专利名称：：一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法
技术领域：
：本发明涉及一种质粒载体的构建方法。
背景技术：
：现有的酿酒酵母生产乙醇均是以己糖为原料，由于酿酒酵母缺乏代谢木糖的两种关键酶——木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)，所以不能使木糖代谢后产生乙醇。
发明内容本发明的目的是为了解决目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题，而提供的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法。本发明表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、以休哈塔假丝酵母基因组为模板克隆^^2基因；二、回收、纯化;j72基因片段后与pGMTvector载体在16-C的条件下连接1012h，得到pGMT-xyl2;三、重组质粒p406ADHl-l的构建，克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以酿酒酵母整合载体p406ADHl为骨架引入ADHt基因；四、重组质粒p406ADHl-2的构建，克隆质粒pKT0150中的KanR基因，再将KanR基因加入质粒p406ADHl-l;五、重组质粒p406ADHl-3的构建，克隆酿酒酵母中的rDNA基因，再将rDNA基因加入质粒p406ADHl-2;六、将xy72基因加入质粒p406ADHl-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5，-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3，，下游引物序列为5，-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3，；步骤三中ADHt基因序列扩增上游引物序列为5'誦AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3，，下游弓|物序歹!j为5'-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，；步骤四中KanR基因扩增上游引物序列为5，-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3，，下游引物序列为5'-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3，；步骤五中rDNA基因扩增上游引物序列为5，-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3，，下游引物序列为5,誦TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT腸3，。本发明构建了表达木糖醇脱氢酶基因的质粒，用本发明构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母工业菌株得到的重组菌HDTG-;qy/2能够产生休哈塔假丝酵母中Ay/2基因编码的木糖醇脱氢酶(XDH)，其木糖醇脱氢酶活力较出发菌株大大提高，出发菌株不产生木糖醇脱氢酶，重组菌株的木糖醇脱氢酶的酶活为1.51U/mg，酶活力提高，表明构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达。对本发明构建了表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母进行稳定性测定，结果现实60世代后的稳定性为99%,在非选择性压力下，整合于酿酒酵母染色体上的外源基因片断具有良好的遗传稳定性，能适合用于工业生产的粗放环境。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、以休哈塔假丝酵母基因组为模板克隆xy72基因；二、回收、纯化xy72基因片段后与pGMTvector载体在16'C的条件下连接10~12h，得到pGMT-:cj;/2;三、重组质粒p406ADHl-l的构建，克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以酿酒酵母整合载体p406ADHl为骨架引入ADHt基因；四、重组质粒p406ADHl-2的构建，克隆质粒pKT0150中的KanR基因，再将KanR基因加入质粒p406ADHl-l;五、重组质粒p406ADHl-3的构建，克隆酿酒酵母中的rDNA基因，再将rDNA基因加入质粒p406ADHl-2;六、将义/22基因加入质粒p406ADHl-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒，其中步骤一中扩增上游引物序列为5'-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3，，下游引物序列为5'國TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3，；步骤三中ADHt基因序列扩增上游引物序列为5'-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3，，下游引物序列为5'-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，；步骤四中KanR基因扩增上游引物序列为5，-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3，，下游引物序列为5，-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3，；步骤五中rDNA基因扩增上游引物序列为5'腸CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3，，下游引物序列为5，-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3,。本实施方式步骤二用上海华舜生物工程有限公司生产的DNA胶回收试剂盒(GelExtractionMiniKit)进行回收。本实施方式步骤一在引物的两端加入XbaI和XhoI的酶切位点；步骤三在引物的两端加入Xhol和Kpnl的酶切位点；步骤四在引物的两端加入KpnI和NdeI的酶切位点；步骤五在引物的两端加入NdeI的酶切位点；步骤六将pGM-和p406ADHl-3用XbaI禾QXhoI双切酶切后再进行连接。本实施方式质粒pKT0150购自于Addgene公司，休哈塔假丝酵母基因组DNA利用天净沙公司的真菌基因组DNA提取试剂盒得到。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式步骤二至六参见试剂盒使用操作手册。本实施方式步骤二至六各步骤得到的质粒经PCR验证后可转化入DH5a中保存和扩增。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中PCR反应体系为IO^aL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/^L的上游引物、l^iL浓度为lpmol/nL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94'C7min，变性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°C1.5min，共30个循环，延伸72。C10min。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中PCR反应体系为50|aL由5^L10xPCRbuffer、4pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、5pL浓度为lpmol/nL的上游引物、5pL浓度为lpmol&L的下游引物、4pL浓度为25mmol/L的MgCl2、IO^iL模板DNA、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°Cl.5min，共30个循环，延伸72。Cl0min。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中所用10xPCRbuffer中不含有Mg2+。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中"72基因片段与pGMTvector载体的连接体系为lOpL由5^iL的基因、lpLpGM-Teasy载体、lpLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中克隆ADHt基因的PCR反应体系为10pL由luL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l(iL浓度为lpmol/pL的上游引物、l^iL浓度为lpmol/nL的下游引物、0.8(xL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94°C7min，变性94°C45s，退火49°C30s，延伸72°C45s，共30个循环，延伸72'C10min。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中ADHt基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-A，然后用限制性内切酶XhoI和KpnI对pGM-A和p406ADHl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-l。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式ADHt基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为lOpL由5pL的ADHt基因、l^LpGMTvector载体、lpLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-A的双切酶体系为20pL由5pL浓度为lpg/nL的pGM-A、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、l^iLKpnI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl的双切酶体系为20mL由5pLp406ADHl、2&10xPCRbuffer、lpLXhoI、lpLKpnI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-A和p406ADHl的连接体系为lOpL由2pLpGM-A、2pLp406ADHl、lMLLigase和余量无菌去离子水组成。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中克隆的KanR基因的PCR反应体系为10^L由lpL10xPCRbuffer、0.8nL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/^iL的上游引物、l^L浓度为lpmol/^L的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94°C7min，变性94。Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s,共30个循环，延伸72'Cl0min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中KanR基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-K,然后用限制性内切酶KpnI和NdeI对pGM-K和p406ADHl-l分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-2。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式KanR基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为10pL由5pL的KanR基因、lpLpGMTvector载体、lpLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-K的双切酶体系为20pL由5pL浓度为lng/^iL的pGM-K、2pL10xPCRbuffer、lpLKpnI、l^LNdeI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-l的双切酶体系为20pL由5pLp406ADHl-l、2jxL10xPCRbuffer、lpLKpnI、lnLNdeI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-K和p406ADHl-l的连接体系为lO^iL由2|xLpGM-K、2jiLp406ADHl-l、lpLLigase和余量无菌去离子水组成。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤五中克隆的rDNA基因的PCR反应体系为IO^iL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5腿ol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/^iL的上游引物、lML浓度为lpmol/^L的下游引物、0.8^iL浓度为25mmol/L的MgCl2、2|iL的酿酒酵母、0.2^L浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94°C7min，变性94。C2min，退火45。Clmin，延伸72°C2min，共35个循环，延伸72'Cl0min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤五中rDNA基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-R，然后用限制性内切酶NdeI对pGM-R和p406ADHl-2分别进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-3。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式rDNA基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为10pL由5pL的rDNA基因、lpLpGMTvector载体、lpLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R的单切酶体系为20nL由5pL浓度为1pg/nL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-2的单切酶体系为20^L由5pLp406ADHl-2、2pL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R和p406ADHl-2的连接体系为lO^iL由2pLpGM-R、2pLp406ADHl-2、lpLLigase和余量无菌去离子水组成。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤六中用限制性内切酶XbaI禾HXhoI对pGM-R和p406ADHl-3分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。本实施方式pGM-R的双酶切体系为20nL由5pL浓度为1pg4iL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-3的双酶切体系为20pL由5^Lp406ADHl-3、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R和p406ADHl-3连接体系为10joL由5jiL的pGM-R基因、l|iLp406ADHl-3载体、lpLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤一中PCR反应体系为lOpL由lpL10xPCRbuffer、0.8nL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、1^L浓度为lpmol/^iL的下游引物、0.8^L浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2^L浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°Clmin，退火42。Clmin,延伸72°C1.5min，共30个循环，延伸72。C10min;步骤一中PCR反应体系为50^iL由5joL10xPCRbuffer、4pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、5pL浓度为lpmol4iL的上游引物、5pL浓度为lpmol/^L的下游引物、4pL浓度为25mmol/L的MgCl2、10pL模板DNA、0.2^iL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°C1.5min，共30个循环，延伸72。C10min;步骤二中^72基因片段与pGMTvector载体的连接体系为lO^L由5pL的基因、1^LpGM-Teasy载体、ljxLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成；步骤三中克隆ADHt基因的PCR反应体系为10^L由1pL10xPCRbuffer、0.8nL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、1^iL浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的质粒pKT0150、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°C45s，退火49。C30s，延伸72°C45s，共30个循环，延伸72°C10min;步骤三中ADHt基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-A，然后用限制性内切酶XhoI和KpnI对pGM-A和p406ADHl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-l;步骤四中克隆的KanR基因的PCR反应体系为IOjiL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/^L的上游引物、lpL浓度为lpmol/VL的下游引物、0.8nL浓度为25mmol/L的MgCl2、2|xL的质粒pKT0150、0.2nL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94-C7min，变性94°Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s,共30个循环，延伸72°C10min;步骤四中KanR基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-K，然后用限制性内切酶KpnI和NdeI对pGM-K和p406ADHl-l分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-2;步骤五中克隆的rDNA基因的PCR反应体系为10pL由lpL10xPCRbuffer、0.8nL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^L浓度为lpmol/pL的上游引物、lpL浓度为lpmol^iL的下游引物、0.8jiL浓度为25mmol/L的MgCl2、2|aL的酿酒酵母、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°C2min，退火45°Clmin,延伸72°C2min，共35个循环，延伸72-Cl0min;步骤五中rDNA基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-R，然后用限制性内切酶NdeI对pGM-R和p406ADHl-2分别进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-3;步骤六中用限制性内切酶XbaI和XhoI对pGM-R和p406ADHl-3分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式中用到的lOxPCRbuffer中不含有Mg2+。本实施方式ADHt基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为lO^L由5pL的ADHt基因、lpLpGMTvector载体、1mLT4逢接酵、l^L10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-A的双切酶体系为20nL由5nL浓度为liag^L的pGM-A、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、l^LKpnI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl的双切酶体系为20pL由5pLp406ADHl、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、lpLKpnI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-A和p406ADHl的连接体系为IO^iL由2nLpGM-A、2jjLp406ADHl、lpLLigase和余量无菌去离子水组成。本实施方式KanR基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为lOpL由5pL的KanR基因、l^LpGMTvector载体、lpLT4连接酶、ljiL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-K的双切酶体系为20pL由5pL浓度为1pg^iL的pGM-K、2pL10xPCRbuffer、lpLKpnI、l]iLNdeI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-l的双切酶体系为20pL由5pLp406ADHl-l、2pLlOxPCRbuffer、lpLKpnI、l^iLNdeI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-K和p406ADHl-l的连接体系为10|iL由2|_iLpGM-K、2pLp406ADHl-l、IkiLLigase和余量无菌去离子水组成。本实施方式rDNA基因与质粒载体pGMTvector的连接体系为10nL由5pL的rDNA基因、l^LpGMTvector载体、lnLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R的单切酶体系为20^L由5pL浓度为l吗/^L的pGM-R、2nL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-2的双切酶体系为20pL由5pLp406ADHl-2、2jxL10xPCRbuffer、2^LNdeI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R和p406ADHl-2的连接体系为10ixL由2nLpGM-R、2pLp406ADHl-2、lpLLigase和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R的双酶切体系为20pL由5pL浓度为1pgVL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量无菌去离子水组成；p406ADHl-3的双酶切体系为20pL由5pLp406ADHl-3、2pL10xPCRbuffer、l^LXbaI、lpLXhoI和余量无菌去离子水组成。本实施方式pGM-R和p406ADHl-3连接体系为10pL由5pL的pGM-R基因、lpLp406ADHl-3载体、ljiLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。将本实施方式得到的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化成酿酒酵母，并进行以下实验A、考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量1、大肠杆菌及其转化子用50mL培养基培养至稳定生长期(llh左右)，有抗性的菌株相应的培养基中加入抗性；2、取上述培养液100mL，在4'C的条件下以5000r/min的速度离心3min，收集菌体，离心管中加入40mL生理盐水，洗涤菌体，重复3次，最后用40mL缓冲溶液重悬菌体，取样，适当稀释后用血球计数板镜检计数，计算菌悬液的菌体浓度(cells/mL)，记为NO;3、超声波处理将上述重悬液转移至50mL离心试管中，冰浴下进行超声波处理。处理条件功率300W，0>2变幅杆，变幅杆的末端插入液面下约15mm处，超声波处理5s，间歇10s，全程20min。采用血球计数板镜检计数，计算超声波处理后的菌体浓度(cells/mL)，记为Nl，并计算破壁率(l-N1/NO);4、当破壁率〉90%时，将超声波处理后的菌悬液30000xg,4'C下离心10min，收集上清，分装于1.5mL的eppendorf管中，直接取样测定酶活，或一20'C存放，使用时取出。若破壁率<90%，继续破壁处理；5、取6支试管，按表l加入试剂。O号管为空白对照管。14号管分别加有不同已知量的标准蛋白质(BSA)，用以制作标准曲线。5号管是待测样品管。用0号管调分光光度计零点，测量其它各管的OD595值。以BSA浓度(或含量)为橫坐标，对应的OD595值为纵坐标，绘制标准蛋白质曲线。根据待测样品测得的OD595值，由标准蛋白质曲线读出样品的蛋白质含量。从表1可以看出本实施方式表达木糖醇脱氢酶基因的质粒所制备的粗酶液中不含其它蛋白，木糖醇脱氢酶的浓度为10nL/mL。(酶粗液蛋白质含量的测定按照蛋白质含量测定试剂盒操作说明进行。)表l_试管编号_01234样品5xCBB(pL)400400400棚4004000.5mg/mLBSA(^L)020406080—待测样品液OiL)—一—一一20H20_至2mL至2mL至2mL至2mL至2mL至2mLB、转化酵母1、G418抑菌浓度的测定将OD600达到0.4的酿酒酵母菌株涂布到配置好的含有不同浓度梯度的G418的YPD平板上，(终浓度200、400、600、800、1000、1200pg/mL)每个平板涂布200pL菌液，3(TC培养48h。观察抑制酵母菌生长的最低G418浓度；2、受体菌的前处理将酿酒酵母菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线，将单菌落接种于lOmLYPD液体培养基，3(TC180rpm摇床培养过夜。测定菌液的OD值，使其稀释至50mL时OD600达到0.4，继续培养24h;3、醋酸锂转化法将酵母菌培养液在无菌条件下室温i500g离心5min弃上清，加入40mLlxTE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500g离心5min弃上清，加入2mLlxLiAc/0.5xTE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10min。在一无菌离心管中分别加入100nL经过处理的酵母菌悬液，IOO吗变性鲑精DNA,l吗本实施方式构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒，700jiLlxLiAc/40%PEG-4000/lxTE混合。同时取另一无菌离心管，分别加入lOO^L经过处理的酵母菌悬液，IOO吗变性鲑精DNA，700pLlxLiAc/40。/。PEG-4000/lxTE混合，作为对照。30。C反应30min，加88nLDMSO原液，混合均匀，40。C水浴7min,13000r/min离心10s弃上清，lxTE洗涤沉淀两次(加lmLTE洗漆，14000r/min离心10s，吸取上清)，加入50100kiLlxTE，稀释后涂布于含有G418的平板上3(TC培养2d;4、转化子稳定性测定酵母转化子接种40mLYPD液体培养基中，不同时间取样，系列稀释，分别在YPD和含G418的YPD平板上菌落计数，分别记为总菌数和带有整合质粒的菌落数，以下式计算质粒稳定性稳定性(％)=(带有整合质粒的菌落数+总菌数)xl00%将高拷贝转化子HDTG-;^/2，接种到YPD液体培养基即在非选择性压力下摇瓶培养60世代(每24h为10世代)。每隔10世代，平板计数菌落数进行稳定性测定按公式计算，结果显示60世代后的稳定性为99%，表明在非选择性压力下，整合于酿酒酵母染色体上的外源基因片断具有良好的遗传稳定性，能适合用于工业生产的粗放环境。C、木糖醇脱氢酶酶活测定以lmL反应液在340nm下检测NAD被还原的量(即在340mn做时间扫描)。酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NAD+的pmol/L数即U/mg蛋白，反应体系如表2所示。表2木糖醇脱氢酶酶活测定体系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>酶活测定结果显示，构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母工业菌株得到的重组菌HDTG-矽/2，其木糖醇脱氢酶活力较出发菌株HDTG-1大大提高，出发菌株不产木糖醇脱氢酶，重组菌株的酶活力为1.51U/mg，酶活力提高，表明本实施方式构建的表达木糖醇脱氢酶基因的质粒转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达，表达载体构建成功。序列表<110>黑龙江大学<120>—种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法<160〉8<210>1<211〉32<212〉腿<213>人工序列〈220〉<221〉misc一feature<222>(18，24,30)<223〉r=g或a，m=a或c，w=a或t<220>〈223>根据休哈塔假丝酵母基因组DNA设计的基因PCR扩增上游引物。<400>1tgttctagaatgactgcwaacccwtcmttrgt32〈210>2〈211〉32<212>腿<213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature<222>(10，13,16，18，22，27，30)〈223>r=g或a，nFa或c，w-a或t，y-t或c,k=g或t〈220〉<223>根据休哈塔假丝酵母基因组DNA设计的基因PCR扩增下游引物。〈400>2tatctcgagytaytcwggrccrtcaatkarac32<210>3〈211〉27<212>腿<213〉人工序列<220>〈223〉根据质粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1终止子片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增上游引物。<400〉3aatctcgagtttgttactgctgctggt27〈210〉4〈211>28〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据质粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1终止子片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增下游引物。<400〉4tatggtacccaagactgtcaaggaggg28〈210〉5〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>根据质粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增上游引物。〈400〉5ttaggtacctctgtttagcttgcct25〈210>6<211>26<212〉賺〈213>人工序列<220>〈223〉根据质粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因片段在质粒中的相对位置设计的PCR扩增下游引物。〈400>6tatcatatgtatcatcgatgaattcg26〈210>7<211〉30〈212〉隨〈213〉人工序列〈220><223>根据酿酒酵母中的rDNA基因设计的PCR扩增上游引物。〈400〉7ctgcatatgggaacctctaatcattcgctt30〈210〉8〈211〉29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>根据酿酒酵母中的rDNA基因设计的PCR扩增下游引物。〈400>8tcaatatgaacgaacgagaccttaacct29权利要求1、一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行一、以休哈塔假丝酵母基因组为模板克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMTvector载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-xyl2；三、重组质粒p406ADH1-1的构建，克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入ADHt基因；四、重组质粒p406ADH1-2的构建，克隆质粒pKT0150中的KanR基因，再将KanR基因加入质粒p406ADH1-1；五、重组质粒p406ADH1-3的构建，克隆酿酒酵母中的rDNA基因，再将rDNA基因加入质粒p406ADH1-2；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3’，下游引物序列为5’-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3’；步骤三中ADHt基因序列扩增上游引物序列为5’-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤四中KanR基因扩增上游引物序列为5’-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3’，下游引物序列为5’-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3’；步骤五中rDNA基因扩增上游引物序列为5’-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3’，下游引物序列为5’-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。2、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤一中PCR反应体系为lOpL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1^iL浓度为lpmol/pL的上游引物、lpL浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2^iL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成;PCR反应条件:预变性94。C7min，变性94。Clmin，退火42。Clmin,延伸72°C1.5min，共30个循环，延伸72。C10min。3、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤一中PCR反应体系为50pL由5nL10xPCRbuffer、4pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、5|xL浓度为lpmol/nL的上游引物、5|止浓度为lpmol/pL的下游引物、4pL浓度为25mmol/L的MgCl2、10pL模板DNA、0.2^L浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94°C7min，变性94。Clmin，退火42°Clmin，延伸72°CL5min，共30个循环，延伸72。C10min。4、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤二中x^2基因片段与pGMTvector载体的连接体系为10pL由5nL的^^2基因、l(oLpGM-Teasy载体、1(xLT4连接酶、lpL10x连接缓冲液和余量无菌去离子水组成。5、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤三中克隆ADHt基因的PCR反应体系为IO^iL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/|iL的上游引物、1HL浓度为lpmol/jiL的下游引物、0.8mL浓度为25mmol/L的MgCl2、2^iL的质粒pKT0150、0.2i!L浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94"C7min，变性94°C45s，退火49°C30s，延伸72°C45s，共30个循环，延伸72'C10min。6、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤三中ADHt基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-A，然后用限制性内切酶XhoI和KpnI对pGM-A和p406ADHl分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-l。7、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤四中克隆的KanR基因的PCR反应体系为10pL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、l^iL浓度为lpmol/pL的上游引物、l^L浓度为lpmol/nL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的质粒pKT0150、0.2|iL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s，共30个循环，延伸72。Cl0min。8、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤四中KanR基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-K，然后用限制性内切酶KpnI和NdeI对pGM-K和p406ADHl-l分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-2。9、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤五中克隆的rDNA基因的PCR反应体系为10pL由1^iL10xPCRbuffer、0.8pL浓度为2.5mmol/L的dNTP、lpL浓度为lpmol/pL的上游引物、1jiL浓度为lpmol/pL的下游引物、0.8pL浓度为25mmol/L的MgCl2、2pL的酿酒酵母、0.2pL浓度为5U/mL的Taq酶和余量重蒸馏水组成；PCR反应条件预变性94。C7min，变性94°C2min，退火45。Clmin，延伸72°C2min，共35个循环，延伸72。Cl0min。10、根据权利要求1所述的一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤五中rDNA基因与质粒载体pGMTvector连接制备重组质粒pGM-R，然后用限制性内切酶NdeI对pGM-R和p406ADHl-2分别进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒p406ADHl-3。全文摘要一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题。构建方法一、克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMTvector载体连接，得到pGMT-xyl2；三、重组质粒p406ADH1-1的构建；四、重组质粒p406ADH1-2的构建；五、重组质粒p406ADH1-3的构建；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒。本发明方法所构建的载体转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达。文档编号C12N15/66GK101302534SQ200810064830公开日2008年11月12日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者凌宏志,刚宋,平文祥,杜春梅,雪洛,葛菁萍,丹赵,高冬妮申请人:黑龙江大学