专利名称：：生物标记组合及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明是关于一种生物标记组合，以及一种藉由测定所述生物标记组合在一罹患乳癌个体的癌部组织中的态样来提供该个体对于化学治疗的反应率信息的方法。
背景技术：
：在欧美，乳癌为好发率最高的妇女癌症。在中国台湾，根据卫生署的统计资料，乳癌在女性常见妇女癌症当中，其死亡率早己超越子宫颈癌而跃居第一位。此外，乳癌在女性罹癌的死亡原因中，亦高居第四位，而且，死亡人数有逐年上升的趋势。乳癌的治疗方式相当复杂，医师会根据各种检査以及临床上的分期，采取不同的治疗方式，一般采用手术、放射性治疗、内分泌治疗，以及化学治疗等方式。近年来，除了一般的检査以及传统的临床分期之外，某些生物标记(biomarker)亦已被使用于乳癌的诊断、决定辅助治疗药物，以及预测患者的预后情形。对于治疗药物的选用而言，例如，雌激素受体(estrogenreceptor,ER)为阳性(ER+)的患者，可给予他莫西芬(tamoxifen,商品名Nolvadex)的辅助治疗。又如，针对表皮生长因子受体2(epidermalgrowthfactorreceptor2，亦可称HER2/ww，ErbB-2，ERBB2,本发明中称为HER2)蛋白质过度表达(overexpression)或是基因增幅(amplification，扩增)的患者，可给予曲妥珠单抗(trastuzumab，商品名Herceptin(贺癌平))的辅助治疗。这些生物标记可以帮助医师针对患者的个别状况拟定较佳的治疗计划或选择较适合的药CI再者，因为大多数的癌症药品均具有毒性，而且会对患者造成严重的副作用，因此如果能利用适当的生物标记帮助医师针对不同的患者选择适当的药物，将可使患者避免接受效果不大且具有毒性的药物。另外，适当的生物标记亦可避免患者因为使用不适合的药物反而延误病情，致使癌细胞转移。而且，癌症药物多为高价药物，使用不当的药物将造成患者的经济负担，亦造成药物资源的浪费。目前在乳癌的治疗药物上，虽然陆续有新的药物上市，但是蒽环糖苷类抗癌化合物(anthracyclineanticancercompound)类的药品仍为主要的乳癌治疗药物之一，且为乳癌或转移性乳癌的第一线化疗药物。蒽环糖苷类抗癌化合物为一种能够抑制第二型拓朴异构酶(topoisomeraseIIa,本发明中称为T2oc)的DNA重组的抗癌药物，这类药物虽被广泛使用，但是这类药物具有造成心脏毒性、会使白血球降低等副作用。因此，找出评估患者是否适合采用此类药品的方法或标记是相当重要的。针对与蒽环糖苷类抗癌化合物可能相关的生物标记而言，文献中较常提及的是HER2以及T2a。例如Durbecq等人所提出的研究报告(Mo/.Ca"cwT7zer.2004;3(10):1207-1214)中，曾述及有多篇研究报告指出，对于HER2阳性的肿瘤，以蒽环糖苷类抗癌化合物类为基础的辅助治疗的效果较为明显。此外，其亦提及更进一步的研究指出，蒽环糖苷类抗癌化合物的效果，与HER2及T2a的基因共同增幅(coamplification，共扩增)或是T2a的过度表达(overcxpresskm)有关。因为T2oc为蒽环糖苷类抗癌化合物的作用标的，因此，T2a基因的增幅或蛋白质过度表达可能才是能够预测以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化疗反应的真正指标，而HER2仅因与T2ot基因倶位于第17对染色体，且位置相当接近，而成为代用的指标。上述的研究均仅针对个别的生物标记探讨单一生物标记与药品反应率或存活期间的关连性。这种方式虽可简化研究时的变因，但是因为癌症病程进展的复杂性甚高，仅考虑单一的生物标记往往无法应付实际的状况。因此，若能利用多个生物标记所组成的生物标记组合来评估患者对于某种药品的反应率及存活期，将更能增加评估用药时的准确性。另一方面，这种生物标记组合的态样也较能反映出患者的个别状态，使医师能在临床上拟定更适合个别患者的治疗计划，避免给予患者毒性高但效果不佳的药物，而且，也可由生物标记组合态样所提供的信息判断是否需要合并使用其它的药物以提升治疗效果。
发明内容有鉴于此，本发明的主要目的是提供一种生物标记组合，其可提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息(资讯)。此生物标记组合是结合生物标记T2oc及p53的态样，并可进一步结合生物标记HER2的态样，而对患者对化学治疗的反应率做出较为精准的预测，从而提供患者较为适当的治疗计划。本发明的另一目的是提供一种方法，其可提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息，其是利用检测患者癌部组织中的生物标记组合态样，提供患者对于化学治疗的反应率信息。为达上述目的，本发明提供一种生物标记组合，其是用于提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息，其包含下列生物标记(1)第二型拓朴异构酶(topoisomeraselIoc，T2oc);以及(2)p53。在本发明的较佳实施方案中，该生物标记组合进一步包含另一生物标记表皮生长因子受体2(epidermalgrowthfactorreceptor2，HER2)。在本发明的较佳实施方案中，所述化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗(anthracycline-basedchemotherapy);更佳的，所述化学治疗为CEF化学治疗；最佳的，所述CEF化学治疗为手术前辅助化学7治疗(neoadjuvantchemotherapy)。在本发明中的蒽环糖苷类抗癌化合物并未有特别的限制，其包含以蒽环糖苷类为基础的抗癌化合物(anthracycline-basedcompound)。较佳的例子包括临床上使用的蒽环糖苷类抗生素及其衍生物。具体的实例如柔红霉素(daunorubicin，唐霉素)、阿霉素(doxorubicin,艾霉素)、妣柔比星(pirarubicin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、表阿霉素(epirubicin，泛艾霉素)、奥克斯霉素(oxaunomycin)，以及去甲氧柔红霉素(idarubicin，艾达霉素)。更佳的例子为阿霉素以及表阿霉素。在本发明中，以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗泛指包含蒽环糖苷类抗癌化合物的化学治疗。在本发明的较佳实施方案中，是利用检测编码这些生物标记的核酸增幅和/或其蛋白质表达的测定方法进行检测；更佳的，该测定方法为荧光原位杂交法(fluorescentinsituhybridization,本发明中称为FISH)和/或免疫组织化学方法(immuno-histochemistry，本发明中称为IHC)。本发明中使用FISH禾n/或IHC的方法测定时，可使用这两项测定中惯用的组织样品来源，且可以一般惯用的操作步骤进行。在本发明的较佳实施方案中，是利用个体的癌部组织进行检测。本发明还提供一种方法，其为提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息的方法，其包含下列步骤(1)提供个体的一癌部组织；(2)测定生物标记组合在该癌部组织的态样，其中该生物标记组合包含下列生物标记(i)第二型拓朴异构酶(T2oc);以及(ii)p53;且该测定是检测编码这些生物标记的核酸增幅和/或其蛋白质表达的态样；以及(3)根据步骤(2)所得该生物标记组合态样，提供该罹患乳癌个体对于该化学治疗的反应率信息。在本发明的较佳实施方案中，该方法的化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗；更佳的，所述化学治疗为CEF化学治疗；最佳的，该CEF化学治疗为手术前辅助化学治疗。在本发明的较佳实施方案中，所述生物标记组合态样选自T2a+p53+、T2a+p53-、T2a-p53+以及T2a-p53-所组成的群组；其中，该生物标记组合态样为T2a+p53-的个体对于该化学治疗的反应率高于其它生物标记组合态样，该生物标记组合态样为T2a+p53+的个体对于该化学治疗的反应率低于其它生物标记组合态样。在本发明的另一实施方案中，步骤(2)的生物标记组合进一步包含另一生物标记表皮生长因子受体2(HER2)。在本发明的较佳实施态样中，其中所述生物标记组合态样选自T2oc+p53+HER2+、T2a+p53+HER2-、T2a+p53-HER2-、T2oc十p53-HER2+、T2a-p53+HER2+、T2ct-p53+HER2-、T2a-p53-HER2+以及T2a-p53-HER2-所组成的群组；其中，生物标记组合态样为T2a-p53-HER2+的个体对于所述化学治疗的无病生存期(diseasefreesurvival,DFS，或称无疾病存活期)低于其它生物标记组合态样，生物标记组合态样为T2oc-p53+HER2-的个体对于所述化学治疗的无病生存期高于其它生物标记组合态样。在本发明的较佳实施方案中，步骤(2)是利用荧光原位杂交法和/或免疫组织化学方法的测定方法进行检测。本发明还提供了所述的生物标记组合的应用，具体地说，是其用于预测癌症化学治疗用药的用途。综上所述，本发明提供一种生物标记组合，其态样能够提供乳癌患者对于化学治疗的反应率信息，从而为该名患者安排预后较佳的疗程。其中所使用的生物标记组合(如T2a、p53或HER2)虽然个别均为已知的癌症9风险因子，但将这些生物标记的组合态样用于预测乳癌患者对于化学治疗的反应率并未见于任何现有技术，且这些生物标记组合态样对于提供化学治疗的反应率或无病生存期等信息确实具有非显而易见的功效。图1为IHC测定的例示图。其中，图片(a)为T2a阳性(T2oc+);图片(b)为p53阳性(p53+);图片(c)为T2a阴性(T2a-);图片(d)为p53阴性(p53-)。图2为FISH测定的例示图。其中，图片(a)为HER2阳性(HER2+，Her-2/neu基因增幅)；图片(b)为HER2阴性(HER2+，Her-2/neu基因未增幅)。具体实施例方式除了在下文中作其它意义解释的以外，所有科学术语如发明所属领域普通技术人员的理解而作其原始意义解释。如有争议，应以本说明书的定义为主。在本文中，「生物标记(biomarker)」一词是指一物质，该物质可作为生物性状态的指标，其可经由客观地测量或评估做为正常生物机转、致病机转，或在治疗中的药理反应的指标。在本文中，「生物标记组合(biomarkercombination)」一词是指多个生物标记的任何组合方式。在本文中，「生物标记态样(patternofbiomarker)」的用语是指一待测物经特定检测后，所得到某一生物标记的态样。在本文中，「生物标记组合态样(patternofbiomarkercombination)」的用语是指一待测物经特定检测后，所得到多个生物标记的组合态样。在本文中，「癌部组织(canceroustissue)」一词是指遭癌细胞侵入的组织或组织中已有细胞癌化的组织。在本文中，「手术前辅助化学治疗(neoadjuvantchemotherapy)J—词是指在手术前，对罹癌病人施行的药物治疗，其目的为欲在手术前縮小肿瘤体积，以使手术更易进行或更可能成功。在本文中，「CEF化学治疗」一词是指使用环磷酰胺(cyclophosphamide)、表阿霉素(epirubicin)以及氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5FU)所进行的辅助治疗。实施例患者此发明的原始概念来自于评估上千位于中国台北荣总求诊的复发性乳癌病患的生物标记。此临床试验计划是经长庚医学伦理试验委员会(IRB,institutionalreviewboard)核准的临床试验计划，受试者为未经其它化学治疗的乳癌患者，先接受手术前辅助化学治疗，此手术前辅助化学治疗包括四个CEF治疗周期(每次投予环磷酰胺500mg/m2,表阿霉素70mg/m2及氟尿嘧啶500mg/m2)，其是以三周为一周期，连续治疗四个周期。开始化疗后约十二周之后以手术切除肿瘤，同时对患者的情况进行后续追踪，追踪时间长达九年。手术后以习知的病理切片方式保存手术后所取得的组织样本，之后以免疫组织化学方法(IHC)和/或荧光原位杂交法(FISH)检测所得样本中的生物标记T2ot、p53及HER2的态样。共有78名乳癌患者在1995-1998年间参与本案的临床试验计划，其年龄分布范围为26至74岁(平均为47.76岁)，有68人为腺管癌(ductal)、5人为小叶癌(lobular)、2人为黏液癌(mucinous)、1人为顶泌腺癌(apocrine)、1人为黄瘤样癌(xanthomatous)、1人为鳞状癌(squamous)，所有患者都不是原位癌，而是浸润性乳癌(infiltratingbreastcancer)，其中肿瘤最大直径平均值为6.8厘米。以T分期(Tstage)进行分类:Tl(肿瘤直径cm)者为2人(占2.6%);T2(2cm〈肿瘤直径^5cm)者为21人(占27%);T3(肿瘤直径〉5cm)及T4(不论肿瘤大小为何，肿瘤已扩散至胸腔壁及皮肤)者合计为55人(占70.5%)。生物标记的检测(1)免疫组织化学方法(immuno-histochemistry,IHC)此部分的测定是根据Liu等人(Cancer2007;109:502-509)所提及的测定方式，此测定是利用LabVision(Fremont,CA,USA)的抗体topoisomerase2aAb-4(1/50稀释)及p53Ab-8(1/50稀释)来检测生物标记T2ot及p53。简言之，首先将厚度为4~5的组织石蜡包埋切片样本置于经有机硅烷涂覆的玻片上，烘烤隔夜(50~55°C)，之后去石蜡化，与前述一级抗体于4°C反应隔夜(抗体以Dako的DilutionBuffer稀释)。利用DAKOLSAB-2系统(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)(包含二级抗体与HRP酶呈色反应)检测染色结果。所有样本在检测过后以苏木素(Hematoxylin)进行复染(counterstain)。在玻片的代表性区域中计算50个细胞，若10%以上的细胞染色即判定为阳性，反之为阴性。对于T2oc而言，是以T2ot有过度表达的细胞株(T2ocover-expressioncellline)SKBR3作为阳性对照组，以剔除T2a基因的细胞株(acelllinew池constitutory17agenedeletion)MDA-MB361作为阴性对照组。对于p53而言，是以p53(突变)表现过多的细胞株SKBR3作为阳性对照组，以细胞株MCF7作为阴性对照组。染色结果如图l所示。(2)荧光原位杂交法(fluorescentinsituhybridization,FISH)此部分的测定是根据Lan等人(Am.J.Clin.Pathol.2005;124:97-102)所提及的测定方式进行测定，简述如下Her2基因是使用PathVysion探针(Vysis，DownersGrove,Illinois,USA)进行操作。将检体处理后，与带有橘色荧光的HER2，以及带有绿色荧光的CEP17(染色部位为第17对染色体的着丝点)探针进行隔夜杂交后，以60个细胞进行计数，若橘色荧光讯号与绿色荧光讯号的比值大于2.2，即判定此检体的HER2为增幅(amplification)而为阳性(HER2+)，反之则为阴性(HER2-)。图2所示即为荧光原位杂交法(FISH)测定的例示图。统计分析利用GraphPadPRISM4.05(SanDiego，CA,USA)以及SAS9.01进行统计分析。不同生物标记态样间的相关(correlation)是以费氏精确检定(Fisherexacttest)进行，以双尾(2-tailed)检定显著性(significance)。以KaplanMeier的方法计算存活期(生存期，survival),并且以对数等级检定(logranktest)的方法评估存活期的统计上的显著性。在所有的统计分析中，p值小于0.05时，认为其具有显著性。本试验中，对药物有反应者的判定是根据Theraseee/a/.在J7Nto/Qwcw/ra/.2000;92:205-16.—文中所揭示的标准进行评估，将符合CR(完全反应,completeresponse)及PR(部分反应，partialresponse)的患者人数合计为有反应者。计算反应率(responserate)时是以同一组别中有反应者的人数占该组总人数的％加以计算。另外，本试验中是将手术当日至肿瘤复发的时间定为无病生存期(Diseasefreesurvival,DFS)。本试验中，因患者肿瘤复发后所采用的治疗方式及用药不尽相同，因此对于患者的整体存活期(Overallsurvival,OS)(即诊断当日至患者死亡的时间)仅做纪录，并未加以讨论。对于单一生物标记与反应率的相关性的统计结果如表1所示。以T2oc、p53以及Her2等三个生物标记而言，在个别生物标记态样为阳性及阴性的组别之间，这些患者对于药物的反应率均未显现出显著性差异。由此可以得知，若仅以上述单一生物标记的态样将难以判定患者对于此类药物的反应率。若以T2ot与p53的生物标记组合态样与反应率的相关性进行统计，其结果如表2及表3所示。T2a+p53-组的反应率显著优于其它组别(^0.008),且不论为T2a+p53-HER2+或是T2a+p53-HER2-的次组别，其反应率均达100%。而T2a+p53+组的反应率(45。/。)明显低于其它组别(p-0.0651)。因此，具有T2a+p53+生物标记组合态样的患者可能需考虑合并使用其它的药物或是其它的治疗计划。再者，以T2ot、p53及HER2的生物标记组合与无病生存期的相关性进行统计，其结果如表4所示。T2a-p53+HER2-以及T2a+p53-HER2+组的无病生存期优于其它组别，尤其以T2a-p53+HER2-的平均无病生存期达70.5个月为最长。除了上述两组之外，其它组别的平均无病生存期在14.0至26.9个月，其中以T2oc-p53-HER2+组为最低，平均存活期仅达14.0个月。对于无病生存期较短的组别，这些患者可能需配合使用其它的药物或治疗计划，以拉长其无病生存期。综上所述，本发明所提出的生物标记组合并未见于任何现有技术。而且，本发明所提出的生物标记组合能够针对患者个别的生物标记组合态样提供信息，使医师拟定配合患者的治疗计划或选择较适合的药物。表l:单一生物标记与反应率的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3:T2oc、p53及HER2的生物标记组合态样与反应率的相关性生物标记组合态样反应率T2cx+p53-HER2+HER2-100%(7/7)100%(8/8)T2a+p53+HER2+HER2-43%(3/7)50%(2/4)T2ot-p53-HER2+HER2-75%(3/4)71%(5/7)T2ot-p53+HER2+HER2-67%(12/18)70%(16/23)总反应率72%(56〃8)表4:T2a、p53及HER25的生物标记组合与无病生存期的相关性生物标记组合态样」无病生存期(月)(人)T2a+p53-HER2+32.5(7)HER2-24.4(8)T2a+p53+HER2+21.8(7)HER2-19.9(4)T2a隱p53-HER2+14.0(18)HER2-24.9(23)T2a陽p53+HER2+26.9(4)HER2画70.5(7)1权利要求1.一种生物标记组合，其是用于提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息，其包含下列生物标记(1)第二型拓朴异构酶；以及(2)p53。2.如权利要求1的生物标记组合，其中所述化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗。3.如权利要求2的生物标记组合，其中所述化学治疗为CEF化学治疗。4.如权利要求3的生物标记组合，其中所述CEF化学治疗为手术前辅助化学治疗。5.如权利要求1的生物标记组合，其是利用检测编码这些生物标记的核酸增幅和/或其蛋白质表达的测定方法进行检测。6.如权利要求5的生物标记组合，其中所述测定方法为荧光原位杂交法和/或免疫组织化学方法。7.如权利要求1的生物标记组合，其是利用该个体的癌部组织进行检8.如权利要求1的生物标记组合，其进一步包含另一生物标记表皮生长因子受体2。9.如权利要求8的生物标记组合，其中所述化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗。10.如权利要求9的生物标记组合，其中所述化学治疗为CEF化学治疗。11.如权利要求10的生物标记组合，其中所述CEF化学治疗为手术前辅助化学治疗。12.如权利要求8的生物标记组合，其是利用检测编码这些生物标记的核酸增幅和/或其蛋白质表达的测定方法进行检测。13.如权利要求12的生物标记组合，其中所述测定方法为荧光原位杂交法和/或免疫组织化学方法。14.如权利要求8的生物标记组合，其是利用所述个体的癌部组织进行检测。15.—种提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息的方法，其包含下列步骤(1)提供该个体的一癌部组织；(2)测定一生物标记组合在该癌部组织中的态样，其中该生物标记组合包含下列生物标记(i)第二型拓朴异构酶；以及(ii)p53;且该测定是检测编码该些生物标记的核酸增幅和/或其蛋白质表达的态样；以及(3)根据步骤(2)所得生物标记组合态样，提供罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息。16.如权利要求15的方法，其中所述化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗。17.如权利要求16的方法，其中所述化学治疗为CEF化学治疗。18.如权利要求17的方法，其中所述CEF化学治疗为手术前辅助化学治疗。19.如权利要求15的方法，其中所述生物标记组合态样是选自T2a+p53+、T2a+p53-、T2a-p53+以及T2a-p53-所组成的群组。20.如权利要求19的方法，其中所述生物标记组合态样为T2a+p53-的个体对于该化学治疗的反应率高于其它生物标记组合态样。21.如权利要求19的方法，其中所述生物标记组合态样为T2a+p53+的个体对于该化学治疗的反应率低于其它生物标记组合态样。22.如权利要求15的方法，其中步骤(2)是利用荧光原位杂交法和/或免疫组织化学方法的测定方法进行检测。23.如权利要求15的方法，其中步骤(2)的生物标记组合进一步包含另一生物标记表皮生长因子受体2。24.如权利要求23的方法，其中所述化学治疗为以蒽环糖苷类抗癌化合物为基础的化学治疗。25.如权利要求23的方法，其中所述化学治疗为CEF化学治疗。26.如权利要求25的方法，其中所述CEF化学治疗为手术前辅助化学治疗。27.如权利要求26的方法，其中所述生物标记组合态样是选自T2a+p53十HER2+、T2a+p53+HER2-、T2a+p53-HER2-、T2a十p53腸HER2+、T2a-p53+HER2+、T2a-p53+HER2-、T2a-p53-HER2+以及T2a-p53-HER2-所组成的群组。28.如权利要求27的方法，其中所述生物标记组合态样为T2a-p53-HER2+的个体对于该化学治疗的无病生存期低于其它生物标记组合态样。29.如权利要求27的方法，其中所述生物标记组合态样为T2a-p53+HER2-的个体对于该化学治疗的无病生存期高于其它生物标记组合态样。30.如权利要求23的方法，其中步骤(2)是利用荧光原位杂交法和/或免疫组织化学方法的测定方法进行检测。全文摘要本发明是关于一种生物标记组合，其是用于提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息，其包含下列生物标记第二型拓朴异构酶(T2α)及p53，且选择性包含另一生物标记表皮生长因子受体2(HER2)。本发明还提供一种方法，是提供一罹患乳癌个体对于化学治疗的反应率信息的方法，其包含测定前述生物标记组合在一癌部组织中的态样。文档编号C12Q1/68GK101665822SQ200810215319公开日2010年3月10日申请日期2008年9月5日优先权日2008年9月5日发明者敏刘,洁蓝,陈训彻申请人:台湾东洋药品工业股份有限公司