专利名称：一种假单胞菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种假单胞菌菌株及其应用。
背景技术：
番爺青枯病是由爺青枯拉尔氏菌[Ralatonia solanacearum(smith)Yabuuchi et al]引起世界范围内的毁灭性土传病害，热带、亚热带的国家和地区，如南美洲、日本、 印度、菲律宾，我国台湾、广东、浙江、福建、江苏、湖北、四川、重庆等地区严重发生。该病 可造成植株大面积萎蔫死亡，一般田块发病率为10% 15%，重病田发病率高达80% 98. 5%，导致番茄产量严重下降，造成重大的经济损失。R. solanacearum是一种土壤习居菌，能够在无寄主情况下的土壤中存活很长时 间。R. solanacearum主要从根系侵入植株，也可从茎部伤口侵入并直接进入导管系统，在其 中大量繁殖并产生代谢物质，阻碍植物体内水分运输，造成植株萎蔫。目前，针对番茄青枯 病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性，而且大量使用化学农药会 造成环境污染和生产成本上升。休耕期撒施石灰可减轻病害发生，但易造成土壤板结。抗 病育种工作，由于缺乏理想的抗源材料，进展缓慢。水旱轮作要求轮作年限长，且附近无其 它宿主存在方可起到良好效果，因而实施起来较困难。土壤灭菌后形成了土壤生物真空，一 旦土壤受到病原菌侵染，会导致病原菌的大爆发而造成更为严重后果。生物防治作物病害 具有可利用资源丰富、成本低廉、能够避免环境二次污染，被认为是解决土传病害一条有希 望的途径。利用病原菌拮抗微生物进行生物防治是生物防治的一个重要组成部分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用病原菌拮抗微生物防治番茄青枯 病的假单胞菌菌株②-29，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其保藏编号为CGMCC N0. 3331，它的保藏时间为2009年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。本发明通过以下技术方案来实现分离一种假单胞菌菌株②-29 筛选步骤如下(1)2008年从浙江嘉善、丽水、杭州等番茄种植基地采集21个土样，利用牛肉膏蛋 白胨培养基进行分离，共分离到细菌420多株。(2)然后进行平板拮抗试验，得到对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌有较好拮抗效果 的初筛细菌27株。(3)通过盆栽试验，进一步筛得对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌具有相对稳定的拮 抗效果复筛细菌4株。该菌株②-29为上述4株复筛细菌中的一株细菌。根据菌株的形态特征、培养特 征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册，对该菌株②-29进行鉴定，初步确认为属假单胞菌属，该菌株取样分离自浙江丽水。所述假单胞菌菌株②-29 属假单胞菌(Pseudomonas sp.)；在牛肉膏蛋白胨培养 基中生长良好，结晶紫染色不均勻，细胞短杆状；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落圆 形，边缘整齐且规则，表面湿润、光滑，菌落半透明、土黄色，菌苔薄。本发明还提供了所述假单胞菌菌株②-29在防治番茄青枯病的应用。本发明针 对目前番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性的问题，通 过对番茄青枯病拮抗菌分离筛选及其防效试验，分离筛选出对番茄青枯病有拮抗作用的菌 株，在此基础上可以进行进一步的田间试验，借以开发出一种成熟的微生物有机肥，对减少 大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要的作用。
图1是本发明中菌株②-29对青枯拉尔氏菌的拮抗效果示意图。图2是本发明中番茄苗移栽入盆第15天后CKl和CK2盆栽效果示意图。图3是本发明中番茄苗移栽入盆第15天后菌株②-29处理与对照CK2盆栽效果 示意图。图4是本发明中番茄青枯病拮抗菌生防效果试验图。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作更详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明并 不受这些实施例的限制。对所涉材料的说明蛋白胨生化制剂，生工生物工程(上海)有限公司；牛肉膏生化制剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；Yeast extract (酵母浸膏)生化试剂，上海酵母厂；Casein hydrolysate (洛蛋白水解物)生化试剂，BIO. BASIC. INC.；琼脂生化试剂，福建泉州市泉港化工厂；NaCl 分析纯，上海青析化工科技有限公司；K2HPO4 分析纯，BIO. BASIC. INC.；葡萄糖分析纯，生工生物工程(上海)有限公司；MgSO4 · 7H20 分析纯，冬青化工厂；蔗糖分析纯，BIO.BASIC. INC.。实施例1 细菌的分离纯化按以下试验步骤对细菌进行分离纯化1培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15_20g，H2O 1000ml,PH 7. 0-7. 2。121. 3°C灭菌 20 分钟。2试验步骤2. 1培养基的制备配制如1所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制备细菌斜面培养基。
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2. 2 土壤稀释液的制备(1).称取IOg 土壤，加入IOOml带有玻璃珠的无菌水500ml三角瓶中，振荡15分 钟，即10-1 ；(2) ·吸取土悬液IOml，加入90ml无菌水500ml三角瓶中，即10_2 ；(3).从(2)中吸取10ml，加入90ml无菌水500ml三角瓶中，即IO"3 ；(4).从(3)中吸取5ml，加入45ml无菌水250ml三角瓶中，即10_4 ；(5).从(4)中吸取5ml，加入45ml无菌水250ml三角瓶中，即10_5 ；(6).从(5)中吸取5ml，加入45ml无菌水250ml三角瓶中，即1θΛ2. 3细菌分离(7).从(3) (4) (5)中分别吸取0. 1ml，加入到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板中进 行涂布培养(28-30°C培养2-3天)，各设置3个重复；(8).选择20-200菌落数的培养皿进行挑取菌落进行斜面培养(28-30°C培养2_3 天)；2. 4 多个土样(9).共21个土样，每个土样重复上述2. 1 2. 3步骤。2. 5 结果按上述方法分离得到细菌420多株。实施例2 分离得到的细菌对番茄青枯病茄青枯拉尔氏菌的平板拮抗试验1.培养基1. 1固体培养基青枯病菌培养基配制:MgS047H200.3g，Κ2ΗΡ042· Og, Yeast extract (酵母浸 膏)4.0g，Casein hydrolysate (洛蛋白水解物)8. Og，Sucrose (蔗糖)10. 0g，Agar (琼 脂)18g, Distilled water (蒸溜水)1000ml。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制同实施例1中1。1. 2液体培养基细菌液体摇瓶培养基牛肉膏蛋白胨培养基不加琼脂即可。番茄青枯病菌液体摇瓶培养基青枯病菌培养基不加琼脂即可。2、试验步骤2. 1培养基制备配制青枯病菌培养基(固体、液体)，制备病原菌茄青枯拉尔氏菌斜面；配制牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基(固体、液体)，制备细菌斜面。2. 2平板拮抗试验2. 2. 1菌种活化番茄青枯病菌和细菌进行菌种活化番茄青枯病菌和分离细菌分别转接至青枯病 菌培养基斜面和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面，28-30°C，培养16-28小时，备用。2. 2. 2制备青枯病菌平板活化青枯病菌接入液体培养基中进行摇瓶培养，28-300C，200转/分。隔天以青枯 病菌培养基倒平板，等培养基凝固后每个平板中加入0. Iml (浓度为IO9 IOki个/ml)青 枯病菌发酵液(发酵约40小时)，涂布，28-30°C培养过夜，备用。
2. 2. 3准备细菌液体发酵液在青枯病菌液体摇瓶培养第二天，活化分离细菌接入液体培养基中进行摇瓶培 养，28-300C，200转/分，隔天备用(发酵约40小时)。2. 2. 4平板拮抗试验用灭菌滤纸片(Φ9πιπι)蘸取分离细菌发酵液放入青枯病菌平板，每个平板放5株 不同拮抗细菌，3个重复。24h左右观察实验结果，主要考察抑菌圈有无及大小。3、结果通过平板拮抗试验得到拮抗效果较好的细菌27株，菌株②-29就是其中一株。 参见图1。图1实验为先在平板上涂0. Iml青枯拉尔氏菌发酵液，然后用滤纸片蘸取菌株 ②-29发酵液放在平板上，同时培养而得。由图1可以看出抑菌圈明显，说明菌株②-29生长速度快，扩散能力强，对茄青枯 拉尔氏菌具明显地拮抗作用。实施例3 菌株②-29发酵液在盆栽上对番茄青枯病进行生防效果试验为了检验 菌株②-29的生防效果，进行了本试验。实验步骤1、育苗1. 1育苗基质的准备育苗基质为草炭蛭石珍珠岩=7:1: 0.5，然后用自来水调节含水率至 60% 70%，备用。1. 2 播种在育苗穴盘(规格90X60)每穴中装入四分之三高左右的1. 1制备基质，用手轻 压，然后每穴中均勻撒入50颗蕃茄种子，再铺上一层薄薄的基质，并用塑料袋盖住穴盘，防 止水分蒸发，备用。1.3 出苗把1. 2准备好的播种穴盘放入人工气候箱培养，温度25°C，放入大盆水保湿，打开 所有日光灯，18点以后全部关掉，并保证日夜温差在10°C以上。大约4 5天出苗，出苗后 掀掉塑料袋，等两子叶平展，备用。2、苗移入穴盘中培养2. 1苗移栽在穴盘(规格45 X 45)每穴中装满按1. 1制备基质(略压紧)，然后每穴中移入1 株1. 3准备好的两子叶平展苗，两指在根部略压紧，在大棚中培养。穴盘中培养至3 4片 真叶(大约3 4周)。注意拿苗时两指捏住1片子叶。2. 2青枯拉尔氏菌和试验拮抗菌发酵液准备青枯拉尔氏菌和试验拮抗菌活化，然后每株接液体摇瓶培养，28 30°C，200转/ 分钟，培养约40小时，备用。2. 3预用拮抗菌苗移栽入盆前1个礼拜，每穴中加入5ml相应的拮抗菌发酵液。3、盆栽3.1盆栽土准备
年前从浙江丽水番茄种植基地青枯病发病严重的地块挖2 4吨土，备用。3. 2 土装盆称取合适量的2. 1准备上，混入2%有机肥，每盆(规格280X220)中装入4. 5公 斤混土，备用。3. 3 移栽每盆中移栽5株番茄苗，根据需要补充水分。本试验设2个对照，即CKl和CK2， CKl 移栽时不加任何菌；CK2 移栽时每株只浇50ml青枯拉尔氏菌稀释发酵液(稀释500 倍)。菌株②-29处理，每个处理6盆，每盆5株苗，均勻分布，移栽时每株根部先浇50ml青 枯拉尔氏菌稀释发酵液(稀释500倍)，然后再浇50ml拮抗菌稀释发酵液(稀释10倍)。3. 4 记录每天记录温度，湿度，标准植株真叶数，每盆发病株数、发病叶片及总真叶数。4、结果如图2和图3所示(注2009年5月17日移栽入盆，照片为2009年5月31日拍 摄)。图2和图3照片为番茄苗移栽入盆第15天拍摄的照片，即2009年5月31日拍摄。 由图4可以看出CKl到观察结束即2009年6月22日无发病株；CK2从2009年5月21日 开始发病，到2009年5月31日发病株数达到24株；菌株②-29处理从2009年5月19日 开始发病，到2009年5月31日发病株数还只有9株，说明菌株②-29对番茄青枯病具一定 防效，虽然到2009年6月22日观察结束时菌株②-29处理病株数仍比对照CK2少，但到后 期防效效果已不明显。原因可能是慢慢地青枯拉尔氏菌大量繁殖，菌株②-29已无法防控。 因此建议使用本菌株②-29进行青枯病防治时，后期补用菌株②-29制品；或者施用本发明 制品与种植园艺措施结合效果会更好。实施例4 对分离得到的细菌进行鉴定根据菌株②-29的形态特征、培养特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手 册，对该菌株②-29进行鉴定，初步确认为属假单胞菌属，该菌株取样分离自浙江丽水。该保藏菌株的形态、培养、生理、生化等特征如下假单胞菌菌株②-29 属假单胞菌(Pseudomonas sp.)；在牛肉膏蛋白胨培养基中 生长良好，结晶紫染色不均勻，细胞短杆状；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落圆形， 边缘整齐且规则，表面湿润、光滑，菌落半透明、土黄色，菌苔薄。菌株②-29理化试验结果(BI0L0G GN2)
试验项目结试验项目结试验项目结试验项目结果果果果细胞形态杆革兰氏染色阴氧化酶-接触酶+状性对照D-蜜二糖P-苯乙醇酸+L-组氨酸+a-环糊精甲基葡糖苷衣康酸羟基脯氨酸+糊精D-阿洛酮糖a-氧代丁酸L-亮氨酸+
7糖原D-棉子糖a-氧代戊二酸+L-鸟氨酸+Tween40L-鼠李糖a-氧代戊酸L-苯丙氨酸+Tween80BD-山梨醇D, L-乳酸+L-脯氨酸+N-乙酰半乳糖胺蔗糖丙二酸L-焦谷氨酸+N-乙酰匍萄糖胺D-海藻糖丙酸+D-丝氨酸+核糖醇松二糖奎尼酸+L-丝氨酸+L-阿拉伯糖木糖醇D-己糖酸+L-苏氨酸+D-阿糖醇丙酮酸甲酯+葵二酸D, L-肉碱+D-纤维二糖丁二酸甲酯+丁二酸+g-氨基丁酸+i-赤藓醇乙酸+溴代丁二酸+尿刊酸+D-果糖B顺-阿康酸+琥珀酰胺酸+肌苷+L-果糖柠檬酸+葡糖醛酰胺尿苷D-半乳糖甲酸L丙氨酰胺+胸苷龙胆二糖D-半乳糖酸内酯D-丙氨酸+苯基乙胺+a-D-葡萄糖+D-半乳糖醛酸+L-丙氨酸+腐胺+m-肌醇D-匍糖酸+L-丙氨酰甘氨酸+2-氨基乙醇+a-D-乳糖b-甲基葡糖苷L-天冬酰胺+2，3-丁二醇BLactuloseD-匍糖醛酸+L-天冬氨酸+甘油+麦芽糖a-羟基丁酸L-谷氨酸+D,L-甘油磷酸盐D-甘露醇b-羟基丁酸+甘氨酰天冬氨酸D-匍糖-1-磷酸D-甘露糖+g-羟基丁酸甘氨酰谷氨酸+D-葡糖-6-磷酸B 菌株②-2916S rRNA基因序列测定结果如下(序列表中SEQ ID No. 1)GGTAACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAG
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AGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGC
TCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTCGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCGAAGAGCAAGCTCTCCTCATCCGCTCGACTTGC将16S rRNA基因序列进行Blast结果分析，得到与假单胞菌模式菌株相似度达 99%，因此根据16S rRNA基因序列测定结果来看，该菌株可以归为恶臭假单胞菌，但生理生 化指标与恶臭假单胞菌差异较大，目前还没有合适的模式菌株与之相对应，属新菌株。序列表<110>浙江大学浙江省农业科学院<120> 一种假单胞菌菌株及其应用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1406<212>DNA<213>Pseudomonas sp.<400>1ggtaaccgtc cccccgaagg ttagactagc tacttctggt gcaacccactgacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc aacattctgactagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta
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tgtagcccaggccgtaaggg ccatgatgacttgacgtcCN 101928683 A说明书8/8页
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权利要求
一种假单胞菌菌株② 29，其特征在于其分类命名为假单胞菌(Pseudomonassp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.3331。
2.如权利要求1所述的一种假单胞菌菌株②-29，其特征在于所述假单胞菌菌株②-29 的16S rRNA基因序列为SEQ ID NO :1。
3.如权利要求1所述的一种假单胞菌菌株②-29，其特征在于所述假单胞菌菌株②-29 特征如下菌株细胞短杆状，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐且规 则，表面湿润、光滑，菌落半透明、土黄色，菌苔薄。
4.如权利要求1或2所述的一种假单胞菌菌株②-29在防治番茄青枯病中的应用。
5.如权利要求4所述的一种假单胞菌菌株②-29在防治番茄青枯病中的应用，其特征 在于它在所述防治番茄青枯病的应用为以浓度为IO9 IOltl个/ml的假单胞菌②-29液 体发酵液接种至含有0. Iml浓度为IO9 IOki个/ml的番茄青枯病菌发酵液的平板培养基 中，培养24h，对番茄青枯病有拮抗作用。
6.如权利要求4所述的一种假单胞菌菌株②-29在防治番茄青枯病中的应用，其特征 在于它在所述防治番茄青枯病的应用为以接种量为每克土约含有IO6 IO7个拮抗菌的假 单胞菌②-29液体发酵液接种至栽有番茄苗的盆中，盆栽中每克土约含有IO5 IO6个番茄 青枯病菌，培养15天，接种有假单胞菌②-29菌液的番茄苗发病株数减少。
全文摘要
本发明提供了一种假单胞菌菌株②-29，其分类命名为假单胞菌(Pseudomonassp.)，其保藏编号为CGMCC NO.3331，它的保藏时间为2009年10月9日，保减单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。本发明还提供了假单胞菌菌株②-29在防治番茄青枯病的应用。本发明针对目前番茄青枯病缺少有效的化学药剂，加之青枯菌对化学农药易产生抗药性的问题，通过对番茄青枯病拮抗菌分离筛选及其防效试验，分离筛选出对番茄青枯病有拮抗作用的菌株，在此基础上可以进行进一步的田间试验，借以开发出一种成熟的微生物有机肥，对减少大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要的作用。
文档编号C12R1/38GK101928683SQ20101000372
公开日2010年12月29日 申请日期2010年1月1日 优先权日2010年1月1日
发明者冯明光, 叶青静, 吴传珍, 朱凤香, 洪春来, 王卫平, 薛智勇, 陈晓旸 申请人:浙江大学;浙江省农业科学院