专利名称：：鸡肉风味相关基因adslsnp分型试剂盒的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及一种鸡肉风味相关基因ADSLSNP分型试剂盒，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：优质肉鸡育种中肉质性状的选育是关键环节，而肉质的风味是肉质性状的一个非常重要的指标。肌肉肌苷酸(IMP)含量是影响肉质风味的重要因素，而腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL)是IMP合成过程中的关键酶之一，对于最终肌肉肌苷酸含量具有重要的影响。近几年的研究表明，ADSL基因(季从亮等，2004;束婧婷等，2007)是影响肉品质风味的主效基因或与主效基因相连锁的基因，可作为鸡肉风味物质选择的分子遗传标记。[0003]连接酶检测反应(ligasedetectionreaction,LDR)LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。通过多重PCR(MultiplexPCR)获得含有待检测突变位点的基因片段，高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，最后通过测序仪电泳读取检测结果。该技术具有特异性高、检测快速、通用性强、适用范围广、成本低廉等特点，目前已成功应用于人类疾病相关基因分子标记的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。
发明内容本实用新型的目的是为了给鸡肉风味物质相关基因ADSL基因C3484T-SNP的检测提供一种准确性高、快速、价格低廉的基因分型试剂盒。本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡肉风味相关基因ADSLSNP分型试剂盒，其特征是，所述的试剂盒由盒体、盒体内的隔离垫、隔离垫的各孔腔内分别置入的引物混合物P、LDR探针混合物L、DNATag酶和DNA连接酶组成。[0006]其中P和L详细信息如下引物混合物P表示用于ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物，具体信息如下[0008]ADSL上游引物序列5'-CACTGCTGTCCCAAAGCTG-3'，[0009]ADSL下游引物序列5'-GCAGGCAGGAAAATGAAAGT-3'。探针混合物L表示用于ADSL基因LDR反应的三根探针的混合物，具体信息如下[0011]A探针ADSL_MODIFY序列5，P-GAAGTTGCTCCAAGGTGAATGATGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM3，[0013]B探针ADSL_C序列5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAG-3，[0015]C探针ADSLJ序列5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCGTGTTATCCCCTACGTAACAA-3，本试剂盒使用方法1、PCR扩增SNP位点所在片段l)PCR扩增反应体系准备[0020]在200ii1的PCR薄壁管中，加入1ii1DNA模板(50ng/ii1)、2ii110XBufer、0.6iilMg2+(100mmol/L)、2ii1dNTP(20mmol/L)、0.2Tag酶El(5U/ii1)、0.4ii1P15pmmol/iil、4ii15XQ-solution、9.8iilddH20共20iiLPCR反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入20iU石蜡油。2)PCR扩增反应程序设置在Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystems9600上设置PCR扩增反应程序，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。3)反应结束后，取2iil反应产物在3.0^琼脂糖胶，0.5XTBE中电泳，检测反应是否成功。4)剩余反应产物保存于_20°C。2、PCR产物的连接酶检测反应1)在PCR扩增产物中加入等体积ddH20稀释，作为连接反应的模板。2)在200ii1的PCR薄壁管中，加入1ii110XBuffer、1ii1PCR产物、liULl、0.05illDNA连接酶40U/iU、6.95iUddH20，10yL连接酶检测反应体系，充分混匀后短暂离心，最后加入lOiU石蜡油。3)在Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystems9600上连接酶检测反应程序，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应。4)在每个上样孔中加入10ii1LoadingBuffer,0.25ii1ABIGS-500ROX荧光标记分子量标准，最后加入0.5ill的LDR产物，充分混匀后上样，运用ABI377测序仪进行测序胶毛细管电泳。5)应用GENESCAN672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genema卯er软件进行数据分析和基因分型。5)应用GENESCAN672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genema卯er软件进行数据分析和基因分型。本实用新型由ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物Pl、ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1、A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2、A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Tag酶、DNA连接酶组成，利用本实用新型以LDR方法检测这两个基因的基因型，PCR扩增SNP位点所在片段，PCR产物的连接酶检测反应；本实用新型设计合理，具有快速准确、成本低廉，操作简单等优点。图1为本实用新型结构示意图；图2为ADSL基因PCR产物扩增结果图片；图3为A-FABP基因PCR产物扩增结果图片。图中，1盒体，2隔离垫，3引物混合物P，4LDR探针混合物L，5DNATag酶，6DNA连接酶。具体实施方式结合实施例和附图进一步说明本实用新型，如图1所示，本实用新型由盒体1、盒4体l内的隔离垫2、隔离垫2的各孔腔内分别置入的引物混合物P3、LDR探针混合物L4、DNATag酶5和DNA连接酶6组成。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。运用本实用新型对7周龄300只文昌鸡ADSL基因C3484TSNP位点分型。1)样品采集7周龄300只文昌鸡的血液，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50ng/iU。2)PCR扩增反应及结果PCR扩增及检测结果按照试剂盒使用方法步骤1进行，ADSL基因PCR产物大小为99bp，与预计的结果一致，如图2、3。3)ADSL基因PCR扩增产物的连接酶检测反应ADSL基因PCR产物连接酶反应按照试剂盒使用方法步骤2进行，检测后，经Genema卯er数据分析后ADSL基因C3484TSNP位点的分型截图见表1，基因判型标准为ADSL基因连接产物检测出双峰大小86bp±0.5bp和88bp±0.5bp为CT基因型，单峰86bp±0.5bp为CC基因型，单峰88bp±0.5bp为TT基因型。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[0047]表1为ADSL基因C3484TSNP位点的分型结果。注双峰表示杂合基因型，单峰表示纯合基因型；各个峰下面的矩形中的数值表示片段大小，如sz85.80表示85.80bp。权利要求一种鸡肉风味相关基因ADSLSNP分型试剂盒，其特征是，所述的试剂盒由盒体、盒体内的隔离垫、隔离垫的各孔腔内分别置入的引物混合物P、LDR探针混合物L、DNATag酶和DNA连接酶组成。专利摘要本实用新型涉及一种鸡肉风味相关基因ADSLSNP分型试剂盒，属于分子生物学
技术领域：
，主要特点是由ADSL基因PCR扩增的上下游引物混合物P1、ADSL基因LDR反应的探针的混合物L1、A-FABP基因PCR扩增上下游引物混合物P2、A-FABP基因LDR反应的探针的混合物L2及Tag酶、DNA连接酶组成；利用本实用新型以LDR方法检测这两个基因的基因型，PCR扩增SNP位点所在片段，PCR产物的连接酶检测反应；ADSL基因第二外显子C3484T突变对IMP有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高且显著高于CC和CT；A-FABP基因第一外显子C51T突变对IMF有显著影响，TT基因型个体的IMP含量最高显著高于CC和CT，TTTT基因型组合为鸡肉风味物质含量最高的肉鸡个体。文档编号C12Q1/68GK201530829SQ2009202340公开日2010年7月21日申请日期2009年8月5日优先权日2009年8月5日发明者宋卫涛,徐文娟,朱文奇,李慧芳,束婧婷,汤青萍,章明,陈宽维,韩威申请人:江苏省家禽科学研究所