专利名称：：一种用于微生物发酵的复合有机氮源的制作方法一种用于微生物发酵的复合有机氮源发明领域本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种用于微生物发酵的复合有机氮源。技术背景有机氮源是发酵培养基中的重要原料，其作用不仅仅是提供氮元素，更重要的是提供微生物生长发育以及产物分泌所需的矿物质和维生素并将其所需的矿物质和维生素维持在合适的范围内，如果矿物质和维生素控制不好，会造成发酵生产的大起大落，因而有机氮源是发酵培养基中对生产影响最重要的成分。而目前发酵培养基中氮源的设计，一般通过大量的实验选择合适的有机氮源种类、并通过控制其浓度来取得较好的发酵结果，研究工作常常也就停留于此了。但针对有机氮源中控制微生物反应的矿物质和维生素的研究未见报道。这种研究的低水平，客观上造成了无法对有机氮源的供给提出有针对性的品控要求，进而导致由于原材料产地、加工方法等因素的变化，造成对发酵结果的影响。
发明内容本发明的目的在于，提供一种用于微生物发酵的复合有机氮源，以利于提高发酵水平以及降低氮源的成本。本发明的另一个目的在于，提供一种提高微生物发酵水平的方法。本发明提供的用于微生物发酵的复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成。根据本发明，所述天然氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、生物氮素、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、大豆生物营养素、鸡毛粉。根据本发明，所述天然氮源的复配是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量。其中所述矿物质包括K+，Co2+，Na+，Zn2+，Cu2+，Mg2+，Fe2+，Mn2+，其浓度分别如下:Co2+Na+Zn2+Cu2+Mg2+Fe2+Mn2+0.43-23.05mg/g<0.1%mg/g<22.93mg/g<0.34mg/g<235mg/g<54.53mg/g<10.82mg/g<0.464mg/g所述维生素包括维生素Bl、B2、B6、B12，烟酸，叶酸，泛酸，生物素，脂溶性维生素A、D、E、K，维生素c，其浓度分别如下:纟Sl烟酸叶酸泛酸生物素维生素vVcA、D、E、K0.02-4.75<4.34mg/gmg/g<1.41mg/g<1.72mg/g<1.68mg/g<3.98<5.91mg/gmg/g本发明的提高微生物发酵水平的方法是采用由多种不同的天然氮源复配而成的复合有机氮源作为发酵培养基中的氮源。在本发明的实施例中，所述复合有机氮源用于多种微生物菌株的发酵，包括克雷伯肺炎杆菌、黑曲霉、以及红霉素链霉菌，结果显示，这些菌株的发酵水平和发酵液中目标产物的含量均有了显著的提高，从而证明了本发明的复合有机氮源的适用性。本发明的复合有机氮源，由于在提供含氮量的同时控制了氮源中对微生物发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，从而可以有效的保证发酵水平，提高目标产物的含量，而且具有很好的适用性；同时也解决了由于工业生产中由于氮源的产地、生产条件、生产批次的不同引起的成分的变化而导致的发酵水平波动的问题，可用于对有机氮源的供给有针对性的进行品质控制；此外，该复合氮源是由多种不同氮源通过复配而成，有利于降低氮源的成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。以下实施例中，用于配制复合有机氮源的各种单一氮源的来源如下生物氮素蚌埠安加生物科技有限公司；棉籽饼粉北京中棉紫光生物科技公司；玉米浆干粉上海西王淀粉糖有限公司；黄豆饼粉河南驻马店天方制药有限公司；鸡毛粉临沂市河东区金鹏词料厂；酵母粉(进口)上海化学试剂采购供应站中心化工厂；酵母粉(国产)江苏如东绿奇生物工程有限公司；蛋白胨(进口)上海化学试剂采购供应站中心化工厂；蛋白胨(国产)上海化学试剂采购供应站中心化工厂。以下实施例中，所使用的检测方法如下矿物质含量测定精确称取0.5g样品于250ml凯氏烧瓶，力n10ml硝酸，0.5ml高氯酸，过夜，低温消化，至近干，冷却，加2.5ml硝酸和少量水溶解固体，定容50ml。然后通过原子吸收进行测定。维生素含量测定采用HPLC测定，具体条件为色谱条件色谱柱为DiamonsilC18柱(5um，200X4.6mm);流动相甲醇水(含己垸磺酸钠PIC—B6为5mmol/L，冰醋酸1%，并且用三乙胺调pH3.2)=30:70;流速lml/min，紫外检测波长275nm、0.04AUFS，拄温4(TC，进样量10)^1，内标物苯甲酸。红霉素效价的测定将发酵液离心，8000rpm，离心10min后，取上清液0.25ml，加入4.75ml水，取稀释后的溶液0.4ml,加入10MH3P044.6ml。在沸水浴中水浴3min，然后在冷水浴中冷却10min。测OD485的吸光值，对照标准曲线，计算红霉素效价。红霉素A组分的测定采用高效液相色谱(HPLC)测定，色谱条件为ds反相柱，柱温为35°C;检测器为UV238nm;流动相将真空抽滤过0.22um的微孔膜的0.05mol/LKH2P04溶液按68:32的体积比与乙睛(色谱纯)混合，超声脱气后即为流动相，其流速为1.0ml/min;进样体积为10nL。克雷伯肺炎杆菌的菌液浓度测定以去离子水为空白对照，620nm测光吸收值。甘油浓度测定用高碘酸钠氧化法滴定。克雷伯肺炎杆菌As1.1526发酵产物(1,3-丙二醇)测定步骤如下参考厂商提供的使用手册，采用GC112A型气相色谱测定，色谱柱采用毛细管柱ATSE-5430mX0.53mmXl.Opm，FID检测器，用N2作为载气，流速为15ml/min，柱温120°C，检测器温度250。C，进样量0.15pL。黑曲霉As3.86发酵产物p-葡萄糖苷酶的酶活测定步骤如下移取0.25ml醋酸水杨苷溶液(0.5%水杨苷，0.1M醋酸)、0.02ml过滤后的酶液和0.73ml蒸馏水至1ml的小离心管中；把小离心管放入水浴锅中，6(TC水浴10min，取出后立即用生物传感分析仪测定葡萄糖量；取0.25ml醋酸水杨苷加0.75ml水作为空白对照，酶活计算公式酶活-X(生物传感分析仪显示的数字)X16.67。实施例1、复合有机氮源的制备1.1、用于红霉素链霉菌As4.1245发酵的复合有机氮源的制备按表l.l所示的配方(重量百分比％，下同)，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于红霉素链霉菌As4.1245发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源1-11-3。表1.1、复合有机氮源配方复合氮源氮源及含量氮源及含量氮源及含量氮源及含量1-1棉籽饼粉15.16%玉米浆干粉2.87%黄豆饼粉16.39%生物氮素65.58%1-2酵母粉(进口)15.95%玉米浆干粉7.33%鸡毛粉8.62%蛋白胨(进口)68.1%1-3酵母粉(国产)2.3%蛋白胨(国产)2.3%棉籽饼粉6.9%生物氮素88.5%对上述获得的复合有机氮源l-ll-3中的K+、Co2+、Fe2+、Na+、VB6、烟酸、叶酸以及泛酸的量进行检测，结果如表1.2所示。表1.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量(mg/g复合氮源，下同)氮源Co2+Fe2+Na+VB6烟酸叶酸泛酸l隱l16.763mg/g0.032mg/g0,024mg/g0.187mg/g1.592mg/g0.025mg/g0.595mg/g0.444mg/g1-20.433mg/g0.196mg/g10.822mg/g22.934mg/g0.025mg/g1.493mg/g0.039mg/g1.718mg/g1-310.693mg/g0.057mg/g7.054mg/g10.463mg/g0.624mg/g0.684mg/g1.414mg/g0.045mg/g1.2、用于红霉素链霉菌IAA-177发酵的复合有机氮源的制备按表2.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于红霉素链霉菌IAA-177发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源2-l2-3。表2.1、复合有机氮源配方复合氮源氮源及含量氮源及含量氮源及含量氮源及含量2陽1酵母粉(国产)5.4%玉米浆干粉2.7%棉籽饼粉8.11%鸡毛粉83.79%2-2棉籽饼粉2.08%蛋白胨(国产)7.08%黄豆饼粉15.83%生物氮素75.01%2陽3棉籽饼粉17.84%玉米浆干粉16.43%鸡毛粉39.91。％生物氮素25.82%对上述获得的有机氮源2-l2-3中的012+、K+、Co2+、Mn2+、烟酸、VB1、VB2、生物素的量进行检测，结果如表2.2所示。表2.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量氮源Cu2+C02+Mn2+烟酸雨VB2生物素2陽10.139mg/g5.35mg/g0週mg/g0.464mg/g0.848mg/g0.562mg/g1.12mg/g0.582mg/g2-20.015mg/g13.45mg/g0.004mg/g0.258mg/g0.025mg/g0.025mg/g0.02mg/g0.029mg/g2-30.058mg/g6.38mgZg0.018mg/g0.157mg/g1.733mg/g1.678mg/g1.71mg/g1.675mg/g1.3、用于克雷伯肺炎杆菌As1.1526发酵的复合有机氮源的制备按表3.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于克雷伯肺炎杆菌As1.1526发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源3-l3-3。表3.1、复合有机氮源配方复合氮源氮源及含量氮源及含量氮源及含量氮源及含量3-1棉籽饼粉玉米桨干粉黄豆饼粉生物氮素24.65%6.34%16.2%52.81%3陽2鱼粉大豆生物营养素黄豆饼粉鸡毛粉38.92%19.17%2.99%38.92%3-3蛋白胨(国产)鸡毛粉玉米浆干粉棉籽饼粉21.4%41.4%11.63%25.57%对上述获得的有机氮源3-l3-3中的012+、K+、Zn2+、VB12、维生素A、D、E、K的量进行检测，结果如表3.2所示。表3.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量氮源Cu2+K十Zn2+VB12维生素A维生素D维生素E维生素K3"0.2357.390.030.03m0.060.060.170.25mg/gmg/gmg/gg/gmg/gmg/gmg/gmg/g3陽20.02723.050.340.41m3.633.983.753.53mg/gmg/gmg/gg/gmg/gmg/gmg/gmg/g3-30.0567.070.111.44m1.090.971.460.88mg/gmg/gmg/gmg/gmg/gmg/gmg/g1.4、用于黑曲霉As3.86发酵的复合有机氮源的制备按表4.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于黑曲霉As3.86发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源4-l4-3。表4.1、复合有机氮源配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>对上述获得的有机氮源4-l4-3中的012+，K+，Zn2+，Mg2+，VB6，VB12，烟酸，维生素C的量进行检测，结果如表4.2所示。表4.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2、复合有机氮源用于菌种发酵2.1、复合有机氮源l-ll-3用于红霉素链霉菌As4.1245的发酵2丄1、培养基制备禾中子培养基3.5gi定私S3.5g糊精，3.0g黄豆饼粉，0.5g葡萄糖，0.6g硫酸铵，0.5g碳酸钶，豆油0.2ml，定容至100ml。对照发酵培养基4.5g淀粉，0.8g硫酸铵，0.9g碳酸药，豆油0.8ml，4.0g黄豆饼粉，定容至100ml。复配发酵培养基l-ll-3:4.5g淀粉，0.8g硫酸铵，0.9g碳酸钙，0.8ml豆油，3.8g复合有机氮源l-l、1-2或1-3，定容至100ml。经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中K+、Co2+、Fe2+、Na+、VB6、烟酸、叶酸、泛酸的量分别如表1.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基1.1-1.3中的有机氮源的成本分别为0.144元和0.068元、0.107元、0.109元。表1.3、培养基中矿物质和维生素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2丄2、发酵培养及检测取红霉素链霉菌As4.1245菌种加入种子培养基中，220rpm，32。C培养48h，制得种子液。分别取25ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入1.25ml种子液，然后在220rpm，32'C下，发酵培养144h，分别获得红霉素的对照和复配发酵液。分别取获得的发酵液，进行效价测定和组分测定(8000rpm，离心10min，0.45um滤膜过滤后进行测定)，测定结果显示对照实验的效价为4500U/ml,A组分含量为84X，复配实验的效价分别为4800U/ml、4650U/ml、4930U/ml，A组分含量为90X、85%、87%，根据该结果，采用复配培养基培养获得的发酵液中红霉素A的效价和组分含量均有增加，并且其中的有机氮源成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比分别降低了53%、36%、34%。2.2、复合有机氮源2-12-3用于红霉素链霉菌IAA-177的发酵2.2.1、培养基制备种子培养基2.5g淀粉，2.5g糊精，1.8g黄豆饼粉，1.3g玉米浆，0.12g硫酸铵，0.6g碳酸钙，0.12g硫酸铵，0.3g氯化钠，0.12g石肖酸铵，0.2ml豆油，定容至100ml。对照发酵培养基3g淀粉，4g糊精，0.2g硫酸铵，0.6g碳酸钙，3.0g黄豆饼粉，0.8ml豆油，定容至100ml。复配发酵培养基3g淀粉，4g糊精，0.2g硫酸铵，0.6g碳酸钙，3.6g复合有机氮源2-l、2-2或2-3，0.8ml豆油，定容至100ml。经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Co2+、Mn2+、烟酸、VB1、VB2、生物素的量分别如表2.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基2-l2-3中的有机氮源的成本分别为0.144元和0.072元、0.11元、0.0798元。表2.3、<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2.2、发酵培养及检测取红霉素链霉菌IAA-177菌种加入种子培养基中，220rpm，32'C培养48h，制得种子液。分别取25ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入1.25ml种子液，然后在220rpm，32'C下，发酵培养120h，加入50%的正丙醇0.5ml,分别获得红霉素的对照和复配发酵液。分别取获得的2种发酵液，进行效价测定和组分测定，测定结果显示对照实验的效价为4520U/ml，A组分含量为81.5%，复配实验的效价为5150U/ml、4950U/ml、5300U/ml，A组分含量为91.5%、79.3%、83.2%，根据该结果，采用复配培养基培养获得的发酵液中红霉素A的效价和组分含量均明显增加，并且有机氮源的成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比降低了50.2%、23.3%、44.6%。2.3、复合有机氮源3-l3-3用于克雷伯肺炎杆菌As1.1526的发酵2.3.1、培养基制备种子培养基(g/L):K2HP043H207.0，(NH4)2S041.0，KH2PO42.0，MgCl26H200.1，酵母膏7.0，pH7.0。对照实验发酵培养基(g/L)KC10.75，NaH2P04'2&01.3，(NH4)2S045.35，Na2SC>40.28，MgS047H200.26，柠檬酸0.42，酵母膏2.0，pH7.0。复配实验发酵培养基(g/L):KC10.75，NaH2P04'211201.3,(NH4)2S045.35，Na2S040.28，MgS047H200.26，复合有机氮源3-l、3-2或3-3，柠檬酸0.42，pH7.0。经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Zn2+、VB12、维生素A、D、E、K的含量分别如表3.3所示，IL对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基中的有机氮源的成本分别为0.036元和0.0198元、0.022元、0.0212元。表3.3、培养基中矿物质和维生素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3.2、发酵培养及检测取克雷伯肺炎杆菌AsU526菌种加入种子培养基中，37°C，200rpm厌氧培养24h，制得种子液。向5L全自动发酵罐(购自上海国强生化装备有限公司)中分别加入2L对照和复配实验发酵培养基进行发酵培养，接种量2.5%，初始甘油浓度控制在40g/L，发酵温度为37°C,pH控制在7.0，过程流加甘油控制发酵液中残留的甘油浓度，发酵时间30h，分别获得克雷伯肺炎杆菌KG1的对照和复配发酵液。取2种克雷伯肺炎杆菌As1.1526发酵液，分别测定l，3-丙二醇，检测结果显示，对照实验获得的发酵液中1,3-丙二醇浓度为52g/l，复配实验获得的发酵液中的1,3-丙二醇浓度为58g/l、56g/l、61g/l，根据该结果，复配实验获得的发酵液中的1，3-丙二醇浓度提高约11.5%，并且其中的有机氮源的成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比降低了大约45%、39%、41%。2.4、复合有机氮源4-l4-3用于黑曲霉As3.86的发酵2.4.1、培养基制备种子培养基配方20g可溶性淀粉，10g葡萄糖，lgKH2P04，1gMgS04，2gNaN03，5g酵母膏，pH4，定容至1L。对照发酵培养基配方2gKH2P04，0.2gMgSO4*71120，1.6g(NH4)2S04，麸皮为装液量的3%，pH6，定容至1L。复配发酵培养基配方2gKH2P04，0.2gMgSO47H20,1.6g(NH4)2S04,4.35g复合有机氮源4-1,4-2或者4-3,pH6，定容至1L。经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Zn2+、Mg2+、VB6、VB12、烟酸、维生素C的含量分别如表4.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基中的有机氮源的成本分别为0.0042元和0.0038元、0.0045元、0.0037元。表4.3、培养基中矿物质和维生素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4.2、发酵培养及检测取黑曲霉As3.86菌种加入种子培养基中，接种量约为孢子数2.0X108，30°C，200rpm培养44h，制得种子液。分别取15ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入75(^1种子液，然后在200rpm，30。C下，发酵培养72h，分别获得黑曲霉As3.86的对照和复配发酵液。分别取黑曲霉As3.86的对照和复配发酵液，测定发酵液中的酶活，测定结果显示，对照实验获得的发酵液中的酶活为185U/ml，复配实验获得的发酵液中的酶活为210U/ml、198U/ml、205U/ml，根据该结果，复配实验获得的发酵液中的酶活分别提高了约36.6%、25.5%、30.2%，并且成本与对照培养基的成本大致相同。综上所述，同现在通常使用的有机氮源相比，本发明提供的复合有机氮源，由于在提供含氮量的同时控制了氮源中对发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，因而可以有效的保证发酵水平，提高目标产物的含量，而且对于不同的微生物均具有较好的适用性；同时也解决了由于工业生产中氮源的产地、生产条件、生产批次的不同而成分会有很大变换所导致的发酵水平波动的问题；此外，本发明的复合氮源由多种不同价格的氮源通过不同比较复配而成，相比使用单一的氮源有利于降低氮源的成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。权利要求1、一种复合有机氮源，用于微生物发酵，其特征在于，该复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成。2、如权利要求1所述的复合有机氮源，其特征在于，所述天然氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、生物氮素、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、大豆生物营养素、鸡毛粉。3、如权利要求1所述的复合有机氮源，其特征在于，所述复配是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量。4、如权利要求3所述的复合有机氮源，其特征在于，所述矿物质包括K+，Co2+,<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>5、如权利要求3所述的复合有机氮源，其特征在于，所述维生素包括维生素Bl、B2、B6、B12，烟酸，叶酸，泛酸，生物素，脂溶性维生素A、D、E、K，维生素C，其浓度分别如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>6、一种提高微生物发酵水平的方法，其特征在于，微生物发酵培养基中的氮源采用由多种不同的天然氮源复配而成的复合有机氮源。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述天然氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、生物氮素、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、大豆生物营养素、鸡毛粉。8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述复配是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述矿物质包括K+，Co2+，Na+,Zn2+，Cu2+，Mg2+，Fe2+，Mn2+其浓度分别如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>10、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述维生素包括维生素B1、B2、B6、B12，烟酸，叶酸，泛酸，生物素，脂溶性维生素A、D、E、K，维生素C，其浓度分别如下<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>全文摘要本发明公开了一种可以用于发酵生产的新型复合有机氮源，该复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成。本发明的复合有机氮源在提供含氮量的同时控制了氮源中对发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，可以有效的保证发酵水平，提高目标组分的含量，而且适用性强。同时也解决了由于工业生产中氮源的产地、生产条件、生产批次的不同而成分会有很大变换所导致的发酵水平波动的问题；此外，由于该复合氮源是由多种不同价格的氮源通过不同比较复配而成，有利于降低成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。文档编号C12P1/02GK101225404SQ20081003307公开日2008年7月23日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者付水林,刚刘,刘必成,刘朋波,孙海燕,女宓,衡宫,徐佳杰,李雅萍申请人:华东理工大学