋势，当过氧化氢添加量为5 mM时，KG产量达到最大为21.8g/L，比对照 增加了5.6%，此时CKc/CpTO值为0.73。考察发酵不同阶段添加5mM过氧化氢 对产酸的影响，KG产酸初期(40 h)添加过氧化氢，KG的积累量增加最大， 为23.2 g/L，比对照提高了 12.2%。由此得出过氧化氢的最佳添加量为5mM，添加时间为KG产酸初期(40h)。 实施例2添加甲氨蝶呤对CCTCC NO. M 202019发酵产酸的影响 发酵初期添加不同浓度甲氨喋呤(MTX)，随着MTX添加量的增加，PYR 和KG产量均呈现先升后降的趋势，当培养液中MTX浓度达到0.08 |iM时，PYR 和KG产量均达到最大值，分别为30.4 g/L和22.7 g/L，比对照分别增加了 8.9% 和10.1%,此时Cice/CpYK值为0.75。考察发酵不同阶段添加MTX对产酸的影 响发现，随着发酵的进行，MTX对发酵产KG的影响变小。由此得出MTX的最佳添加量为0.08 pM，添加时间为发酵初期(O h)。 实施例3添加次氯酸钠对CCTCC NO. M 202019发酵产酸的影响 在培养基中添加次氯酸钠发现，当添加浓度达到0.4 mM时，KG产量为22.2 g/L，比对照增加7.5%， Cp"Ckg值下降了 6%。考察发酵不同时期添加0.4 mM NaC103对产酸的影响发现，发酵初始(0h)为最佳添加时间。由此得出次氯酸钠的最佳添加量为0.4 mM，添加时间为发酵初期(Oh)。 实施例4添加羟基硫氨对CCTCC NO. M 202019发酵产酸的影响 在培养基中添加羟基硫氨发现，当添加浓度达到0.48 |aM时，KG产量为22.0 g/L，比对照增加6.1%，而PYR产量下降了 13.7%， Cpy/Ckg值趋于定值，表明 随着羟基硫胺浓度的增加，KG相对产量增加，进入TCA循环的碳代谢流流量 增加。由此得出羟基硫氨的最佳添加量为0.48 |aM，添加时间为发酵初期(0h)。
权利要求
1、一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019为生产菌株，通过在培养基中添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨，调节α-酮戊二酸脱氢酶活性，有目的的减少α-酮戊二酸的降解，使碳流截止在α-酮戊二酸这一节点上，实现α-酮戊二酸过量积累；调控方法为发酵40h，在发酵培养基中添加过氧化氢达5mM时，α-酮戊二酸积累量达到23.2g/L；或发酵初期0h，在发酵培养基中添加甲氨蝶呤达0.08μM时，α-酮戊二酸积累量达到22.7g/L；或发酵初期0h，在发酵培养基中添加次氯酸钠达0.4mM时，α-酮戊二酸积累量达到22.2g/L；或发酵初期0h，在发酵培养基中添加羟基硫氨达0.48μM时，α-酮戊二酸积累量达到22.0g/L。
全文摘要
一种添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂实现α-酮戊二酸过量积累的方法，属于蛋白质水平的代谢调控优化发酵过程技术领域。本发明利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母CCTCC M202019为生产菌株，通过在培养基中添加α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂过氧化氢、甲氨蝶呤、次氯酸钠或羟基硫氨，调节α-酮戊二酸脱氢酶活性，有目的的降低α-酮戊二酸脱氢酶活性，减少代谢过程中α-酮戊二酸的降解，达到过量积累α-酮戊二酸的目的。本发明利用调控工业微生物中碳代谢和碳代谢流流向分布，使碳代谢流截止在α-酮戊二酸这一节点上，其中α-酮戊二酸最大产量达到23.2g/L，比对照提高了12.2％。本发明为TCA循环中间代谢产物的发酵研究提供了一个新的思路。
文档编号C12R1/645GK101250563SQ200810020039
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者刘立明, 堵国成, 张旦旦, 坚 陈 申请人:江南大学