专利名称：一种胶体金-羰化青-低密度脂蛋白双标记探针制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金-羰化青(1，1 ‘ Dioctadecyl 3,3,3 ‘， 3 ‘ tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI)-低密度月旨蛋白(Low DensityLipoprotein, LDL)双标记探针制备方法，其特征是利用荧光素DiI和胶体金两种不同示踪物先后标记同一配体LDL制备双标记探针，利用仪器设备检测细胞蛋白质受体的功能活性。
背景技术：
低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor, LDL-R)广泛分布于人与动物的各种细胞和组织，如肝细胞，淋巴细胞，单核巨噬细胞及卵巢等。LDL-R是位于细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，其介导的细胞内吞作用是血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)代谢的主要途径，LDL被摄入量的多少取决于LDL-R的功能活性。由于高血脂而导致的各种疾病是现代社会人类健康的重大威胁，因此细胞表面LDL-R的功能检测不仅对于明确高脂血症的病因并确定相应的治疗方法等具有重要的临床诊断价值，而且对于脂质代谢基础科学研究及调脂药物研发也具有重要意义。如何准确、快速的检测细胞LDL-R功能活性对于脂质代谢领域的科学研究或临床诊断都显得尤为重要。DiI是一种紫红色晶体，荧光强而稳定，无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，有良好的轴突特异性，对过路纤维影响小，在M9nm激发光下可以产生发射波长为 565nm红色荧光。目前，为了体外研究LDL的细胞代谢和LDL-R功能活性，以DiI荧光试剂标记的LDL(例如DiI-LDL)作为探针研究LDL-R功能的方法得到广泛应用(khmitz G, Bruning Τ, Kovacs Ε, et al.Fluorescenceflow cytometry of humanleukocytes in the detection of LDL receptor defects in thedifferential diagnosis of hypercholesterolemia[J]. Arterioscl Thromb,1993(13) 1053-1065.禾口 Teupser D, Thiery J, Walli AK, et al. Biochimica Biophysica Acta, Determination of LDL and scavenger receptor activity in adherent and non-adherent cultured cells with a new single step fluorometric assay [J] · 1996，1303 :193—198.)。这种方法能够利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对细胞LDL-R功能做定性及定量检测，灵敏度高，特异性强， 对人体无毒害，但是文献报道的DiI-LDL制备方法原料浪费大，探针得率低，并且该方法无法反映LDL被细胞摄入后在单个细胞内的分布和代谢情况。而且由于我国进行LDL-R功能活性检测所需要的DiI-LDL多依赖于国外公司的进口试剂(如BTI公司、Invitrogen公司等)，其试剂价格昂贵，大大增加了检测成本，制约着我国脂蛋白探针标记、LDL受体功能研究事业的发展。另一方面，有些研究者用胶体金(Colloidal gold，Au)标记配体LDL制备Au-LDL 探针，与细胞直接孵育，利用透射电镜观察细胞内LDL-R的内吞功能及LDL在单个细胞内的分布代谢情况(Dean AH, Cynthia MA, Larrye D, et al. Colloidal gold low density lipoprotein conjugates as membrane receptor probes[J]. Pro Nalt Acad Sci USA,1981,78(1) :368-371.)，但是该方法又无法利用流式细胞仪对同批细胞的功能活性进行定
量检测。本发明人也曾于2007年报道利用胶体金和荧光素DiI双标记的配体研究ANA-I 细胞LDL-R功能活性的方法(窦晓兵，范春雷，胡林峰，钱颖，沃兴德.胶体金-荧光素双标配体法研究细胞低密度脂蛋白受体的功能[J].中国药学杂志，2007，42 (10) =729-32.), 但是该制备方法重复性差，探针得率低(DiI-LDL得率为71. 7% ；胶体金标记蛋白得率为 29. 3%;胶体金-DiI-LDL得率仅为21. 8% )，纯度不高(84. 6% )，未阐明用于标记DiI-LDL 所用的胶体金的制备方法，胶体金颗粒大小不均一，尚未能获得稳定高效的检测结果。对于细胞LDL-R的功能活性检测需要更加灵敏、稳定、高效的双标记探针，因此， 国内外以往的胶体金-DiI-LDL双标记探针的制备方法需要改良和优化，从而能够适用于肝细胞、巨噬细胞等多种细胞的检测，本发明满足了这些需要。
发明内容
为了解决单一示踪剂探针不能同时利用多种检测手段对同批细胞的LDL-R功能活性既定性又定量分析、难以观察LDL在细胞内的分布代谢情况的缺点，克服胶体金-DiI-LDL制备方法探针得率低，纯度差，胶体金颗粒大小不均一的缺点，本发明利用成熟的LDL脂蛋白提取纯化、DiI标记蛋白和胶体金标记蛋白技术，结合以往研究经验，先用荧光素DiI标记LDL，在DiI-LDL的基础上，再用胶体金标记，制备成双标记探针胶体金-Dil-LDL，利用本发明的双标记探针可以对肝细胞、巨噬细胞的LDL-R功能活性进行准确高效的分析。(一 )本发明解决其技术问题所采取的技术方案①LDL的提取与纯化采集健康成人血浆经序列超速离心获得LDL (D = 1. 019-1. 060)，经透析后，用聚乙二醇6000浓缩后，经kpharose 6B凝胶柱层析纯化，最后真空冷冻干燥获得高纯度LDL 冻干粉。本发明利用冻干粉形式对LDL蛋白的保存方法比前期文献报道中利用溶液保存的方法更能够保证LDL的纯度和新鲜性。本发明直接利用标记溶液溶解LDL干粉，避免了非标记溶液离子对标记过程的干扰，这些因素均能够显著提高DiI及胶体金标记的得率和纯度。②DiI-LDL 的制备取IOmg LDL干粉，加150 ul 10mg/ml的DiI甲醇浓液及250mg不溶性马铃薯淀粉，置于试管中涡旋震荡后，4°C避光孵育1小时；在冰浴中用高纯氮气吹至快干，剩余液体约Iml ；加入含0.01%的叠氮钠的lOmmol/L的三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine azide) 溶液 2ml(NaCl 70mg, Tricine 18mg, NaN3Img, ddH20 10ml, pH 8. 2)，4°C冰箱中避光孵育 48h，每隔一定时间取出混勻1次；4°C 2000r/min离心15min ；取上清，4°C 12000r/min离心 20min ；再取上清，相同条件再离心一次，所得的上清含Dil-LDL，用Brandford法测定上清液中的蛋白质浓度。并用10mmol/L的Tricine azide (pH 8. 2)终浓度调至2mg/ml于4°C 保存。本发明在DiI-LDL制备过程种将第一次4°C避光孵育后的液体用氮气吹至快干，使剩余液体从前期文献报道的2ml继续浓缩至约1ml，增高了反应溶液的浓度，使反应更充分，荧光素与LDL的结合更稳定。荧光试剂DiI是以类似于磷脂的方式与脂蛋白LDL结合的，利用传统的DiI标记方法制备Dil-LDL，其获得率仅有6 7 %，无法满足后续制备过程中胶体金标记的需要(LARRY S. BARAK and WATT W. WEBB. Florescent low density lipoprotein for observation of individual receptor complexes on cultured human fibrolasts[J], The Journal of CellBiology，1981，90 :595-604.)。利用本发明人 2007 年文献报道的制备方法制得的DiI-LDL得率最高也只有为71.7%，而本发明的制备方法进一步使DiI-LDL得率显著提高至90%以上。③胶体金的制备取0.01%四氯金酸(HAuCl4)水溶液100ml置于250ml三角烧瓶内，加热煮沸；加入3.aiil 枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色。此法制备的胶体金颗粒直径为20nm，大小均一，Iml溶液中约有1 X IO12个金颗粒。本发明通过控制煮金时间及颜色判断，能够制备出大小均一的直径20nm的胶体金颗粒用于后续的双标记探针的制备。前期文献报道中的胶体金颗粒大小为40nm左右，颗粒越大，空间位阻越大，结合蛋白质的能力也会减弱；相反，20nm的胶体金颗粒稍小，空间位阻小，故与蛋白质结合力高。本发明在下面的实施方案中，20nm的胶体金与LDL结合比 40nm的胶体金结合更容易，检测更敏感、更稳定。④胶体金-DiI-LDL双标记探针的制备用0. lmol/L的碳酸钾(K2CO3)调金溶胶(粒径为20nm)至pH6. 5 ；于100ml金溶胶中逐滴加入2mg/ml的DiI-LDL贮液0. 75ml，搅拌5min ；加入5ml 1 % PEG20000溶液；于 20000g离心30min，吸去上清液；将沉淀悬浮于20ml含0. 3mg/ml PEG20000的PBS缓冲液 (pH7. 0)中，于20000g离心30min，弃上清取沉淀；相同条件再离心一次，弃上清所得沉淀用 2ml 含 0. 01%叠氮钠的 lOmmol/LTricine azide (pH 8.2)缓冲液重悬，Brandford 法测定上清液中的蛋白质浓度。并用lOmmol/L Tricine azide (pH 8.2)缓冲液调终浓度至^iig/ ml置4°C保存。( 二)本发明的方法在三个方面做了优化与改良①本发明在胶体金标记DiI-LDL过程中采用的金溶胶最适pH值是6. 5，比LDL的等电点(PI6.0)稍高，使金溶胶溶液呈弱碱性。在弱碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与LDL蛋白所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响，因此胶体金标记过程中关键技术是反应过程中PH值的调控。②本发明采用光电比色法测定胶体金标记所需的最适蛋白量，金溶胶中加入的 DiI-LDL蛋白贮液体积由前期文献报道的2. 4ml减少到0. 75ml，大大节省了 DiI-LDL的原料用量，使标记溶液中的胶体金与DiI-LDL反应达到最佳结合状态。通过改良后，使胶体金标记DiI-LDL的得率由前期报道的29. 显著提高到92%，从而使胶体金-DiI-LDL双标记探针的得率由原来的21. 8%显著提高至90%以上。③本发明中的最后离心次数比前期报道的方法增加一次，可以最大限度的去除未被标记上的LDL和Dil-LDL，能够显著提高胶体金-DiI-LDL的纯度，使细胞LDL-R功能活性检测特异性更强。(三)本发明的胶体金-DiI-LDL双标记探针制备方法优点如下
①检测方法丰富同一配体同时用两种不同的示踪物标记，是两种不同的显示系统，不需要任何阻断就可以有效的利用多种仪器方法检测，既可以对同批细胞的LDL-R功能活性进行定性和定量分析，也可以观察LDL在细胞内的分布代谢情况。两种显示系统不会发生交叉反应，同批细胞可以用两种检测信号相互验证，使检测结果更加可靠。由于荧光试剂的灵敏性和银颗粒的三级放大作用，使检测的敏感性更高。②双标记探针得率高本发明通过对LDL蛋白保存方法、DiI-LDL制备、胶体金颗粒大小以及胶体金标记时所用最适蛋白量、最适PH值等方面的优化，可以使胶体金-DiI-LDL双标记探针的制备得率达到90%以上。③双标记探针纯度高本发明通过改良LDL蛋白贮存方法和关键步骤的离心次数，大大提高了双标记探针的纯度，使探针的应用更具特异性。④适用范围广本发明的双标记探针可用于H印G2细胞、L-02细胞、ANA-I细胞、 人淋巴细胞及人成纤维细胞等多种细胞LDL-R功能的检测。
具体实施例方式(一 )检测细胞内LDL-R功能活性本发明提供了利用胶体金-DiI-LDL双标记探针针对不同种细胞进行LDL-R功能活性检测的方法，简单稳定，进一步扩展了双标记探针的应用。这些应用的细胞种类包括 H印G2细胞、L-02细胞、ANA-I细胞、人淋巴细胞及人成纤维细胞等。本发明包括采用激光共聚焦显微镜定性检测，采用流式细胞仪定量检测不同组细胞内的DiI荧光强度；采用透射电镜检测细胞内胶体金-DiI-LDL在单个细胞内的分布情况。应用本制备方法生产了胶体金-DiI-LDL双标记探针试剂盒，包括产品和使用说明书。( 二 )检测姜黄素对!fepG2细胞LDL-R功能活性的影响①细胞培养用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液传代培养H印G2细胞。实验分4组，将细胞接种于四个25cm2培养瓶中，每瓶3ml，细胞密度为5. OX IO5Cells · ml—1。 37°C,5% CO2孵育箱内培养24h。②药物作用空白对照组继续用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液培养。阳性对照组将完全培养液换为含10%无脂血清的RPMI-1640培养液。姜黄素组 加入含20 μ mol/L姜黄素完全培养液。阴性对照组加入含加入含2. 5 μ mol/L胆固醇和 25ymol/L 25-羟基胆固醇的完全培养液。4组细胞继续培养M小时。③配体孵育收集各组细胞，室温1500rpm离心5min，去上清。用无血清1640培养液洗细胞，离心弃上清。各组都加Iml含20 μ g/ml胶体金-DiI-LDL的无血清1640培养液，370C 5% CO2温箱内培养4. 5h ；4°C继续培养0. 5h，离心弃上清。用D-Hanks液重复洗涤细胞3次，离心弃上清，用D-Hanks液重悬细胞。④多种仪器检测同批HepG2细胞LDL-R功能活性采用激光共聚焦显微镜检测不同组细胞内的DiI荧光强度激发波长488nm ；检测波长500 550nm ；采用流式细胞仪定量检测不同组细胞内的DiI平均荧光强度激发波长488nm ；检测波长500 550nm ；FSC, SSC线性放大；FLl对数放大；FSC设阈值；
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⑤采用透射电镜检测不同组细胞内胶体金-DiI-LDL在单个细胞内的分布情况 收集细胞，用2. 5%戊二醛4°C固定Mh，1 %四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，用透射电镜观察胶体金的分布情况。(三)附图描述实施实例
图1.从血浆中提取的LDL层析图谱图2.制备的胶体金全波长扫描图谱图3.光电比色法测定金标记所需的DiI-LDL最适蛋白量标准曲线4.激光共聚焦显微镜检测姜黄素对HepG2细胞LDL-R功能活性的影响A空白对照；B阴性对照；C阳性对照；D姜黄素组图5.流式细胞仪定量分析姜黄素对HepG2细胞LDL-R功能活性的影响图6.透射电镜观察姜黄素作用!fepG2细胞后LDL在细胞内的分布情况A空白对照；B姜黄素组(X 3700) ；C姜黄素组(X 15000) ；D姜黄素组(X 39000)。
权利要求
1.一种胶体金-羰化青-低密度脂蛋白(LDL)双标记探针制备方法，其特征是利用胶体金和羰化青(DiI)两种不同示踪物标记在同一目标蛋白分子上制备双标记探针，利用仪器设备检测细胞蛋白质受体的功能活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其制备方法包括下列步骤⑴提取纯化LDL；⑵制备 DiI-LDL ； (3)制备胶体金；⑷制备胶体金-DiI-LDL双标记探针；(5)胶体金-DiI-LDL双标记探针的应用。
3.根据权利要求2的方法，其步骤(1)中LDL经真空冷冻干燥，获高纯度LDL冻干粉。
4.根据权利要求2的方法，其步骤(2)中取IOmgLDL冻干粉，加的DiI甲醇150ul 及250mg不溶性马铃薯淀粉，震荡混勻，4°C避光孵育，在冰浴中用高纯氮气吹至快干，获得 DiI-LDL 贮液。
5.根据权利要求2的方法，其步骤(3)和(4)中将质量比1 2 5四氯金酸(HAuCl4) 和枸橼酸三钠混合，100°C煮金，调酸碱度至pH6. 5，获得金溶胶；再逐滴加入DiI-LDL贮液， 浓度为1.5%，将沉淀悬浮于含0.03%聚乙二醇20000 (PEG)的磷酸盐缓冲液(pH7. 0)中，离心取沉淀。
6.根据权利要求2的方法，其步骤(5)中应用的模型细胞株包括!1印62、1^-02、7721、 ANA-U Raw264. 7、THP-I、人淋巴细胞和/或人成纤维细胞。
7.根据权利要求2的方法，其步骤(5)中应用激光共聚焦显微镜定性和流式细胞仪定量检测细胞内的胶体金-DiI-LDL平均荧光强度。
8.根据权利要求2的方法，其步骤(5)利用透射电镜检测细胞内胶体金-DiI-LDL在单个细胞内的分布情况。
全文摘要
本发明涉及一种胶体金-羰化青-低密度脂蛋白(LDL)双标记探针制备方法，其特征是利用胶体金和羰化青(DiI)两种不同示踪物标记在同一目标蛋白分子上制备双标记探针，利用仪器设备检测细胞蛋白质受体的功能活性，制备步骤包括(1)提取纯化LDL；(2)制备DiI-LDL；(3)制备胶体金；(4)制备胶体金-DiI-LDL双标记探针；(5)胶体金-DiI-LDL双标记探针的应用。通过改进制备环境的酸碱度、蛋白定量和增加分离次数，制备的胶体金-DiI-LDL双标记探针具有得率高、纯度高、特异性强、适用范围广和检测方法丰富的优点，可采用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和透射电镜等仪器设备精确、高效地检测细胞LDL受体的功能活性。
文档编号C12Q1/02GK102279258SQ20101019463
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者杨俊 , 窦晓兵 申请人:湖南康普医药研究院