专利名称：一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法
技术领域：
本发明涉及使用酶分解植物秸秆生产纤维素的方法，具体地说是一种复合酶降解 秸秆制备纤维素的方法。
背景技术：
农作物植物秸秆是重要的生物质能源之一，但往往没有被充分利用，而是被大量 废弃或焚烧。焚烧秸秆，不仅给大气带来污染，而且浪费了大量的生物质能源。秸秆通过处 理不仅可以减轻环境污染，而且可以制备纤维素等材料，解决日益严峻的能源危机。传统处理秸秆制备纤维素的主要方法是通过物理和化学方法相结合。比如用蒸汽 爆破和膨化机械处理，用酸、碱、氨等处理。这些方法虽然处理速度快，但成本高，处理过程 中还存在废水废气的排放，造成对环境污染的问题。现有技术中虽然也有利用酶对植物秸秆进行降解处理的方法，但采用的酶品种单 一，降解的效率不高，纤维素得率低。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，该方法采用 多种酶联合降解秸秆制备纤维素，不仅不会造成环境污染，而且降解效率高、纤维素得率
尚ο本发明的技术方案为—种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括以下步骤a.原料的预处理将秸秆原料风干至水分小于2%，粉碎，过20目-60目筛；b.配制水解基液将浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸镁溶液、浓度为0. 05g/L_0. 5g/L的硫酸锰溶液 以及浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸铜溶液，用pH3. 5-5的浓度为0. 01mol/L-0. 03mol/L的 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；C.复合酶的制备将60000U/mL-120000U/mL 的漆酶(Laccase)、800U/mL-1600U/mL 的锰过氧化物 酶(Manganese-d印endent Peroxidase)以及 2000U/mL_3600U/mL 的木质素过氧化物酶 (Lignin Peroxidase)，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶；d.酶解称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解 基液的固液比为1 50g/mL-l 100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30min，然后向水解 容器中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1 0.5g/mL-l 2.5g/mL，水解 温度为30°C _50°C，水解时间为ai_6h ；e.纤维素的提取
3
将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出 上清液，漂洗过程重复2次-3次，剩下的沉淀经冷冻干燥离心后即得秸秆纤维素。本发明进一步的技术方案为所述步骤b中硫酸镁溶液的浓度为0. lg/L-0. 3g/L、硫酸锰溶液的浓度为0. Ig/ L-0. 3g/L、硫酸铜溶液的浓度为0. lg/L-0. 3g/L ；所述步骤b中还加入浓度为0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液；所述步骤d中所述水解容器置于摇床上，所述摇床的转速为100r/min-200r/min ；所述步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂。与现有技术相比，本发明利用多种木质素降解酶组成的复合酶对植物秸秆进行降 解，比单一品种酶降解木质素的效率高，纤维素得率高；本发明全过程无污染，无废水废气 排放，生产的纤维素可以用来制备燃料乙醇等，具有较大的经济效益和社会效益。
具体实施例方式本发明是一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括以下步骤a.原料的预处理将秸秆原料风干至水分小于2%，粉碎，过20目-60目筛；b.配制水解基液将浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸镁溶液、浓度为0. 05g/L_0. 5g/L的硫酸锰溶液 以及浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸铜溶液，用pH3. 5-5的浓度为0. 01mol/L-0. 03mol/L的 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；c.复合酶的制备将60000U/mL-120000U/mL 的漆酶(Laccase)、800U/mL-1600U/mL 的锰过氧化物酶 (Manganese-dependent Peroxidase,简称 MnP)以及 2000U/mL_3600U/mL 的木质素过氧化 物酶(Lignin Peroxidase，简称LiP)，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶；d.酶解称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解 基液的固液比为1 50g/mL-l 100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30min，然后向水解 容器中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1 0.5g/mL-l 2.5g/mL，水解 温度为30°C _50°C，水解时间为ai_6h ；e.纤维素的提取将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出 上清液，漂洗过程重复2次-3次，剩下的沉淀经冷冻干燥离心后即得秸秆纤维素。在步骤b中硫酸镁溶液的浓度最佳为0. lg/L-0. 3g/L、硫酸锰溶液的浓度最佳为 0. lg/L-0. 3g/L、硫酸铜溶液的浓度最佳为0. lg/L-0. 3g/L。在步骤b中还可以加入浓度为0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液。在步骤d中水解容器置于摇床上，摇床的转速为100r/min-200r/min。在步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂，以排除金属 离子干扰。
以下是
具体实施例方式实施例1(1)原料的预处理采用风干的水分小于2%的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过40目筛。(2)配制水解基液取0. lg/L的硫酸镁溶液、0. 3g/L的硫酸锰溶液、0. 3g/L的硫酸铜溶液以及0. 03g/ L的磷酸氢二钾溶液，用pH4. 0的浓度为0. 03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到 100mL。(3)复合酶的制备将120000U/mL的漆酶、1600U/mL的锰过氧化物酶以及3600U/mL的木质素过氧化 物酶，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶。(4)酶解称取秸秆粉2. Og放入250mL烧瓶中，加入IOOmL的水解基液，高压蒸汽灭菌30min 使之溶胀软化。向水解瓶中添加复合酶5mL，进行水解。温度为45°C，水解瓶置于摇床上， 摇床的转速为200r/min，时间为Μι。(5)纤维素的提取将上述水解液在转速为8000r/min下离心15min，倒出上清液。沉淀加入10%的 双氧水50°C漂白池，在转速为8000r/min下离心15min，倒出上清液。在漂白过程中，添加 0. 75%的三聚磷酸钠和0. 75%的磷酸氢二钠作为螯合剂排除金属离子干扰；漂洗过程重 复2-3次。沉淀经冷冻干燥后即得秸秆纤维素。本实施例所得纤维素的得率为92%，纯度为95%。实施例2(1)原料的预处理采用风干的水分小于2%的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过60目筛。(2)配制水解基液取0. 05g/L的硫酸镁溶液、0. 1 g/L的硫酸锰溶液、0. 1 g/L的硫酸铜溶液以及 0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH4. 5的浓度为0. 02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定 容到100mL。(3)复合酶的制备将100000U/mL的漆酶、1500U/mL的锰过氧化物酶以及3000U/mL的木质素过氧化 物酶，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶。(4)酶角军称取过筛后的秸秆粉2. Og放入250mL烧瓶中，加入IOOmL的水解基液，高压蒸汽 灭菌30min使之溶胀软化。向水解瓶中添加复合酶3mL，进行水解。温度为40°C，水解瓶置 于摇床上，摇床的转速为150r/min，时间为4h。(5)纤维素的提取方法同实施例1步骤(5)。本实施例所得纤维素的提取率为81 %，纯度为90%。实施例3
(1)原料的预处理采用风干的水分小于2%的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过20目筛。(2)配制水解基液取0. 3g/L的硫酸镁溶液、0. 5g/L的硫酸锰溶液、0. 05g/L的硫酸铜溶液以及 0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH5的浓度为0. 02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容 到 100mL。(3)复合酶的制备 将80000U/mL的漆酶、1000U/mL的锰过氧化物酶以及^00U/mL的木质素过氧化物 酶，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶。(4)酶解称取过筛后的秸秆粉2. Og放入250mL烧瓶中，加入IOOmL的水解基液，高压蒸汽 灭菌30min。向水解瓶中添加复合酶lmL，进行水解。温度为30°C，水解瓶置于摇床上，摇床 的转速为150r/min，时间为浊。(5)纤维素的提取方法同实施例1步骤(5)。本实施例所得纤维素的得率为70%，纯度为92%。实施例4(1)原料的预处理采用风干的水分小于2%的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过40目筛。(2)配制水解基液 取0. 5g/L的硫酸镁溶液、0. 05g/L的硫酸锰溶液、0. 5g/L的硫酸铜溶液以及 0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH3. 5的浓度为0. 01mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定 容到100mL。(3)复合酶的制备将60000U/mL的漆酶、800U/mL的锰过氧化物酶以及2000U/mL的木质素过氧化物 酶，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶。(4)酶解称取过筛后的秸秆粉2. Og放入250mL烧瓶中，加入IOOmL的水解基液，高压蒸汽 灭菌30min。向水解瓶中添加复合酶2mL，进行水解。温度为50°C，水解瓶置于摇床上，摇床 的转速为100r/min，时间为池。(5)纤维素的提取方法同实施例1步骤(5)。本实施例所得纤维素的得率为59%，纯度为93%。
权利要求
1.一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤a.原料的预处理将秸秆原料风干至水分小于2%，粉碎，过20目-60目筛；b.配制水解基液将浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸镁溶液、浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸锰溶液以及 浓度为0. 05g/L-0. 5g/L的硫酸铜溶液，用pH3. 5-5的浓度为0. 01mol/L-0. 03mol/L的柠檬 酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；c.复合酶的制备将 60000U/mL-120000U/mL 的漆酶(Laccase)、800U/mL-1600U/mL 的锰过氧化物 酶(Manganese-d印endent Peroxidase)以及 2000U/mL_3600U/mL 的木质素过氧化物酶 (Lignin Peroxidase)，按照2 1 1的体积比混合，形成复合酶；d.酶解称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解基液 的固液比为1 50g/mL-l 100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30min，然后向水解容器 中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1 0.5g/mL-l 2.5g/mL，水解温度 为300C _50°C，水解时间为2h-6h ；e.纤维素的提取将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出上清 液，漂洗过程重复2次-3次，剩下的沉淀经冷冻干燥后即得秸秆纤维素。
2.根据权利要求1所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于所述 步骤b中硫酸镁溶液的浓度为0. lg/L-0. 3g/L、硫酸锰溶液的浓度为0. lg/L-0. 3g/L、硫酸 铜溶液的浓度为0. lg/L-0. 3g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于 所述步骤b中还加入浓度为0. 03g/L的磷酸氢二钾溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于 所述步骤d中所述水解容器置于摇床上，所述摇床的转速为100r/min-200r/min。
5.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于 所述步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂。
全文摘要
本发明涉及一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括原料的预处理；配制水解基液，将0.05g/L-0.5g/L的硫酸镁溶液、0.05g/L-0.5g/L的硫酸锰溶液以及0.05g/L-0.5g/L的硫酸铜溶液，用pH3.5-5的0.01mol/L-0.03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；复合酶的制备，将60000U/mL-120000U/mL的漆酶、800U/mL-1600U/mL的锰过氧化物酶以及2000U/mL-3600U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合；酶解和纤维素的提取。本发明利用复合酶对植物秸秆进行降解，纤维素得率高，无污染。
文档编号C12P19/04GK102146424SQ20101011080
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者王欣, 赵晓联, 黄庆国 申请人:无锡市金坤生物工程有限公司