专利名称：一种采用核酸连接酶进行单核苷酸多态性检测的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用核酸连接酶结合电化学技术 进行单核苷酸多态性(SNP)检测的方法及试剂盒。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生变 化。SNP在基因组中分布相当广泛，研究表明在人类基因组中大约每300bp就 出现一次，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%，它意味着个人间 最小的遗传差异。SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，它与许多疾病 直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此SNP分析 在新药研究、个体化用药、临床检验和分子诊断等领域内存在巨大的产业价值， 并受到广泛的关注。随着对SNP研究的广泛关注，检测技术得到了快速的发展， 出现了许多SNP检测技术。
SNP分析技术按其研究对象主要分为两大类，即①对未知SNP进行分 析，即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某遗传病的关系。检测未知SNP 有许多种方法可以使用，如温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、变性的高效液相色谱检测(DHPLC)、限 制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等，但这些方法 只能发现含有SNP的DNA链，不能确知突变的位置和碱基类别，要想做到 这一点，必须对那些含有SNP的DNA链进行测序。②对已知SNP进行分析， 即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行 基因诊断。对已知SNP检测的方法主要基于以下4种基本原理等位基因特异 性杂交、内切酶酶切技术、引物延伸法、寡核苷酸连接反应。
SNP研究现在正处于发展之中，虽然它有很好的前景，但目前仍存在不少 问题。其主要原因在于目前虽然有大量检测SNP的方法，但大都价格昂贵，速 度较慢，这限制了其在实际中的应用，所以目前迫切需要开发低成本，高生产率的新检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性 (SNP)的方法。
本发明的另一目的在于提供一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态 性的芯片以及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态
性(SNP)的方法，所述方法包括
(a) 提供一种芯片，所述的芯片包括基片，所述的基片表面是一金属基 面，其上具有区域l，区域2，区域3，和/或区域4，其中，
区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针， 区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针， 区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针， 区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针，
其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的 5-100bp(较佳的10-100bp;更佳的15-30bp)碱基与所述待测核酸第x位碱基之 后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补；当所述捕获探针的游离 端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp(较佳的10-100bp;更佳的15-30bp) 碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补；
(b) 将待测核酸、信号探针和核酸连接酶加样于所述芯片的区域1，区域2， 区域3和区域4，进行连接反应；
其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，所述信号探针的序列自5端起 的5-100bp(较佳的10-100bp;更佳的15-30bp)碱基与待测核酸第x位碱基之前 且与该第x位碱基相邻的5-100bp(较佳的10-100bp;更佳的15-30bp)碱基特异 性互补，且所述的信号探针的3末端连接有电流反应检测信号；当所述捕获探 针的游离端为5端时，所述信号探针的序列自3端起的5-100bp(较佳的 10-100bp;更佳的15-30bp)碱基与待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基 相邻的5-100bp(较佳的10-100bp;更佳的15-30bp)碱基特异性互补，且所述的
6信号探针的5末端连接有电流反应检测信号；
(C)对(b)的芯片上的核酸进行变性处理，去除非固定于基片的核酸链和未 反应的信号探针；
(d)电化学法检测(c)获得的芯片上区域1，区域2，区域3，和/或区域4 的电流反应检测信号，
若电流反应检测信号位于区域1，则待测核酸第x位碱基是T;
若电流反应检测信号位于区域2，则待测核酸第x位碱基是A;
若电流反应检测信号位于区域3，则待测核酸第x位碱基是G;
若电流反应检测信号位于区域4，则待测核酸第x位碱基是C;
其中，x为11-1000000(较佳的x为15-5000;更佳的x为20-1000，最佳的 x为20-500)的正整数。
在一个优选例中，所述的捕获探针碱基数是10-150bp。
在另一优选例中，所述的信号探针碱基数是10-150bp。
在另一优选例中，所述的基片表面是一金属基面，所述的捕获探针固定于 所述的金属基面上。
在另一优选例中，所述的捕获探针是一端(优选5端)经巯基修饰的分子。
在另一优选例中，所述的捕获探针通过共价键固定于金属基面。
在另一优选例中，所述的金属选自金，铂，钯，银。
在另一优选例中，所述的所述的金属基面上每一区域具有测定电流反应用 电极。
在另一优选例中，所述的金属基面上还固定有具有通式(I)结构的化学分
子
HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I);
其中，R选自OH， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m为选自0-12 (较佳的选自0-6，更佳的选自2-3)的正整数； n为选自3-15(较佳的选自5-13，更佳的选自8-12，最佳的是ll)的正整数。 在另一优选例中，所述的化学分子包围在捕获探针的周围。 在另一优选例中，所述的化学分子作为封闭试剂，封闭固定有捕获探针的 金属基面。
在另一优选例中，所述的化学分子通过共价键固定于金属基面。 在另一优选例中，通式(I)结构的化学分子在金属基面上的固定方法是将含有1 10mM化学分子的溶液加样到固定了所述捕获探针的金属基面上，固 定1-16小时，去除多余溶液，从而获得固定有所述捕获探针和化学分子的金属 基面。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述的电流反应检测信号是特异性催化电流 反应的酶，并且步骤(d)的检测过程包括
将所述特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子传递媒介加样于区域1， 区域2，区域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流反应信号，从而确定电 流反应检测信号的存在区域。
在另一优选例中，步骤(b)中，所述的电流反应检测信号是酶联免疫可偶联 分子，并且步骤(d)的检测过程包括
将"酶联免疫可偶联分子的偶联物-特异性催化电流反应的酶"复合物加 样于区域l，区域2，区域3，和/或区域4，从而在酶联免疫可偶联分子末端偶 联上"酶联免疫可偶联分子的偶联物-特异性催化电流反应的酶"；
将所述特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子传递媒介加样于区域1,
区域2，区域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流反应信号，从而确定电
流反应检测信号的存在区域。
在另一优选例中，所述的特异性催化电流反应的酶选自辣根过氧化物酶 (HRP)，碱性磷酸(酯)酶(AP)，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，或葡萄糖脱氢酶。
在另一优选例中，所述的辣根过氧化物酶的底物选自邻苯二胺(OPD)、 四甲基联苯胺(TMB)或2,2 -连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(八8丁8);所述碱性 磷酸酶的底物选自对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)或5-溴-4-氯-3』引 哚-磷酸/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)。
在另一优选例中，所述酶联免疫可偶联分子选自生物素(biotin)，地高辛， 荧光素。所述酶联免疫可偶联分子的偶联物选自亲和素，抗地高辛抗体，抗 荧光素抗体。
在本发明的第二方面，提供一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态
性的芯片，所述的芯片包括
基片，所述的基片表面是一金属基面，其上具有区域l,区域2,区域3, 和/或区域4，其中，
区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针，区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针， 区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针， 区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针，
其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补；当所述捕获探针的游离端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补。
基片，所述的基片表面具有区域l，区域2，区域3，和/或区域4，其中， 区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针， 区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针， 区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针， 区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针，
其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补；当所述捕获探针的游离端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补。
在另一优选例中，所述的金属基面上还固定有具有通式(I)结构的化学分
子
HS-(CH2)n-(OC2Hs)m-R (I);
其中，R选自OH， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m为选自0-12(较佳的选自0-6，更佳的选自2-3)的正整数； n为选自3-15(较佳的选自5-13，更佳的选自8-12，最佳的是ll)的正整数。 在另一优选例中，所述的化学分子包围在捕获探针的周围。 在另一优选例中，所述的化学分子作为封闭试剂，封闭固定有捕获探针的 金属基面。
在本发明的第三方面，提供一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态 性的试剂盒，所述的试剂盒含有所述的芯片。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有信号探针；其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，所述信号探针的序 列自5端起的5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻 的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号探针的3末端连接有电流反应检测 信号；当所述捕获探针的游离端为5端时，所述信号探针的序列自3端起的 5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基 特异性互补，且所述的信号探针的5末端连接有电流反应检测信号；和/或
核酸连接酶；和/或
核酸变性试剂；和/或
电流反应检测信号的检出试剂。
图1是本发明方法的技术原理示意图。
图2是对人工合成的耙DNA检测对应的TMB氧化还原反应的循环伏安图。
图3是对人工合成的耙DNA检测对应的TMB氧化还原反应的时间电流曲 线图。
图4是四种探针在16通道芯片上的组装分布。
图5是人工合成的耙DNA在16通道中四种捕获探针对应的TMB氧化还 原反应的时间电流曲线图。
图6是图5中四种捕获探针分别对应的稳定电流平均值结果对比图。 图7是人工合成的单碱基错配的DNA序列对应的电化学电流信号对比图。
具体实施例方式
本发明人经过深入的研究，基于寡核苷酸碱基互补的特性以及寡核苷酸连 接反应的特性，首次开发出一种可方便地检测出待测核酸上某一位点的单核苷 酸多态性(SNP)的检测方法。
本发明基于的原理主要是利用核酸连接酶在互补链存在的情况下可以催
化连接核酸裂缝处的3 -OH和5 -P形成磷酸二酯键。当裂缝处的碱基发生变化 不能完全互补时，连接反应不能进行(图1)。该原理结合电化学方法用于检测时 灵敏度高，操作简便，检测效果特别优异。检测方法
技术领域：
本发明提供一种检测待测核酸第X位碱基的SNP的方法，所述方法包括
(a) 提供一种芯片，所述的芯片包括基片，所述的基片表面是一金属基 面，其上具有区域l，区域2，区域3,和/或区域4，其中分别固定有游离端末 端碱基是A、 T、 C、 G的捕获探针；其中，当所述捕获探针的游离端为3端时， 与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所述待测核酸第x位碱基之后且与该第 x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补；当所述捕获探针的游离端为5端时， 与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第 x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补；
(b) 将待测核酸、信号探针和核酸连接酶加样于所述芯片的区域1，区域2， 区域3和区域4，充分反应后去除未反应的试剂；其中，当所述捕获探针的游 离端为3端时，所述信号探针的序列自5端起的5-100bp碱基与待测核酸第x 位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号 探针的3末端连接有电流反应检测信号；当所述捕获探针的游离端为5端时， 所述信号探针的序列自3端起的5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之后且与 该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号探针的5末端连 接有电流反应检测信号；
(c) 对(b)的芯片上的核酸进行变性处理，去除非固定于基片的核酸链和未 反应的信号探针；
(d) 电化学法检测(c)获得的芯片上区域1，区域2，区域3，和/或区域4 的电流反应检测信号，从而确定待测核酸第x位碱基的多态性。
如本文所用，所述的"第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的碱基"， 是指从第x-l位碱基算起，向5端伸展的一段碱基。如，第x位碱基之前且与 该第x位碱基相邻的10bp碱基是指第x-10 x-l位的碱基。又如，当所述捕获 探针的游离端为3端时，将游离端末端碱基设为捕获探针序列的第y位，且y 大于10;则游离端末端碱基之前且与该末端碱基相邻的10bp碱基是指第y-10 y-l位的碱基。
如本文所用，所述的"第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的碱基"， 是指从第x+l位碱基算起，向3端伸展的一段碱基。如第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的10bp碱基是指第x+l x+10位的碱基。
如本文所用，"互补"的序列通常是指将5 -3方向的序列转换为其3 -5 方向的序列(如5 ATCG3 —GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA—5 CGAT 3 ，其中5 CGAT 3为5 ATCG 3的互补序列)。
所述的电流反应检测信号优选的是酶联免疫相关的电流反应检测信号，从 而可通过酶联免疫反应结合电流反应来方便地获得结果。
作为本发明的特别优选的方式，采用电化学方法来检测连接有电流反应检
测信号的信号探针是否被连接到捕获探针上。将捕获探针固定在金属基面上， 基于电化学传感的原理进行检测。所述的电流反应检测信号是一种特异性催化 电流反应的酶或可与特异性催化电流反应的酶偶联或结合。也即如果带有电 流反应检测信号的信号探针被连接到捕获探针，则在加入所述特异性催化电流 反应的酶的底物后，该酶可催化产生电流信号，通过常规方法可测得该电流信 号。
当采用电化学方法来检测时，所述的基片表面是一金属基面，所述的捕获 探针固定于所述的金属基面上。更佳的，所述的金属是与硫有共价键或成键能 力的金属(也即可发生金-硫自组装作用)，从而可将经含硫基团(如巯基)修饰 的检测分子固定到所述金属基面上。通常，所述的金属是贵金属，例如选自 金，铂，钯，银。最佳的，采用的金属是金。
作为本发明的优选方式，所述的捕获探针是一端(优选5端)经含硫基团修
饰的分子。含硫基团修饰的分子可通过化学键(如共价键)与基片表面连接，从 而将检测分子组装到基片表面上。优选的，所述的含硫基团是巯基。当所述的
金属是金时，巯基与金之间可形成的金-硫共价键。较佳的，捕获探针的5端为 巯基修饰，3端的碱基游离并存在差异，连接酶对3端的差异识别起来更加准确。
作为本发明的优选方式，利用通式(I)所示的化学分子来封闭组装有捕获探 针的金属基面。经过封闭后的传感界面具有抗非特异吸附能力强，本底电流小 的优异，可以大大提高电化学传感检测的信噪比。较佳的，通式(I)所示的化学
分子中，R是OH，该化合物也称为烷基乙氧基硫醇(SH-EG-OH);更佳的，所 述的化合物是n为ll， m为2的烷基乙氧基硫醇；或者，所述的化合物是巯基
12己醇。
作为本发明的优选方式，在组装通式(I)的分子时，较佳的是将含有l 10mM(更佳的是1.5-5 mM;最佳的是2mM左右)化学分子的溶液加样到所述组 装了检测分子的金属基面，使之铺展覆盖金属基面，封闭1-16小时(更佳的， 封闭时间在8-14小时；最佳的，封闭时间是12小时左右)，去除多余溶液，从 而获得所述的分子捕获传感界面。巯基己醇的较佳的组装浓度为0.1mM-5M， 较佳的是0.5-2mM，更佳的是lmM左右。
作为本发明的优选方式，固定所述DNA捕获探针所用的组装液为高盐浓 度的缓冲液，可选用浓度为0.3-5MNaCl溶液，以形成高密度组装层。更佳的 是用含l-3MNaCl的高盐浓度的缓冲液配制。最优选的，所述的高盐浓度的缓 冲溶液是1-3 mol/LNaCl， 8-12mMTCEP， 8-12mMTE缓冲液。
作为本发明的优选方式，所述的芯片可以是多通道的电化学芯片，较佳的 是裸金芯片，例如可以为16通道的裸金(baregold)芯片，可在16通道的裸金芯 片上分为四个区域，每个区域固定一种探针，每个区域具有独立的工作电极， 用于检测电流反应信号。
对电流反应检测信号进行检测时， 一种方式是步骤(b)中，所述的电流反 应检测信号是特异性催化电流反应的酶，并且步骤(c)的检测过程包括将所述 特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子传递媒介加样于区域1，区域2，区 域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流信号，从而确定电流反应检测信号 的存在区域。
作为另一种可选择的方式，步骤(b)中，所述的电流反应检测信号是酶联免
疫可偶联分子，并且步骤(C)的检测过程包括将"酶联免疫可偶联分子的偶联 物-特异性催化电流反应的酶"复合物加样于区域l，区域2，区域3，和/或区 域4，从而在酶联免疫可偶联分子末端偶联上"酶联免疫可偶联分子的偶联物-特异性催化电流反应的酶"；将所述特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子 传递媒介加样于区域l，区域2，区域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流 信号，从而确定电流反应检测信号的存在区域。
所述的特异性催化电流反应的酶可以是一类酶，其适合于直接或间接(如 通过偶联分子)地与信号探针连接，并且，其在与底物相互作用时，能够催化电流反应的产生。例如，所述的特异性催化电流反应的酶可以是常用于酶联免 疫反应中一些酶。
特异性催化电流反应的酶或偶联分子标记或连接到信号探针上的方法是 本领域已知的技术。
作为本发明的优选方式，所述的特异性催化电流反应的酶选自辣根过氧 化物酶(HRP)，碱性磷酸(酯)酶(AP)，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，或葡萄糖 脱氢酶等。它们均是商品化的试剂。所述的辣根过氧化物酶的底物选自邻苯 二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)或2,2'-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺 酸)(ABTS);所述碱性磷酸酶的底物选自对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)或5-溴-4-氯-3-卩引哚-磷酸/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)。更
优选的，所述的特异性催化电流反应的酶是辣根过氧化物酶；其底物是TMB 和双氧水。
所述酶联免疫可偶联分子及其偶联物是为了将特异性催化电流反应的酶 连接到信号探针上而设置的，本发明没有特别的限制，只要它们之间能够发生 偶联、且可分别与所述的酶和信号探针良好地结合，且不产生其它反作用。作 为本发明的优选方式，所述酶联免疫可偶联分子选自生物素，地高辛，荧光 素。所述酶联免疫可偶联分子的偶联物选自亲和素，地高辛抗体，抗荧光素 抗体。优选的，采用生物素和亲和素分别作为酶联免疫可偶联分子及其偶联物， 所述的信号探针的一端修饰有生物素分子，通过生物素分子与亲和素分子的结
合使特异性催化电流反应的酶和信号探针连接。
作为本发明的优选方式，采用辣根过氧化物酶催化双氧水的还原反应，通
过TMB(邻二甲基对二氨基联苯)与电极之间进行电子传递，从而方便地检测此 催化反应产生的催化电流，作为电化学检测信号。使用的电化学检测方法灵敏 度高，成本低，操作简便，从而可开发便携式检测仪器。
本发明所用的核酸连接酶可以是本领域常规用于核酸连接的酶，其在互补 链存在的情况下可以催化连接核酸裂缝处的3 -OH和5 -P形成磷酸二酯键，包 括T4DNA连接酶，热稳定连接酶等。所述的连接酶较佳的为热稳定连接酶， 它除了能够高特异性地识别错配之外，还具有能在高温下高效率连接的性能， 使得整个连接反应所需时间只要30分钟，检测时间短。更佳的连接酶是 Ampligase连接酶，它的活性相对更高，反应时间更短。作为本发明的优选方式，步骤(b)的反应在37-7(TC的温度下进行。更优选 的，所用的温度为50-60°C;最优选的约55'C。
作为本发明的优选方式，步骤(b)的反应(连接反应)所用的反应缓冲液为20 ±5 mMTris-HCl(pH8.3)， 25土5mMKCl， 10mMMgCI2， 500± 100 nM NAD， 和0.01 ±0.003% Triton X-100。更佳的，反应缓冲液中还可加入一些可产生封 闭效果的蛋白质以封闭连接反应的复杂体系可能在芯片表面产生的非特异吸 附。所述可产生封闭效果的蛋白质包括酪蛋白，BSA，牛奶等；较佳的是BSA， 加入的终浓度在0.1-5%(质量体积比，m/v)。更佳的是终浓度为0.5%。
在连接反应后，还需进行核酸变性步骤，以使在连接反应时形成的双链被 解开，去除待测核酸的核酸链，如捕获探针与信号探针发生连接反应则在芯片 上留下"捕获探针-信号探针"复合物单链；如捕获探针与信号探针未发生连接 反应则在芯片上留下"捕获探针"单链。核酸的变性是本领域人员熟知的技术。 变性可以选用比较极端的pH，高温，3M盐酸胍或者8M尿素等。较佳的，采 用碱性溶液作为变性剂，如NaOH溶液，NaOH较佳的浓度是50士20mM。
连接反应或变性结束后，可以用洗液洗去反应体系中的游离物，所用的洗 液可以是0.1MNaOH洗液。在其余的反应中可以用超纯水清洗，洗完后可用氮 气吹干。
作为本发明的优选方式，在加入特异性催化电流反应的酶之前，可以用一 些可产生封闭效果的蛋白质封闭芯片，以及防止酶的非特异吸附，降低本底噪 声。优选使用0.1-5。/。BSA溶液，更优选"/。BSA溶液。
作为本发明的优选方式，在芯片上同时设置四种不同的捕获探针(即游离端
末端为A、 T、 C禾BG)，不仅可以检测SNP，而且可以判断发生SNP处的碱基 变成了哪一个碱基。在实际应用中，可用于考察发生SNP处的碱基与疾病或者 药物反应差异的关系，直接而简单。
检测芯片和试剂盒
本发明还提供了一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的芯片，
所述的芯片包括基片，所述的基片表面是一金属基面，其上具有区域1，区
域2，区域3，和/或区域4，其中，区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获 探针，区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针，区域3固定有游离端末 端碱基是C的捕获探针，区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针；其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所 述待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补； 当所述捕获探针的游离端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所 述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补。
所述的金属基面上可包括区域1，区域2，区域3或区域4的至少1个区 域，还可以同时包括2个、3个、4个区域。较佳的，所述的金属基面上同时 包括区域l，区域2，区域3和区域4。
作为本发明的优选方式，所述的金属基面上还固定有具有通式(I)结构的化
学分子，从而可进一步提高电化学传感检测的信噪比。
本发明还提供了一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的试剂 盒，所述的试剂盒含有所述的芯片。优选的，所述的芯片的基片表面是一金属 基面；更优选的，所述的芯片的基片表面各区域上还设置有独立的可检测电流 反应信号的电化学检测用工作电极。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还含有信号探针；连接酶；核酸 变性试剂；和/或电流反应检测信号的检出试剂。
为了便于操作，所述的试剂盒中还可含有进行电化学传感检测，电流检测 或酶联免疫，芯片或电极清洗等所需的其它试剂。所述的酶联免疫试剂例如选 自辣根过氧化物酶及其底物，碱性磷酸酶及其底物，或生物素及亲和素等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或电流分析仪器等。
作为一种优选的形式，所述的试剂盒包含
1) 组装有四种DNA捕获探针的电化学芯片(优选的是裸金芯片)；
2) 标记有生物素的DNA信号探针；
3) Ampligase连接酶以及连接反应缓冲液；
4) 标记亲和素的辣根过氧化物酶；
5) 辣根过氧化物酶催化反应的底物(优选的是TMB和双氧水)。 本发明的主要优点在于
(1) 首次发现将寡核苷酸碱基互补及连接反应的特性与电化学检测技术相 结合，开发出本发明的方法，所述方法步骤简便，易于控制。
(2) 本发明结合可特异性催化电流反应的酶标记，通过电化学手段检测，
16提高了 SNP检测的灵敏度。可实现高特异性，高灵敏度，操作简便迅速的SNP 检测。
(3) 本发明的方法不仅可以方便地识别SNP，而且可以准确检测出SNP位 点上的碱基类型。
(4) 本发明的方法耗时短，整个检测过程短于l小时。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语 与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的 方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例l芯片的结构和制备
一种芯片的结构示意图如图4所示。所述的芯片包括
基片，所述的基片表面具有区域1，区域2，区域3，区域4，其中，区域 1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针，区域2固定有游离端末端碱基是T 的捕获探针，区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针，区域4固定有游 离端末端碱基是G的捕获探针。
所述的芯片的基片是金，所述的基片上各区域还可设置电化学检测电极。
实施例2在两根电极上分别进行捕获试验 1.试剂和材料
2种捕获探针DNA1， DNA2。 DNA1:
5 -SH-TTTTTTTTTTTGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAA TCACA§(SEQ ID NO: 1)-3 ;
DNA2:
5 -SH-TTTTTTTTTTTGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAA TCACAA(SEQ ID NO: 2)-3 ;信号探针DNA3:
5 -P- TGAGTGGA@GTCAACGAGCAA(SEQ ID NO: 3) -biotin-3 (其中P
是磷酸基团)；
连接酶(Ampligase)和IOX反应缓冲液购自EPICENTRE公司，其中IOX反 应缓冲液为200 mM Tris-HCl (pH 8.3)， 25 0mM KC1， lOOmM MgCl2， 5 mM NAD ，和0.1 % Triton X陽100 。
亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)，购自Roche公司，参考产品 说明书使用前用lOOmM PBS稀释成500mU/mL anti-digoxigenin-POD，并添加 0.5% (w/v)酪蛋白(casein)封闭非特异性位点；
TMB底物(TMB substrate Low activity),购自NEOGEN公司，其中含有TMB 和双氧水。
待检测的目的DNA为靶向DNA4:
TATATTGTCTTTCA(SEQ ID NO: 4)-3 。 耙向DNA4与捕获探针DNAl互补。
2.检测
本发明的检测步骤如下，其原理如图l所示。 第一步，清洗打磨电极并组装
取两根直径为2mm的金电极，清洗并打磨，用超纯水冲洗，然后用氮气 吹干，备用。
试验前配制2种DNA组装液，用2 mol/L NaCl， 10mM TCEP， 10mM TE 缓冲液，分别加入前述2条捕获探针DNAl和DNA2，配制成10pM DNA组装 液。在两根电极上分别滴加3.2nl两种DNA组装液，室温下组装l小时，用超
纯水冲洗，然后用氮气吹干。
试验前配制lOOmM的巯基己醇，组装完成后取100nl，将电极浸入，室温 放置1小时后，用超纯水冲洗，然后用氮气吹干。
第二步，进行杂交连接反应试验前，取5^1 lpM信号探针DNA3， 5^1 10X反应缓冲液(20 mM Tris-HCl (pH8.3), 25mMKCl， 10mMMgCl2， 500nMNAD，和0.01% Triton X-IOO)， 5^1 1 nM耙DNA， 25n.l 1% BSA，混合均匀后加lOp.l 0.1U/|i.l连接酶一起在 55"C预杂交1 2分钟。将组装好的电极，浸入预杂交后的溶液，然后放入加热 器中控制温度为55"C，反应20分钟。
第三步，变性
连接反应完成后，取出电极，用lOmMNaOH洗液冲洗30s后，用超纯水 冲洗然后氮气吹干。将电极浸入lOOfil 50mMNaOH，变性10分钟，然后再用 10mMNaOH洗液冲洗20s，最后用超纯水冲洗然后氮气吹干。
第四步，检测
在每根电极表面滴加3.2^1 0.5U/mL avidin-HRP，只有与靶完全互补的那根 探针才会被与信号探针连接生成末端带生物素修饰的DNA单链，可以捕获 avidin-HRP。最后用超纯水冲洗、用氮气吹干之后，检测。检测采用三电极系 统，用铂电极做对电极，银/氯化银电极做参比电极。使用CHI电化学分析仪 检测。扫描循环伏安图和时间电流曲线。
图2是扫描的两根电极的循环伏安图。扫描的电压范围是0-0.7伏。两条 捕获探针分别对应的循环伏安曲线已标出，可以看出，与靶互补的DNA1有明 显催化电流。取电压0.15V，测时间电流曲线，如图3所示。两条时间电流曲 线有明显电流差异。说明上述方法可以良好地分辨SNP。
实施例3使用芯片进行SNP检测 试剂盒包括
试验用16通道电化学裸金芯片，购自Genefluidics公司，型号 SC1000-16-B，共16组3电极系统，每一组都可以同时进行组装和检测。
4种捕获探针除了 DNA 1和DNA2，还有DNA5和DNA6。这四种DNA
的序列基本一致，只有末端碱基不同。
DNA5:
195 -SH-TTTTTTTTTTTGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAA TCACAT(SEQ ID NO: 5)-3 ;
DNA6:
5國SH-TTTTTTTTTTTGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAA TCACAG(SEQ ID NO: 6)-3 。
第一步制备四探针芯片
试验前配制四种DNA组装液，用2mol/LNaCl， 10mMTCEP， 10mMTE 缓冲液配制成10pM DNA组装液。在16通道电化学裸金芯片的每个工作电极 上分别滴加2pl组装液，室温下组装l小时，用超纯水冲洗，然后用氮气吹干。 四种探针在16通道芯片上的组装分布见图4，其中A、 T、 C、 G分别指捕获探 针的3末端分别是A、 T、 C、 G。
试验前配制100mM的巯基己醇，组装完成后分别取滴加在每个工作 电极上使溶液覆盖圆形对电极以内的区域(图4)，室温放置1小时后用超纯水冲 洗然后用氮气吹干。
该四探针芯片可被置于适当的容器中，作为检测试剂盒。
第二步，进行杂交连接反应
试验前，取5pl ljiiM信号探针DNA5， 5pl IOX反应缓冲液，5pll0nM靶 DNA， 25^.1 1。/。BSA，混合均匀后加l(Hi.l0.1U/Kl连接酶一起在55。C预杂交l 2分钟。取制好的芯片，在每个工作电极表面滴加2.5|il预杂交后的溶液，然 后放入恒温恒湿箱控制温度为55'C，反应30分钟。因为滴在芯片表面反应液 比较少，所以反应时间要比电极反应长。
第三步，变性
从恒温恒湿箱中取出芯片，用10mMNaOH洗液冲洗30s后，用超纯水冲 洗然后氮气吹干。在工作电极上滴加20nl50mMNaOH，变性10分钟，然后再 用10mMNaOH洗液冲洗20s，最后用超纯水冲洗，然后氮气吹干。
第四步，检测在每组电极上滴加20^1 1% BSA溶液使之覆盖圆形对电极以内的区域，反 应20分钟，封闭杂交层表面非特异性位点。电极上的反应无需这一步封闭， 是因为芯片上的工作电极周围圆形对电极以内的区域很容易产生吸附，尤其是 可能吸附接下来要滴在工作电极表面的HRP酶，这样会引起非特异信号增强， 可能导致假阳性。
在每个工作电极表面滴加2|_il 0.5U/mL avidin-HRP，只有与靶完全互补的 那根探针才会被与信号探针连接生成末端带生物素修饰的DNA单链，可以捕 获avidin-HRP。最后用超纯水冲洗、用氮气吹干之后，在每组电极上滴加20jal 的TMB底物(含双氧水)，使用PM3000电化学分析仪检测。
由于耙DNA在对应的位置处的碱基为G，因此与捕获探针DNA1完全互 补，也即末端碱基为C的捕获探针上可以产生信号。从图5可以看出捕获探针 DNA1对应的四条时间电流曲线(方框中4条)产生的信号明显大于其它三组 DNA的信号。
取时间电流曲线达到稳定时的电流值进行平均，得到图6，可以明显看出 末端碱基为C的捕获探针电流值明显高于其它三种捕获探针。证明本发明可以 用于快速准确检测SNP。
实施例4错配的检测
芯片的制备同实施例3，不同点在于制备四探针芯片时，在组装捕获探 针后，分别以20pl 2mM H^—垸基乙氧基硫醇(SH-(CH2)u-(C2HsO)2-OH)(溶 剂是乙醇溶液)滴加在每个工作电极上，使溶液覆盖圆形对电极以内的区域， 室温放置3小时后用超纯水冲洗然后用氮气吹干。
将待检测的目的DNA换成含有一种错配碱基的DNA7: TATATTGTCTTTCA(SEQ ID NO: 7)陽3 。
将实施例2杂交连接反应的靶DNA6换成单碱基错配DNA7，重复实验， 结果见图7。这条错配的靶正好与另一根捕获探针DNA2，也就是末端为A的 捕获探针完全互补。因此，末端碱基为C的探针上没有信号，而末端碱基为A 的探针上产生明显信号。这样，这种芯片不仅可以检测SNP，而且可以检测到发生错配处的碱基变成了哪一种碱基。
本发明上述实施例中所用的各种DNA序列都是人工合成的，均购自上海 生工生物工程有限公司。其它未特殊说明的条件按照常规条件或按照药品或以 其制造厂商所建议的条件。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110〉苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司
<120〉 一种采用核酸连接酶进行单核苷酸多态性检测的方法及试剂盒
<130> 082379
<160〉 7
<70〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 49
<212〉 醒
<213〉 人工序列
<220>
<221> misc—feature <223〉 寡核苷酸
<400〉 1
tttttttttt tg犯agaceia teitagttctt ggageiEiggtg gwtcacac 49
〈210〉 2
<211〉 49
<212〉 腿
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature <223> 寡核苷酸
<400> 2
tttttttttt tgaaagacaa tatagttctt gg柳aggtg gaatcacaa
<210〉 3
<211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223> 寡核苷酸
<400〉 3tgagtggacg tcaacgagca a
<210〉 4
〈211〉 60
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature 〈223〉 寡核苷酸
〈400〉 4
ttgctcgttg acgtccactc agtgtgattc caccttctcc aagaactata ttgtctttca 60
<210> 5
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〈212〉 藤
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223> 寡核苷酸
<400〉 5
tttttttttt tgaaagacaa tatagttctt ggagaaggtg gaatcacat
<210〉 6
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<221〉 misc—feature 〈223〉 人工序列
<400〉 6
tttttttttt tgaaagacaa tatagttctt ggag卿gtg gaatcacag
<210> 7
<211〉 60
<212> DNA
<213〉 人工序列
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<221〉 tnisc—feature <223〉 寡核苷酸
<400> 7
ttgctcgttg acgtccactc attgtgattc caccttctcc aagaactata ttgtctttca
权利要求
1.一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述方法包括(a)提供一种芯片，所述的芯片包括基片，所述的基片表面是一金属基面，其上具有区域1，区域2，区域3，和/或区域4，其中，区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针，区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针，区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针，区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针，其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所述待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补；当所述捕获探针的游离端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补；(b)将待测核酸、信号探针和核酸连接酶加样于所述芯片的区域1，区域2，区域3和区域4，进行连接反应；其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，所述信号探针的序列自5端起的5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号探针的3末端连接有电流反应检测信号；当所述捕获探针的游离端为5端时，所述信号探针的序列自3端起的5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号探针的5末端连接有电流反应检测信号；(c)对(b)的芯片上的核酸进行变性处理，去除非固定于基片的核酸链和未反应的信号探针；(d)电化学法检测(c)获得的芯片上区域1，区域2，区域3，和/或区域4的电流反应检测信号，若电流反应检测信号位于区域1，则待测核酸第x位碱基是T；若电流反应检测信号位于区域2，则待测核酸第x位碱基是A；若电流反应检测信号位于区域3，则待测核酸第x位碱基是G；若电流反应检测信号位于区域4，则待测核酸第x位碱基是C；其中，x为11-1000000的正整数。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的金属基面上每一区域具 有测定电流反应用电极。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的金属基面上还固定有具 有通式(I)结构的化学分子HS-(CH2)n-(OC2H5)m-R (I); 其中，R选自OH， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5， OCH2COOH， NH2; m为选自0-12的正整数； n为选自3-15的正整数。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的金属选自金，铂，钯 或银。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的电流反应 检测信号是特异性催化电流反应的酶，并且步骤(d)的检测过程包括将所述特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子传递媒介加样于区域1, 区域2，区域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流反应信号，从而确定电 流反应检测信号的存在区域。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的电流反应 检测信号是酶联免疫可偶联分子，并且步骤(d)的检测过程包括将"酶联免疫可偶联分子的偶联物-特异性催化电流反应的酶"复合物加样于区域l，区域2，区域3，和/或区域4，从而在酶联免疫可偶联分子末端偶 联上"酶联免疫可偶联分子的偶联物-特异性催化电流反应的酶"；将所述特异性催化电流反应的酶的底物和/或电子传递媒介加样于区域1， 区域2，区域3，和/或区域4;检测各区域产生的电流反应信号，从而确定电 流反应检测信号的存在区域。
7. —种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的芯片，其特征在于， 所述的芯片包括基片，所述的基片表面是一金属基面，其上具有区域l，区域2，区域3， 和/或区域4，其中，区域1固定有游离端末端碱基是A的捕获探针， 区域2固定有游离端末端碱基是T的捕获探针， 区域3固定有游离端末端碱基是C的捕获探针，区域4固定有游离端末端碱基是G的捕获探针，其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补；当所述捕获探针的游离端为5端时，与所述末端碱基相邻的5-100bp 碱基与所述待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基特 异性互补。
8. 如权利要求7所述的芯片，其特征在于，所述的金属基面上还固定有具 有通式(I)结构的化学分子HS-(CH2)n-(OC2H5)ra-R (I); 其中，R选自OH， H， OCH3， CH3， OC2H5， C2H5, OCH2COOH， NH2; m为选自0-12的正整数； n为选自3-15的正整数。
9. 一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在 于，所述的试剂盒含有权利要求7-8任一所述的芯片。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有 信号探针；其中，当所述捕获探针的游离端为3端时，所述信号探针的序列自5端起的5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之前且与该第x位碱基相邻 的5-100bp碱基特异性互补，且所述的信号探针的3末端连接有电流反应检测 信号；当所述捕获探针的游离端为5端时，所述信号探针的序列自3端起的 5-100bp碱基与待测核酸第x位碱基之后且与该第x位碱基相邻的5-100bp碱基 特异性互补，且所述的信号探针的5末端连接有电流反应检测信号；和/或核酸连接酶；和/或核酸变性试剂；和/或电流反应检测信号的检出试剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性(SNP)的方法。本发明还公开了检测待测核酸第x位碱基的单核苷酸多态性的芯片以及试剂盒。本发明的方法将寡核苷酸碱基互补及连接反应的特性与多通道电化学高通量、检测快速的特点相结合，可以迅速且准确地检测出SNP位点的碱基类型。
文档编号C12Q1/68GK101608214SQ20081003922
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者莹 万, 宋世平, 炯 张, 樊春海 申请人:苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司