专利名称：血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，特别是提供了一种血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法，快速小量提取血液基因组DNA的试剂盒。
背景技术：
DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，为了进行诸如基因组测序，Southern杂交(包括RFLP)、基因的PCR分离、构建BAC文库等常规操作试验中，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行诊断已经成为临床诊断技术的一项基本技术手段。尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对提取基因组DNA的完整性及纯度要求会更高，因为其基因组DNA用量不高，开发出快速小量提取基因组DNA试剂盒，就可以达到快速检测的目的。
由于血液取材方便可靠，因此上述研究通常是从血液中提取完整的基因组DNA。简单地说，基因组DNA提取有以下几个原则1、保证提取的DNA具有一定的长度；2、纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；3、排除有机溶剂和金属离子的污染；4、蛋白质，多糖，脂类等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。目前的血液基因组提取方法有传统的苯酚氯仿抽提法、蛋白酶/SDS法、以及基于介质的Silica吸附柱法和磁性微粒(磁珠)法等等。随着商品化DNA提取试剂盒的使用，尤其针对小样品量的基因组提取可以完全取替了传统苯酚氯仿抽提的方法，而磁性微粒(磁珠)法以其独有的优势正在被越来越多的人广泛接受。
基于磁性微粒(磁珠)的DNA提取技术是利用亲水性磁性微粒(磁珠)吸附样品溶液中的DNA分子，在外加磁场作用下将吸附DNA的磁性微粒(磁珠)从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，加入适当的溶液使得DNA从磁性微粒上(磁珠)脱附即得到纯净的DNA。基于磁性微粒(磁珠)的提取方法使得DNA提取过程大为简化，不仅可以在常规的试管中以手工方式进行，也可以在96孔或382孔微孔板中以自动化方式进行，已经在欧美国家获得了广泛的应用。磁性微粒(磁珠)法DNA提取试剂盒以其操作简便快捷和省时省力的特点，将会成为目前分子生物学和临床医学研究的理想的辅助工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法，基于磁珠提取血液基因组DNA的试剂盒。特别针对小样品量(50-200微升)的全血材料，无需对红细胞进行预处理直接裂解全血细胞，通过细胞蛋白沉淀液去除大部分血红蛋白及其它杂质，再利用单分散磁性微球特异性吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤后，就可以将磁性微球上的基因组DNA洗脱下来。本试剂盒提取的基因组DNA产量高、纯度好、片段完整，适合于PCR检测、酶切反应、核酸杂交等下游试验。
本发明的试剂盒包括细胞裂解液、RNA酶工作液、细胞蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液等七种组分，各组分内容如下 细胞裂解液10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、50-100mmol/L Na盐、质量浓度2-4％的SDS(十二烷基硫酸钠)和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K； RNA酶工作液为核糖核酸酶A，其终浓度10-20mg/mL； 细胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍盐、0.5-2mol/L Na盐、1-3mol/LKAC(醋酸钾)、4-6mol/L HAC(醋酸)，PH值5.0-6.0； 磁珠粒径1-2μm的单分散磁性微球； 异丙醇分析纯的异丙醇； 漂洗液10-20mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li盐、1-4mmol/L螯合剂与无水乙醇按1∶3-5的体积比混合而成； DNA洗脱液10-20mmol/LTris(三羟甲基氨基甲烷)盐，PH7.5-8.5。
本发明上述试剂盒的提取方法步骤如下 取添加抗凝剂的新鲜血液200μl，加细胞裂解液150-300μl，混匀，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加细胞蛋白沉淀液250-400μl，上下颠倒数次，离心12000r/min，3-5min，贴近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一离心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl异丙醇，水平转动1～1.5min；磁分离25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2-3次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，室温～37℃放置数分钟，直至闻不到酒精气味；加50-80μl DNA洗脱液，至离心管于55-65℃水浴锅中5-10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30-40s，小心吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。
本发明具有以下优点 本试剂盒操作简便、无需对红细胞进行预处理直接裂解全血细胞、快速提取1h即可完成操作； 本试剂盒不使用苯酚氯仿等有机试剂，对操作人员无毒副作用； 本试剂盒提取的基因组DNA，在纯度有保证的情况下，DNA产率更高、片段更完整。
图1为两种试剂盒提取DNA琼脂糖电泳比较。
具体实施例方式 小鼠、人抗凝全血基因组DNA提取 实验材料采集新鲜的小鼠、人血液样本1mL，添加适量的抗凝剂EDTA钾盐，充分混匀后，于4℃备用。
基因组DNA提取步骤取添加抗凝剂的新鲜血液200μl，加细胞裂解液200μl，混匀，58℃、15min；加入10μl RNA酶工作液，室温放置5-10min；加细胞蛋白沉淀液350μl，上下颠倒数次，离心12000r/min，3min，贴近溶液上表面小心吸取350μl上清，放到另一离心管中；依次加入20μl磁珠、200μl异丙醇，水平转动1min；磁分离30s，吸去上清，加漂洗液750μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，37℃放置数分钟，直至闻不到酒精气味；加50μl DNA洗脱液，至离心管于65℃水浴锅中10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30s，小心吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。
试剂盒提取步骤 取抗凝全血100-250μl至1.5ml的EP管中，加入4倍体积的RBL Buffer，上下颠倒充分混合均匀，室温孵育5min。(2)孵育结束后，3000rpm离心10min；弃上清，留取底部细胞团块(少量残留的红细胞不影响后续操作)。(3)加入50μl Pre-Lysis buffer用枪头充分吹打松散，无可见细胞团快(重要)。(4)加入600ul gDNA Extraction Buffer上下颠倒混合均匀，室温放置10min，使溶液变为透明状，无可见细胞团快，必要时延长孵育时间(重要)。(5)将上述溶液加入到离心柱中，13000rpm离心5min。(6)弃收集管中液体，向离心柱中加入500μl Washing Buffer(确认已经加入无水乙醇)，13000rpm离心1min。(7)重复步骤6一次。(8)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，13000rpm空离2min。(9)将内套管移入新的eppendorf管中，室温静置1min，使残留乙醇挥发，在膜中央加入Elution Buffer 40-100μl，室温静置1min，12,000rpm离心2min，获得基因组DNA。
结果分析 提取的基因组DNA产量及纯度检测 分别吸取200μl新采集的小鼠、人抗凝全血，使用本试剂盒和A公司试剂盒进行基因组DNA的提取，得到的基因组DNA经紫外分光光度计检测260nm及280nm的吸光度值，DNA纯度用OD260nm/OD280nm比值来衡量(1.8-2.0)、DNA浓度(μg/mL)＝OD260nm*稀释倍数*50、DNA产量＝DNA浓度*洗脱体积。
表1.两种试剂盒提取DNA结果比较
从表1可以看出两种试剂盒提取得到的基因组DNA纯度上来说，都达到了一定的要求，OD260nm/OD280nm比值都在1.8-1.9之间，A公司试剂盒结果要略好一些，但本发明所得的DNA产量明显提高，为A公司试剂盒DNA产量的1.5倍左右。
基因组DNA片段完整性检测 分别取2μl提取的基因组DNA，于0.8％的琼脂糖凝胶上100V电压，电泳15min，用紫外凝胶成像系统进行照相，如图1所示。
从图1可以看到，两种试剂盒提取得到的基因组DNA片段都在23Kb以上，A公司试剂盒提取得到的基因组DNA片段大约30Kb左右，而本试剂盒提取得到的基因组DNA片段在50Kb以上。
权利要求
1.一种血液基因组磁珠小提试剂盒，试剂盒包括细胞裂解液、RNA酶工作液、细胞蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液七种组分
细胞裂解液10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐，PH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、50-100mmol/L Na盐、质量浓度2-4％的十二烷基硫酸钠和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；
RNA酶工作液为核糖核酸酶A，其终浓度10-20mg/mL；
细胞蛋白沉淀液5-8mol/L胍盐、0.5-2mol/LNa盐、1-3mol/L醋酸钾、4-6mol/L醋酸，PH值5.0-6.0；
磁珠粒径1-2μm的单分散磁性微球；
异丙醇分析纯的异丙醇；
漂洗液10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，PH值8.0-9.0、100-200mmol/L Li盐、1-4mmol/L螯合剂与无水乙醇按1∶3-5的体积比混合而成；
DNA洗脱液10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐，PH8.0。
2.一种权利要求1所述试剂盒的提取方法，其特征在于，工艺步骤为取添加抗凝剂的新鲜血液200μl，加细胞裂解液150-300μl，混匀，55-70℃、15min；加入5-15μl RNA酶工作液，25～35℃放置5-10min；加细胞蛋白沉淀液250-400μl，上下颠倒数次，离心12000r/min，3-5min，贴近溶液上表面小心吸取350-700μl上清，放到另一离心管中；依次加入10-20μl磁珠、200-400μl异丙醇，水平转动1～1.5min；磁分离25～35s，吸去上清，加漂洗液600-800μl，重悬磁珠核酸复合物，清洗2-3次；放在磁分离器上尽量吸去乙醇，室温～37℃放置数分钟，直至闻不到酒精气味；加50-80μl DNA洗脱液，至离心管于55-65℃水浴锅中5-10min，以完全洗脱基因组DNA；磁分离30-40s，小心吸取上清于另一离心管中，备用或-20℃储存。
全文摘要
一种血液基因组磁珠小提试剂盒及其提取方法，属于分子生物学技术领域。试剂盒包括细胞裂解液、RNA酶工作液、细胞蛋白沉淀液、自研磁珠、异丙醇、漂洗液、DNA洗脱液七种组分。特别针对50-200微升小样品量的全血材料，无需对红细胞进行预处理直接裂解全血细胞，通过细胞蛋白沉淀液去除大部分血红蛋白及其它杂质，再利用单分散磁性微球特异性吸附基因组DNA，仅需简单的漂洗步骤后，就可以将磁性微球上的基因组DNA洗脱下来。本试剂盒提取的基因组DNA产量高、纯度好、片段完整，适合于PCR检测、酶切反应、核酸杂交等下游试验。
文档编号C12P19/34GK101812444SQ201010153890
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者陈丹, 陈海生, 张华英, 陈宝俊 申请人:北京博迈世纪生物技术有限公司