鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用的制作方法

专利名称：：鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于一种鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：血管生成是从原已存在的血管，如毛细血管和毛细血管后微静脉生成新血管的过程。控制正常组织血管生成的机制并不能控制肿瘤的血管生成，肿瘤血管生成是由肿瘤血管生成因子与肿瘤血管生成抑制因子共同调控的。95%的癌症最后均形成肿块，称为实体瘤。实体恶性肿瘤细胞早期在无血管生长的情况下可通过周围组织的弥散作用来获得营养，肿瘤的体积一般不超过23mm3。当体积增至23mm3时，肿瘤已不能单纯依靠弥散获取氧气及营养物质，如果没有新生毛细血管生成，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。新血管的形成是肿瘤转移的必要条件，肿瘤的浸润和转移依赖肿瘤血管的生成。随着肿瘤微血管密度的增加，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加。微血管密度被认为是预测肿瘤转移、复发和预后的一项指标。肿瘤血管生成因子，如血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)等，能促进肿瘤新生微血管的生长。抗血管生成疗法旨在抑制肿瘤血管生长，使肿瘤得不到足够的营养和氧气而萎縮。当肿瘤半径萎縮到小于2mm，肿瘤细胞距离毛细血管0.2mm以上时，氧气将无法通过弥散作用抵达肿瘤细胞，肿瘤细胞既不能从肿瘤血管处得到营养和氧气，也无法从周围血管通过弥散作用得到营养和氧气，肿瘤组织于是发生退化或处于长期休眠期。与传统的治疗方法相比，血管生成抑制剂具有遗传稳定、特异性高和容易达到靶细胞等诸多优点，肿瘤血管生成的各个环节及其调节因子均可作为血管生成抑制剂的作用靶点。按照作用机制不同，肿瘤血管生成抑制剂大体可分为抑制基底膜降解、抑制内皮细胞增殖功能、阻断血管生成因子、阻断内皮细胞特异性整合素和非特异性作用机制等。近年来，我国的科技工作者也开始进行肿瘤血管生成抑制剂的寻找和研究工作，取得了可喜的进展。中科院上海药物研究所发现来源于天然产物的新化合物PAA、DYB、ZH-1等具有抑制新生血管生成作用，中山大学正在研发的内皮抑素已进入临床试验。期刊上也出现了多篇有学术价值的报道。美国基因技术研究所的科学家在1989年成功克隆VEGF，1993年又制造出VEGF的抗体Avastin，2004年美国FDA批准Avastin上市，用于一线治疗转移性结、直肠癌。Avastin是一种抗血管生成的新型抗癌药，是一种人源性的单克隆抗体，其作用机制是抑制新生血管生成，从而阻断肿瘤生长的血液供应，抑制肿瘤生长与转移。与传统化疗药物结合使用，可延长结肠癌患者的生存期，这种"饿死肿瘤"的疗法被美国《科学》杂志评为2003年3十大科学突破。王宁等通过VEGF单克隆抗体Avastin联合或不联合氟尿嘧啶对人类胃癌裸鼠原位种植模型的肿瘤生长和转移进行干预治疗，探讨Avastin对胃癌生长、转移和血管生成的影响。结果发现，和对照组相比，氟尿嘧啶单用组、Avastin单用组和联合用药组原位移植肿瘤重量明显降低.抑瘤率分别为37.52%、58.76%和98.51%。Avastin单用组和联合用药组微血管密度均比对照组明显减少(8.40±1.26和7.20±1.23vs15.30±1.06)。Avastin和氟尿嘧啶联合应用不仅对原位肿瘤的生长抑制最为明显，而且对肝脏转移有显著的抑制作用。因此，Avastin和传统细胞毒化疗药物联合应用对胃癌的治疗效果更显著。抗血管生成疗法治疗实体瘤目前已取得了巨大的进展，并且相对于传统的肿瘤治疗方法有许多优点，如不易产生耐药性，可抑制肿瘤转移，以血管为靶，对多种肿瘤有效等等。但是在临床应用中仍然有很多问题亟待解决(1)使用周期长，用药剂量大；(2)大剂量长期用药使药物毒性加大；(3)费用相对较高，患者难以承受；(4)药物在体内的半衰期短，药物的使用剂量大和次数频。目前极需寻找能克服上述缺点的强效的血管生成抑制因子。肿瘤血管生成是一个受众多生长因子调节的复杂的生理、病理过程，在这些生长因子中，VEGF是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子，它能够增加血管通透性，促进肿瘤血管形成，对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移等发挥重要作用。以VEGF及其受体作用途径中的任一环节为靶点，阻断VEGF对肿瘤血管的作用，都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的。VEGF又称为血管通透因子，是由两个相同肽链通过二硫键交连构成的同源二聚体糖蛋白。它的生物学效应是通过存在于内皮细胞表面的特异性受体(VEGFR)来介导的。Avastin是一种人工合成的抗VEGF的抗体。Avastin的原理是通过抗VEGF来抑制肿瘤的生长。鳐血管生成抑制因子1则是从海洋生物中分离出来的一种天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于其他多个涉及血管生成和肿瘤生长、转移的靶点。我国重组人血管内皮抑制素注射液(恩度，烟台麦得津生物工程股份有限公司生产，已经上市。恩度联合NP化疗方案用于治疗初治或复治的ni/iv期非小细胞肺癌患者，有一定疗效。现有临床上使用的抗肿瘤血管生成剂价格昂贵，效果有限，而且其作用机制单一，多通过下调VEGF来实现其作用。具有强抗血管生成效果，作用靶点新颖，而又没有副作用或副作用小的新抗血管生成剂的研究与开发有着巨大的市场需要。
发明内容本发明的目的是提供一种鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用，用基因工程技术实现鳐血管生成抑制因子1功能区的克隆、表达及重组；重组的鳐血管生成抑制因子1功能区具有以下生物活性抗血管生成、抗肿瘤生长及转移作用，急性毒性试验，稳定性试验。用鳐血管生成抑制因子1功能区与可药用的载体混合或溶解，制得治疗各种肿瘤的药物。本发明采用酶切、PCR技术对鳐血管生成抑制因子lcDNA进行改造，获得去除突变体的基因片段，将其分别克隆入带有GST或HIS标记的原核表达载体pGEX-2T，随后将质粒转入E.coliBL21进行表达，用GST或HIS特异的纯化柱进行纯化，切除GST/HIS或保存GST或HIS标记，利用FPLC技术纯化所需片段，重组的鳐血管生成抑制因子1功能区肽段应该具有或超过鳐血管生成抑制因子1的生物学效能。根据鳐血管生成抑制因子1功能区进行抗血管生成和抗肿瘤生长、转移实验的结果，确定鳐血管生成抑制因子1的有效功能区，并解析其结构，即氨基酸残基的组成和顺序；鳐血管生成抑制因子1功能区与可药用的载体混合或溶解，制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂，或液体形式的针剂、可用于各种实体形肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等的治疗，及其在需要这种治疗的人中的应用。本发明提供的鳐血管生成抑制因子1功能区具有更强的作用专一性，具有易于表达，降解率低等基因工程药物的特征，有强抗血管生成、强抗肿瘤生长和转移的效果；提供的基因工程技术可工厂化生产鳐功能区；基因工程技术生产的鳐功能区可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。具体实施例方式鳐血管生成抑制因子1功能区以下简称鳐功能区，鳐血管生成抑制因子1是我们首次从南海海域一种鳐组织中分离出来的蛋白质(分子量42KD)。研究结果显示鳐血管生成抑制因子1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成；无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移，减少肿瘤组织微血管密度，下调促血管生成因子VEGF的表达；对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制作用；下调促转移因子CD44v6和ErBb2的表达；与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用时效果更显著。鳐血管生成抑制因子l的作用靶点与美国基因技术研究所开发出的抗癌新药Avastin不同。Avastin是基因工程产品，是VEGF的抗体，其作用靶点是VEGF;鳐血管生成抑制因子1是天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于bFGF和PDGF。鳐血管生成抑制因子1的一级结构已确定，初步预测了鳐功能区的位置。鳐血管生成抑制因子1是一个有重要应用价值的生物活性成分，而鳐功能区的克隆、表达及重组，基因工程生产鳐功能区技术的建立则是本发明创造的目的。用基因工程技术实现鳐功能区的克隆、表达及重组；同步研究重组的鳐功能区以下生物活性抗血管生成、抗肿瘤生长及转移作用，急性毒性试验，稳定性试验。鳐功能区的氨基酸组成和序列本发明提供一种鳐功能区的氨基酸组成和序列，具有这种氨基酸组成和序列的功能区显示强抑制血管生成、强抗肿瘤生长和转移的生物活性。鳐功能区由下列氨基酸残基按下列顺序组成鳐功能区的生物活性检测结果显示，它对肿瘤细胞无直接杀伤作用，但能诱导人脐静脉内皮细胞凋亡，抑制人脐静脉内皮细胞迁移，显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜和肿瘤细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，显著抑制肿瘤生长和肿瘤转移。药效试验鳐功能区抑制人脐静脉内皮细胞的增殖材料和方法细胞培养人脐静脉内皮细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心；人鼻咽癌细胞(CNE-2Z)细胞购自广东医学院生化教研室。以含10X灭活新生牛血清、100U/ml青霉素、lOOiig/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37°C、5%0)2、饱和湿度条件下培养。以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞，23天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。MTT法取对数生长期细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔90ii1细胞悬液(含1.0X104细胞)。待细胞长到约80%融合时，加入不同浓度的鳐功能区10iU，对照组加入相同体积RPMI-1640培养液。每一浓度设4个平行孔。充分混匀后，于0)2培养箱中分别培养24、48、72h。每孔加入MTT20iil(5mg/ml)，继续培养5h，每孔加入三联液100ia。37。C放置过夜，用酶标仪在570nm波长处测量各孔0D值。细胞生长抑制率按下列公式计算生长抑制率(%)=(1-实验组0D值/对照组0D值)X100%。结果鳐功能区明显抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，作用24、48、72h的IQ。值分别为0.21、0.16、0.10mg/ml，其效果与剂量和作用时间呈正相关。然而，鳐血管生成抑制因子1功能片段对CNE-2Z细胞的生长却无明显的影响。鳐功能区抑制人脐静脉内皮细胞的迁移材料和方法细胞迁移试验采用24孔带有聚碳酸酯膜小室的培养板，下室加入600iU含50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)的RPMI-1640培养液，37。C孵育lh备用。将经0.16mg/ml鳐功能区处理24h的细胞悬液300ii1(2.OX104个细胞)加入上室，对照组为未经FAT-03处理的人脐静脉内皮细胞，设3个平行孔。细胞在37t:下迁移4h后，取出小室。迁移到下表面的细胞以3%的福尔马林固定，用50iimol/LPI染色。在200倍荧光显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野穿过膜的细胞数。上述实验在给出的实验条件下重复3次。按下式计算迁移抑制率。迁移抑制率(％)=(1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)X100%。结果Transwell小室趋化运动模型检测结果显示，鳐功能区显著抑制HUVECs的迁移，O.15mg/mlFAT-03作用24h，对细胞的迁移抑制率为60.0%(P<0.01)。鳐功能区诱导人脐静脉内皮细胞凋亡材料和方法荧光显微镜观察细胞形态A.Hoechst—PI染色取对数生长期细胞，接种于24孔板中，每孔900iU细胞悬液(1X1()5个细胞)。实验组加入1.5mg/ml鳐功能区100yl，对照组加入等量培养基，培养72h，将24孔板lOOOr.min—1离心5min，弃去上清，PBS洗涤1次。加入200ulPBS，然后加入Hoechst33342染色液，使其终浓度为50umol/L，混匀，再加入PI染液，使其终浓度为10iimol/L，混匀，染色15min，荧光显微镜观察、拍照。B.丫啶橙-溴化乙锭染色取对数生长期细胞，接种于24孔板中，每孔900iU细胞悬液(1X105个细胞)。实验组加入1.5mg/ml鳐血管生成抑制因子1功能片段100iU，对照组加入等量培养基，培养72h。将24孔板1000r.min—1离心5min，弃去上清。PBS洗涤1次，加入200ii1PBS和10ill混合荧光染色液(含100iig/ml丫啶橙-和100yg/ml溴化乙锭)，混匀染色，立即置于荧光显微镜下观察并拍照。流式细胞术分析A.膜联蛋白V-FITC-PI双染取对数生长期细胞，接种于6孔板中，每孔1.8ml(5X105细胞)。培养24h后，实验组加入200y1不同浓度的鳐功能区，对照组加入等量培养基。培养48h后，胰酶消化，1500r.min-l离心5min收集细胞于10ml离心管中。4°C预冷的PBS洗两次。用结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为109/L。取lOOyL细胞悬液于5mL流式管中，加入5iilAnnexinV-FITC(150mg/L)和10yL碘化丙锭(120mg/L)，混匀后室温避光孵育15min，在反应管中加500iiLPBS，流式细胞仪分析。B.PI染色取对数生长期细胞，接种于6孔板中，每孔1.8ml(5X105细胞)。贴壁生长后，弃去培养液，加入无血清的RPMI1640培养液培养18h，使细胞同步化。再换为含10%新生牛血清的RPMI1640培养液培养6h。实验组加入.0.8mg/ml鳐功能区200y1，对照组加入等量培养基。作用一定时间后，胰酶消化，1500r.min-1离心5min收集细胞于10ml离心管中。PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇固定24h以上。离心弃去乙醇，细胞重悬于PBS中，加入PI染液，使其终浓度为50iig/ml，室温下避光染色30min。400目筛网过滤，采用美国Coulter公司生产的EPICS型流式细胞仪，以氩离子激光器发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析。Westernblotting分析取对数生长期细胞4.8ml(lX10e个)，加入不同浓度鳐功能区200iU，对照组加等量培养基。培养72h后，将培养瓶置于冰上，细胞刮刀小心刮脱细胞，转移到50ml离心管中。3，000r.min-l离心15min，收集细胞。用预冷PBS洗涤2次，加入600yL细胞裂解液，混匀，转移至Eppendorf管中。冰上裂解30min后，15，OOOg，4。C离心15min。收集上清，Lowry's法测定总蛋白含量。在12%分离胶，5%浓縮胶上进行电泳(每个泳道150yg蛋白)，用Westernblotting法检测VEGF、Bax、Bcl_2的表达水平。结果荧光显微镜观察细胞形态A.Hoechst-PI染色对照组细胞胞核大小较均一，呈圆形或者椭圆形，染色质分布均匀，着蓝色。0.15mg/ml鳐功能区处理组细胞皱縮，变形，染色质浓縮呈红色，部分核染色体碎裂，可见部分晚期凋亡细胞，偶有凋亡小体出现。B.吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)染色对照组细细胞核染色质分布均匀，着绿色，呈正常结构。0.15mg/ml鳐功能区处理组细胞肿胀，胞浆浓縮，细胞核黄染，部分胞膜破损，胞核碎裂，可见部分染成橘红色的晚期凋亡细胞。流式细胞术分析A.膜联蛋白V-FITC-PI双染双染检测结果显示，鳐功能区处理48h细胞的早期凋亡率增加(P<0.05)，并呈剂量依赖关系，O.05mg/ml、0.10mg/ml和0.15mg/ml鳐功能区处理48h，早期凋亡率分别为2.7±0.7%、8.20±1.4%和16.2±1.3%(对照组为1.4±0.3%)。7B.PI染色流术细胞术分析结果显示，鳐功能区阻滞人脐静脉内皮细胞于G。/^期。0.10mg/ml鳐功能区处理细胞24、48、72h，处于G0/Gl期的细胞分别从62.4±0.8%、72.7±0.6%和75.0±2.4%增加到72.8±0.4%、85.6±0.8%和86.8±0.5X，而处于S和G2/M期细胞的百分率则相应降低。0.lOmg/ml鳐血管生成抑制因子1功能片段作用细胞48h，在Gl期左侧出现1个明显的亚二倍体峰，即凋亡峰，细胞的凋亡率与时间相关，鳐功能区作用细胞48、72h的凋亡率分别为16.9%和43.2%。Westernblotting分析Westernblotting分析结果显示，鳐功能区下调VEGF和促调亡基因Bcl_2的表达，上调抑凋亡基因Bax的表达，其效果与剂量相关。鳐功能区抑制血管生成材料和方法鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验选择清洁、蛋壳均质、气室均匀的种鸡蛋，在19200型智能孵化箱中孵化1周，无菌条件下在胚头端开一直径lcm小孔，形成假气室。将100鳐功能区药液浸过之滤纸置于气室内的尿囊膜上，用透明胶带封口。置3『C恒温培养箱中培养，24h、48h后分别再加药液100iU于滤纸上，对照组则加等量溶剂。72h后用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的膜置载玻片上，弃取滤纸，显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。按下式计算血管生成抑制率血管生成抑制率对照组血管分支点数—给药组血管分支点LX100%对照组血管分支点数鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验选择清洁、蛋壳均质、气室均匀的种鸡蛋，在19200型智能孵化箱中孵化1周，无菌条件下在胚头端开一直径lcm小孔，形成假气室。接种CNE-2Z细胞(1.9X106/胚)，用透明胶带封口。置培养箱中培养4天后，将中央打一小孔的滤纸置于气室内的尿囊膜上，加鳐功能区药液100iU于滤纸上，对照组则加等量溶剂，每天1次，共给药4次。然后去掉透明胶带，用丙酮和无水乙醇分别固定12分钟。剪下放有滤纸的尿囊膜置载玻片上，弃取滤纸，显微镜下随机选取5个视野计数可见血管的分支点数并照相。按下式计算血管生成诱导率和血管生成抑制率rfr瞎越话旦鬼肿瘤细胞对照组血管分支点数一空白对照组血管分支点数"顺.血管生成诱导率=-X100%空白对照组血管分支点数血管生成抑制率=月中麵纖磁雄-謹廳雄環％肿瘤细胞对照组血管分支点数小鼠Lewis肺癌组织iMVD的测定鳐功能区(20.0mg/kg*d)腹腔注射荷瘤BALB/c裸小鼠，每天1次，共14次，标本为BALB/c裸小鼠Lewis肺癌组织。经CD31免疫组化染色的血管内皮细胞呈棕色。结果鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验鳐功能区显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，并呈剂量依赖关系(表1)。表1鳐血管生成抑制因子1对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验鳐功能区显著抑制CNE-2Z细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，且与剂量相关(表2)。表2鳐血管生成抑制因子1对CNE-2Z细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>小鼠Lewis肺癌组织微血管密度对照组Lewis肺癌组织内毛细血管大量增生，富集在肿瘤边缘处，微血管分布不均，形态不规则，数量相差悬殊，呈异质性，微血管数为19.6±2.1。鳐功能区组仅在癌巢间质有极少量新生毛细血管，微血管数为5.4±1.2。鳐功能区组的微血管数明显低于对照组。鳐功能区抑制肿瘤的生长和转移材料和方法Lewis月市癌BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组，每组8只，雌雄各半。每鼠背部皮下接种0.2mlLewis肺癌细胞悬液(4X106细胞)Lewis肺癌细胞。肿瘤接种后第7天，实验组腹腔注射不同剂量鳐功能区溶液，每天1次，共14次；对照组腹腔注射等量溶剂；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，每周1次，共2次。第21天牺牲小鼠，剥离肿瘤称重(用10%中性福尔马林固定用于免疫组化实验)，解剖、观察并记录肝转移节结数。按下式计算肿瘤生长抑制率和肿瘤转移抑制率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>对照组肝或肺转移结节数黑色素瘤BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组，每组8只，雌雄各半。每鼠尾静脉接种0.2mlB16细胞悬液(3乂106细胞)，肿瘤接种当天，实验组腹腔注射不同剂量鳐功能区溶液，每天1次，共14次；对照组腹腔注射等量溶剂；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，每周1次，共2次。第15天牺牲小鼠，取肺组织计转移节结数。按下式计算肿瘤转移抑制率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>结果Lewis月市癌腹腔注射鳐功能区组的肿瘤明显较对照组体积小，基底窄，易剥离。肝转移灶数量少，体积小。鳐功能区明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长及肝转移，这一作用与剂量相关(表3，4)。表3鳐功能区腹腔注射对裸小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。表4鳐功能区腹腔注射对小鼠Lewis肺癌肝转移的抑制作用组别剂量转移结节数大结节数抑制率mg/kg-d发生率(i±s，个)(>3腿，个)(%)对照组—8/8108.0±22.882.4±30.2—鳐功能区10.0x146/861.5±32.436.8±7.242.8鳐功能区20.0x145/821.4±22.46.4±22.680.0环磷酰胺*50.0x25/839.2±21.830.2±8.463.7*环磷酰胺分别于肿瘤接种后第7天、第14天腹腔注射。黑色素瘤腹腔注射鳐功能区显著抑制裸小鼠黑色素瘤细胞肺转移，并与剂量相关，其作用优于临床上常用的环磷酰胺。鳐功能区和环磷酰胺有协同作用(表5)。表5鳐功能区腹腔注射腹腔注射对裸小鼠黑色素瘤B16细胞肺转移的影响组别剂量转移发生率结节数大结节数转移抑制率(mg/kg'd)(个)(>3腿，个)(%)对照组—8/856.4土8.340.2±8.4一鳐功能区10.0x145/825.9±7.912.6±3.254.0鳐功能区20.0x143/817.8±4.59.8±6.468.4环磷酰胺*50.0x144/827.2±8.614.0±8.351.8鳐功能区+环磷酰胺*10.0x14+50.0x22/86.3±1.82.1±0.688.8*环磷酰胺分别于肿瘤接种当天、接种后第7天腹腔注射。毒理学实验急性毒性试验采用健康昆明种小鼠，体重1922克，雌雄各半。给药(po)前禁食4h，采用24h内多次给药法，其间酌情供给饲料，不禁水。给药量为鳐功能区有效剂量的100倍(lp，20mg/kg;po，40mg/kg)，给药后观察7天。观察期间逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。因为未发现小鼠死亡，测不出LDs。，遂改做"最大耐受量试验"，一次性用鳐功能区有效剂量的300倍(lp，60mg/kg;po，120mg/kg)0.5ml和0.8ml分别给20只小鼠腹腔注射或灌胃，观察14天，结果仍未发现小鼠毒性反应或死亡。稳定性采用冷冻干燥技术制成鳐功能区样品，在-201:冰箱中保存一年，其生物活性(抑制血管生成、抑制体外培养瘤细胞和小鼠移植性肿瘤生长)无明显降低。本发明经药效、毒理学和作用机理试验，证实其对培养的人癌细胞和小鼠移植性肿瘤的生长有显著抑制作用，对血管生成有明显的抑制作用，毒副作用很低，可用于治疗人11的各种肿瘤，成本低，临床使用时病人无明显副作用，疗效颇理想。鳐功能区可与可药用的载体混合或溶解，制得治疗各种肿瘤的药物，包括各种剂型，该药物可用于白血病，亦可用于各种实体肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、肌瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等的治疗，及其在需要这种治疗的人中的应用。所制成的各种口服药物组合物中，鳐功能区的含量为每日每Kg体重犬约0.OOl-lOOmg，优选约0.01-50mg，更优约为0.05-30mg，最佳约0.l-10mg。每日分2-4次使用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。所制成的注射用药物组合物，可供肌肉注射或静脉点滴，其中鳐功能区的含量为每日每Kg体重大约0.001-50mg，优选约0.01-25mg，更优约为0.05-15mg，最佳约0.l-3mg。每日分1_3次使用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。然而，精确的剂量应由医生确定，主要取决于病人的年龄、体重、病情、反应等。鳐血管抑制因子1功能区序列.WorkFileApplicationProject-------------------〈120〉Title:鳐血管抑制因子1功能区的制备及防治肿瘤药物的用途〈130〉AppFileReference:〈140>CurrentAppNumber:〈141>CurrentFilingDate:Sequence--------〈213>0rganismName:Dasyatisakajei〈400〉PreSequenceString:TLDIYKQLRDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPF頂TVGCVAGDEESYEVFKALFDPVIQ60DRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRSIKGIALPPHCSRGERRLV120EKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQLIDDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDA180RGIWHNM)KTFL丽NEEDHLRVISMQKGG腿EVFRRFCVGLKK225〈212〉Type:PRT〈211〉Length:225SequenceName:鳐血管抑制因子1功能区SequenceDescription:Feature-------Sequence:鳐血管抑制因子1功能区〈221〉FeatureKey:DOMAIN〈222〉LocationFrom:1〈222〉LocationTo:225OtherInformation:CDSJoin:No权利要求一种鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用，其特征是采用酶切、PCR技术对鳐血管生成抑制因子1cDNA进行改造，获得去除突变体的基因片段，将其分别克隆入带有GST或HIS标记的原核表达载体pGEX-2T，随后将质粒转入E.coliBL21进行表达，用GST或HIS特异的纯化柱进行纯化，切除GST/HIS或保存GST或HIS标记，利用FPLC技术纯化所需片段，重组的鳐血管生成抑制因子1功能区肽段应该具有或超过鳐血管生成抑制因子1的生物学效能，根据鳐血管生成抑制因子1功能区进行抗血管生成和抗肿瘤生长、转移实验的结果，确定鳐血管生成抑制因子1的有效功能区，并解析其结构，即氨基酸残基的组成和顺序；鳐血管生成抑制因子1功能区与可药用的载体混合或溶解，制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂，或液体形式的针剂、可用于各种实体形肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等的治疗，及其在需要这种治疗的入中的应用。2.据权利要求1所述的鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用，其特征是鳐功能片段的氨基酸组成和序列由下列氨基酸残基按下列顺序组成TLD1YKQLRDKETPSGFTLDDV1QTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPV1QDRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKGGDDLDPNYVLSSRVRTGRS1KG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK。全文摘要一种鳐血管生成抑制因子1功能区的制备及在防治肿瘤药物中的应用，用基因工程技术实现鳐血管生成抑制因子1功能区的克隆、表达及重组；重组的鳐血管生成抑制因子1功能片段具有以下生物活性抗血管生成、抗肿瘤生长及转移作用，急性毒性试验，稳定性试验。用鳐血管生成抑制因子1功能区与可药用的载体混合或溶解，制得治疗各种肿瘤的药物。本发明提供的鳐血管生成抑制因子1功能区具有更强的作用专一性，具有易于表达，降解率低等基因工程药物的特征，有强抗血管生成、强抗肿瘤生长和转移的效果；提供的基因工程技术可工厂化生产鳐血管生成抑制因子1功能区；基因工程技术生产的鳐血管生成抑制因子1功能区可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。文档编号C12N15/70GK101724631SQ20081021878公开日2010年6月9日申请日期2008年11月3日优先权日2008年11月3日发明者于廷曦,于立坚,廖铭能,张永平,张霄瑜,苏伟明,马润娣,黄来珍申请人:广东海洋大学