专利名称：一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，通过向反应体 系中直接添加低浓度的有机溶剂或者表面活性剂，以增加细胞膜的通透性，促进微生 物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸，从而提高腺苷甲硫氨酸的产量，涉及利用微生物全 细胞催化合成高价值化合物的技术领域。
背景技术：
S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine. SAM、 SAMe或AdoMet)，是广泛 存在于细胞内参与许多关键生化反应的東要生理活性物质，与人体中许多代谢过程密 切相关，主要参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢以及 抗氧化剂谷胱甘肽的形成，与体内各种解毒过程关系密切，是维护细胞膜正常功能、 人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。对抑郁症、关节炎、纤维头痛等许多 疾病疗效显著，可明显消除肝损伤，有利于肝病患者的康复。1999年，美国FDA批准 SAM作为保健品上市，在美国已成为最畅销的营养品之一。近年来，国外已转向利用 SAM对肝脏疾病和抑郁症患者进行治疗，成为治疗肝病和抑郁症的理想药物，其市场 需求量不断增加。2000年我国开始进口，每年有l亿多元的销售，市场前景看好。目前 国内使用的SAM主要是德国基诺(Knoll)和意大利RADIUMFARMAS.R丄.(IT)两个 外资公司的产品，其价格昂贵，不能普及使用。我国人口众多，有相当数量的肝病和 关节炎患者，且随着城市生活节奏加快和工作压力加大，抑郁症患者明显增多。同时 SAM具有副作用小，疗效显著等特点，在我国必将有着巨大的应用前景。
SAM是双手性物质，有两种异构体(+)SAM和(-)SAM，在体内只有(-)SAM具 有生物活性。目前的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。化学法
由于存在产率低、底物昂贵以及环境污染等问题，现已基本不用；发酵法是近年来国 内外工业化生产SAM的主要途径，但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率
低、生产周期长以及纯化工艺复杂等，从而导致了其价格居高不下，限制了 SAM的 广泛生产及应用；酶促转化法与化学合成法和发酵法相比，具有底物转化率高、产物 积累量高、分离提纯容易、反应周期短及环境友好等优点，因而是较为有效的工业化 生产方法。然而SAM合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低、且分离纯化 困难，因此通过酶促转化法生产SAM受到SAM合成酶活力的限制。基因工程的发展 使获得大量高活性的SAM合成酶成为可能，但是在工业化规模上提取大量SAM合成 酶以及对酶进行固定化无疑大大增加了企业生产成本，并且SAM合成酶在纯化及固 定化过程中酶的活性会遭到一定的损失。
在申请号为200810017357.5的专利文献中，公开了一种重组微生物全细胞催化合 成SAM的方法。利用全细胞催化合成SAM可以减少企业生产成本，提高酶的稳定性 和利用率，得到高纯度的产物。随着重组SAM合成酶表达量的不断提高，采用基因 工程和固定化细胞等技术相结合的方法实现大规模、低成本全细胞催化合成SAM会' 具有很大的工业化前景。与使用游离酶或者固定化酶进行SAM合成相比，在全细胞 生物催化中，细胞内的酶源更为稳定。但是由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应 底物和产物难于自由进入细胞，生物催化的效率明显低于纯酶催化反应体系，因而如 何尽可能地提高细胞膜的通透性而又不影响细胞膜的完整性以及细胞内酶的活性就显 得至关重要。目前提高细胞通透性的处理方法主要包括超声波、冻融等物理方法以及 有机溶剂和表面活性剂等化学方法，这些方法主要是对微生物细胞进行细胞膜的通透 性预处理，处理方法一般为离心一通透性处理一离心一洗涤等操作，处理过程较为繁 琐。同时在对微生物细胞进行通透性处理时，通透剂的甩量很难把握，如果通透剂的
用量较小，细胞膜的通透性比较低；如果通透剂的用量较大，经常会出现细胞膜的过 度损伤和细胞的裂解等现象，导致细胞内酶的丢失，降低了微生物细胞生物催化的效 率，细胞催化反应的酶活性半衰期减小。
发明内容
在微生物全细胞催化反应过程中，为了避免高浓度通透剂对细胞进行通透处理时 造成的损伤，本发明提出一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，通过 向微生物全细胞催化合成SAM的反应体系中直接添加低浓度的通透剂，以解决微生 物全细胞催化合成SAM过程中存在的高浓度通透剂对细胞损伤较大的问题。
技术方案
一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于步骤如下 步骤1、发酵培养能表达腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物细胞，发酵过程中培养
液的温度维持在15~38°C，发酵液经6000 rpm离心10 min后，用蒸馏水洗涤1次 收集微生物细胞；
步骤2、以离心收集的微生物细胞作为酶源，同时向催化合成腺苷甲硫氨酸的 反应液中添加通透剂，以三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸为原料催化合成腺苷甲硫氨酸， 反应液的温度维持在35'C， 120rpm反应8h，反应体系中菌体浓度为150 g湿菌体 /L;所述通透剂在合成腺苷甲硫氨酸反应液中的体积百分终浓度为0.25% 2.5%; 所述的反应液为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液100 mmol丄—1、三磷酸腺苷10~35 mmol丄"、L-甲硫氨酸10 35 mmol丄-1、氯化钾100 mmo11/1、硫酸镁20 70 mmoll/1 和对甲基苯磺酸钠400-800 mmol丄-1，全部溶解后调至pH 7.0。
所述的通透剂为有机溶剂或表面活性剂；所述的有机溶剂为甲苯或二甲苯，所 述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
所述的甲苯在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为0.5%。 所述的二甲苯在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为1%。 所述的十六烷基三甲基溴化铵在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为
0.5%。
所述的微生物为包含有来源于大肠杆菌Eyc/zen'c/nh co//腺苷甲硫氨酸合成酶基因 的重组大肠杆菌细胞。 有益效果
本发明提出了一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，有益效果可 归纳如下在使用微生物全细胞催化合成SAM过程中，对微生物细胞膜进行通透性
的方法主要包括将细胞用较高浓度的有机溶剂或者表面活性剂进行处理、离心以及洗
漆等繁琐程序。本发明简化了制备SAM过程中的微生物细胞膜通透化处理程序，而 只是向合成SAM的反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或者表面活性剂，以提高 细胞的通透性。不再进行繁琐的离心、洗涤等程序，并且避免了高浓度的通透剂对细 胞的损伤甚至细胞的裂解，导致细胞内SAM合成酶的损失，最终SAM的产量达到 13.4 g/L。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作进一步描述 试验材料和方法 1.细胞和试剂
大肠杆菌K12、大肠杆菌JM109 、大肠杆菌表达质粒pBR322均为本室保存， 也可以购买得到。
大肠杆菌工程菌，携带有编码野生大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因。
使用PCR方法以大肠杆菌K12基因组DNA为摸板扩增得到腺苷甲硫氨酸合成酶 基因，将该基因连接到表达载体pBR322中并转化到大肠杆菌JM109中进行表达， 腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达受到其自身启动子的调控。
所用T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自Takara公司。质
粒DNA抽提试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京博大
泰克公司。其它所有试剂均为国产或进口分析纯试剂。
2. 培养基
液体LB/Tet培养基(10g/L蛋白胨；5 g/L酵母粉；10g/LNaCl; 15吗/ml四 环素盐酸盐)。将蛋白胨、酵母粉和NaCl用去离子水溶解后调节p1^7.0，在121°C 灭菌20分钟，然后在接种时加入四环素盐酸盐，使其终浓度为15pg/ml。
固体LB/Tet培养基在液体LB/Tet培养基中加入1.5。/。的琼脂，即制成固体琼 脂平板培养基。
3. 常规分子生物学操作
大肠杆菌基因组DNA的提取、酿酒酵母基因组DNA的提取、SAM合成酶基因 的PCR扩增、基因表达等技术参照精编分子生物学实验指南(奥斯伯等.1995)进行。
本发明通过下述实施例步骤进行阐明
步骤l、表达腺苷甲硫氨酸合成酶重组大肠杆菌的发酵
在固体LB/Tet平板上挑取单克隆，然后接入10ml液体LB/Tet培养基中，37'C培 养16小时(220转/分钟)。将上述菌液转接到2 L液体LB/Tet培养基中，3(TC培养16 小时(280转/分钟)，使菌体生长达到稳定期，经测定重组大肠杆菌表达SAM合成酶 的活性为大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶活性的150多倍。将培养后的菌液进行离 心，转速为6000rpm，离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀的菌体用于后续试验。
该重组大肠杆菌也可以在15-38'C的条件下进行培养表达腺苷甲硫氨酸合成酶。 当在15。C条件下进行培养，细胞生长到稳定期需要超过30小时，而且腺苷甲硫氨酸 合成酶的表达量较低，酶活性为野生大肠杆菌的8倍左右；当在38。C条件下进行培养， 细胞生长到稳定期仅需要8小时左右，但是表达的重组腺苷甲硫氨酸合成酶形成的包 涵体较多，酶活性为野生大肠杆菌的58倍左右；当在30。C条件下进行培养时，经过 16小时左右细胞就能生长达到稳定期，并且表达的腺苷甲硫氨酸合成酶活性最高，经 测定为大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶活性的150多倍。所以重组大肠杆菌表达腺 苷甲硫氨酸合成酶在3(TC条件下为最佳。
步骤2、经过通透剂预处理的重组大肠杆菌全细胞催化合成SAM: 对重组大肠杆菌采用不同浓度的甲苯、二甲苯或者CTAB进行通透化处理，处理 方法如下将步骤1中培养的大肠杆菌菌液进行离心，转速为6000rpm，离心10分 钟，弃去上清液，收集菌体沉淀。将收集的菌体悬浮于去离子水中，然后再进行通透 化处理。
在另一优选例中，通透化处理试剂采用甲苯将收集的菌体悬浮于去离子水中，
加入终浓度为1-5%的甲苯在35°(:处理lh，然后将反应液6000rpm离心IO分钟，收集 经过通透化处理的菌体用于后续的全细胞催化合成SAM。也可用1-5%的二甲苯或者 1-3%的CATB对细胞进行通透化处理。
经过通透剂预处理的大肠杆菌全细胞催化合成SAM反应液的配制如下100mM Tris、 35mMATP、 35mML-Met、 70mMMgSO4、 100mMKCl、 0.8M对甲基苯石黄酸钠、 经过通透剂预处理的重组大肠杆菌细胞150g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0。 将上述反应液加到反应器中，35" 120 rpm反应8小时。HPLC监测反应结束后， .10000rpm离心15分钟，收集上清液储存于4匸备用。同时，也可使用底物浓度为10mM
和20 mM的反应体系催化合成SAM,其余反应条件同上所述。
实验结果表明在35mM底物浓度的反应体系中经过通透剂预处理的重组大肠杆菌 细胞催化合成SAM的产量为10-12 g/L。
在另一优选例中，采用在全细胞催化合成SAM的反应体系中直接加入低浓度的 CTAB进行通透化处理在重组大肠杆菌全细胞催化合成SAM的反应体系中直接添加 0.25% 2.5%不同浓度的CTAB。全细胞催化合成SAM的反应体系如下100mMTris、 35mMATP、 35mML-Met、 70mMMgSO4、 100mMKCl、 0.8M对甲基苯磺酸钠、重 组大肠杆菌细胞150g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0。将上述反应液加到反应 器中，35°C 120rpm反应8小时。HPLC监测反应结束后，10000rpm离心15分钟，收 集上清液储存于4"C备用。同时，也可使用底物浓度为IO mM和20mM的反应体系 催化合成SAM,其余反应条件同上所述。
实验结果表明当CTAB在反应液中的终浓度达到0.5%时，在35mM底物浓度的 反应体系中SAM的最优化产量为11.5 g/L。
在另一优选例中，采用在全细胞催化合成SAM的反应体系中直接加入低浓度的 二甲苯进行通透化处理在重组大肠杆菌全细胞催化合成SAM的反应体系中直接添 加0.25% 2.5%不同浓度的二甲苯。全细胞合成SAM的反应体系如下100mMTris、 35mMATP、 35mM L-Met、 70mMMgSO4、 100mMKCl、 0.8M对甲基苯磺酸钠、重 组大肠杆菌细胞150g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0。将上述反应液加到反应 器中，35°C 120rpm反应8小时。HPLC监测反应结束后，10000rpm离心15分钟，收 集上清液储存于4"备用。同时，也可使用底物浓度为10 mM和20 mM的反应体系 催化合成SAM,其余反应条件同上所述。
实验结果表明当二甲苯在反应液中的终浓度达到1%时，在35mM底物浓度的反应体系中SAM的最优化产量为12.7 g/L。
在另一优选例中，采用在全细胞催化合成SAM的反应体系中直接加入低浓度的 甲苯进行通透化处理在重组大肠杆菌全细胞催化合成SAM的反应体系中直接添加 0.25% 2.5%不同浓度的甲苯。全细胞合成SAM的反应体系如下100mMTris、 35mM ATP、 35mML-Met、 70mMMgSO4、 lOOmMKCl、 0.8M对甲基苯磺酸钠、重组大肠 杆菌细胞150g，加水到1L，将反应液pH值调至7.0。将上述反应液加到反应器中， 35°C 120 rpm反应8小时。HPLC监测反应结束后，lOOOOrpm离心15分钟，收集上清 液储存于4'C备用。同时，也可使用底物浓度为10 mM和20 mM的反应体系催化合 成SAM,其余反应条件同上所述。
实验结果表明当甲苯在反应液中的终浓度达到0.5%时，在35mM底物浓度的反应 体系中SAM的最优化产量为13.4 g/L。
从以上实施例可以看出，与经过通透剂预处理的重组大肠杆菌催化合成SAM的 技术方案相比，在反应液中直接加入低浓度的通透剂催化合成SAM更具有优越性。
在上述实施例中，微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸所用的反应液的优选例为 三磷酸腺苷(ATP) 10 35 mmol丄-1， L-甲硫氨酸(L-Met)10 35 mmol丄"，氯化钾(KC1)100 mmol丄"，硫酸镁(MgSO4)20 70mmol丄"，对甲基苯磺酸钠400-800 mmo11/1 ， pH7.0 的Tris-HCl缓冲液100 mmol丄-1，反应液pH值调至7.0。
在另一反应液的优选例中，微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸所用的反应液为
三磷酸腺苷lOmmoLL: L-甲硫氨酸10mmol丄'1，氯化钾100mmol丄'1，硫酸镁20 mmol丄-1，对甲基苯磺酸钠400 mmoLL/1, pH7.0的Tris-HCl缓冲液100 mmoLL/1,反 应液pH值调至7.0。
在另一反应液的优选例中，微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸所用的反应液为-'
三磷酸腺苷20mmo11/1， L隱甲硫氨酸20 mmol丄—、氯化钾lOOmmol!/1,硫酸镁40 mmol丄-1，对甲基苯磺酸钠600 mmoLL", pH7.0的Tris-HCl缓冲液100 mmoLL1,反 应液pH值调至7.0。
在另一反应液的优选例中，微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸所用的反应液为 三磷酸腺苷35mmo11/1， L-甲硫氨酸35 mmol丄"，氯化钾画mmol丄'1，硫酸镁70 mmol丄-1，对甲基苯磺酸钠800 mmol丄"，pH7.0的Tris-HCl缓冲液100 mmoLL",反 应液pH值调至7.0。
另外，与不经过通透化处理的重组大肠杆菌催化合成SAM相比，在反应液中直 接加入低浓度的通透剂催化合成SAM同样也具有优越性。
对催化合成SAM的重组大肠杆菌细胞不做通透化预处理，同时在催化合成SAM 的反应液中也不加入低浓度的通透剂。大肠杆菌全细胞催化合成SAM反应液的配制 如下100mMTris、 35mMATP、 35mML-Met、 70mMMgSO4、 100mMKCl、 0.8M对 甲基苯磺酸钠、未经通透剂预处理的重组大肠杆菌全细胞150 g，加水到1L，将反应 液pH值调至7.0。将上述反应液加到反应器中，35°C 120rpm反应8小时。HPLC监 测反应结束后，10000rpm离心15分钟，收集上清液储存于4'C备用。同时，也可使 用底物浓度为10 mM和20 mM的反应体系催化合成SAM,其余反应条件同上所述，
实验结果表明未经通透剂处理的重组大肠杆菌细胞催化合成SAM的最优化产量 仅为2.5 g/L。
在本发明实施例中SAM合成酶活性的测定可以采用以下方法 将发酵获得的大肠杆菌细胞分别用0.1 mol/LTris-HCl缓冲液(pH=8.0)悬浮，并 且以没有转入携带有SAM合成酶基因质粒的野生菌为对照。每克湿细胞加入3ml缓 冲液悬浮，并且加入100ug/ml的溶菌酶在35。C下反应30分钟，然后在0。C下超声波
破碎细胞。12000rpm 4"离心收集SAM合成酶粗提液备用。
设定反应体系lml，其中含有100mMTris、 100mM KC1、 26mM MgS04、 10mM L-Met、 13mM ATP、 0.4M对甲基苯磺酸钠，将反应液pH值调至7。加入适量SAM 合成酶粗提液催化反应，并同时以加入野生菌的粗提液做对照，以不加入L-Met的反 应做空白对照。在37。C下温育30min后，加入10%的三氯乙酸终止反应。离心除去沉 淀，通过HPLC定量上清液中SAM的含量。
在本发明实施例中采用高压液相色谱法(HPLC)测定SAM含量
SAM的含量可以通过HPLC的反相C18柱进行分析检测，通过在不同反应时间 下取样可以监测底物ATP的峰以及产物SAM的峰，并确定反应进程和反应终点，具 体测定条件如下色谱柱Kromasil C18(5pm, 4.6x250mm);检测波长260nm;流动相 为(40mM乙酸-乙酸钠缓冲液+5%甲醇，pH=4.6);流速0.6ml/min。 SAM的保留时 间约为8min， ATP的保留时间约为5.5min。
采用外标法，根据不同浓度的SAM标准品峰面积绘制的标准曲线就可以对样品 中的SAM进行定量。
权利要求
1.一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于步骤如下步骤1、发酵培养能表达腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物细胞，发酵过程中培养液的温度维持在15～38℃，发酵液经6000rpm离心10min后，用蒸馏水洗涤1次收集微生物细胞；步骤2、以离心收集的微生物细胞作为酶源，同时向催化合成腺苷甲硫氨酸的反应液中添加通透剂，以三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸为底物催化合成腺苷甲硫氨酸，反应液的温度维持在35℃，120rpm反应8h，反应体系中菌体浓度为150g湿菌体/L；所述通透剂在合成腺苷甲硫氨酸反应液中的体积百分终浓度为0.25％～2.5％；所述的反应液组成为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液100mmol.L-1、三磷酸腺苷10～35mmol.L-1、L-甲硫氨酸10～35mmol.L-1、氯化钾100mmol.L-1、硫酸镁20～70mmol.L-1和对甲基苯磺酸钠400-800mmol.L-1，溶解后调pH值至7.0。
2. 根据权利要求1所述的促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征 在于所述的通透剂为有机溶剂或表面活性剂；所述的有机溶剂为甲苯或二甲苯， 所述的表面活性剂为十六垸基三甲基溴化铵。
3. 根据权利要求2所述的促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征 在于所述的甲苯在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为0.5%。
4. 根据权利要求2所述的促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征 在于所述的二甲苯在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为1%。
5. 根据权利要求2所述的促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于所述的十六垸基三甲基溴化铵在腺苷甲硫氨酸合成反应液中的体积百分终浓度为0.5%。
6.根据权利要求1所述的促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，其特征 在于所述的微生物为包含有来源于大肠杆菌^c^n'c^'a co"腺苷甲硫氨酸合成 酶基因的重组大肠杆菌细胞。
全文摘要
一种促进微生物全细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，涉及利用微生物全细胞催化合成高价值化合物的技术领域。技术特征在于以能表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌细胞作为酶源，通过向催化合成SAM的反应体系中直接加入低浓度的有机溶剂或表面活性剂，从而增加细胞膜的通透性，在反应底物三磷酸腺苷和L-甲硫氨酸存在的条件下催化合成SAM，反应8小时SAM合成量达到13.4g/L，底物转化率超过95％。本发明简化了全细胞催化合成SAM时对微生物细胞进行通透化处理的繁琐程序，避免了高浓度通透剂对细胞膜的损伤从而导致细胞内酶源的丢失以及细胞的裂解，最终提高了腺苷甲硫氨酸的产量。
文档编号C12P19/32GK101353682SQ200810150869
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者焰 丁, 尚晓娅, 尹春丽, 左晓佳, 牛卫宁, 王莉衡, 钦传光 申请人:西北工业大学