专利名称：石杉碱甲高产菌株tcm-01的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物，具体涉及一种石杉碱甲的高产菌株内生菌(Endophyte sp.)TCM-Ol。
背景技术：
石杉碱甲(Huperzine A，简称Hup A)，是从千层塔(蛇足石杉，Huperzia serrata) 中分离得到的一种石松类生物碱有效单体。是一种高效、高选择性、可逆性的乙酰胆碱酯酶 (AChE)抑制剂，具有促进记忆再现和增强记忆保持的作用，此外还具有作用时间长、易透过 血、脑脊液屏障、口服生物利用度高以及不良反应少等多种优点。另外，石杉碱甲具有多靶 点作用，除抑制乙酰胆碱酯酶活性外，还可通过抗氧化应激和抗细胞凋亡途径对神经元产 生保护作用，对多种实验性记忆损害均有改善作用。近年来，国内大量临床研究也已证实， 石杉碱甲对AD、血管性痴呆、智力低下、精神分裂症等患者的学习、记忆障碍以及神经退行 性疾病有一定的治疗作用，且外周不良反应轻微，已引起国内外同行的关注。但是石杉碱甲在全草中含量甚微，由于千层塔资源稀少，尚未能人工栽培，目前药 品生产完全依赖野生资源，价格昂贵，长期采挖势必破坏千层塔天然资源的保存与可持续 开发。虽然现有技术中也存在人工合成石杉碱甲，但由于石杉碱甲结构复杂，人工合成十 分困难，目前所有合成方法均步骤复杂，合成条件苛刻，试剂昂贵，产率很低，很难实现工业 化。因此，通过遗传育种技术选育高产生产菌株，具有重大的研究和开发价值，是解决目前 原料来源限制的一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种石杉碱甲高 产菌株TCM-01，为一种遗传稳定，发酵液中石杉碱甲含量较高的内生菌TCM-01。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种石杉碱甲高产菌株 TCM-01，其分类命名为内生菌(Endophyte sp.)TCM-01，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2010年4月16日，保藏编号为CCTCC NO. M2010086。本发明的菌株是以产黄青霉(Penicillium chrysogenum Thom)为出发菌株，通过 微波诱变筛选该菌种的高产石杉碱甲的突变菌株并确定菌株产素的稳定性，得到石杉碱甲 高产菌株内生菌(Endophyte sp.)TCM-Ol0本发明的菌株，使用PDA培养基，调pH6. 4，于室温下可进行培养，高于29摄氏度生 长缓慢。PDA培养基可提供其生长所需的碳源、氮源。在PDA培养基上于室温下培养4-6天 后，菌丝为有隔菌丝，菌丝被分隔成多个细胞，产生相当明确的分散的帚状枝分生孢子链， 分生孢子为椭圆形。在PDA培养基上培养，菌丝初期(三至四天)白色，颜色逐渐由白转变 为绿色(五天左右)，菌落灰绿色。用CTAB法提取出发菌株和本发明的诱变菌株(即内生菌株TCM-01)的DNA，然后
3采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段。扩增片段测序。序列经GenBank中 BLAST比对，结果表明本发明菌株属于产黄青霉，但本发明的菌株与出发菌株之间均存在差 异。两序列一致性为96. 15%，但本发明菌株的突变位点多位于1-38号位点另外562号位 点亦发生了突变。所以通过ITS序列分析鉴定表明本发明菌株属于产黄青霉的突变株。本发明以TCM-Ol为发酵生产菌株，根据该菌株的基本生物学特性，采用单因子试 验，确定该菌株生长代谢所需的碳源、氮源、无机盐及生物因子的种类及配比，然后采用正 交试验方法确定最适的发酵培养基为PDA培养基，该PDA培养基配方为1L培养基中马铃 薯 200g、蔗糖 20g、琼脂 20g、PH6. 4。在确定了起始pH、种龄的条件下，以接种量、温度、转速、培养时间等进行“四因素 三水平”正交优化试验，以发酵液石杉碱甲含量为考察指标，优化发酵条件。发酵条件为温 度 26-280C，PH6. 3-6. 5，接种量 8-16%,种龄 46_50h，转速 155_165r/min，发酵时间为 7-9 天。优选为温度28°C，PH6.4，接种量12%，种龄4811，转速160r/min，发酵时间为8天。本发明菌株，采用常规培养基和培养条件，其发酵液中石杉碱甲量为出发菌株的 1. 566μ g/ml。通过优选的发酵条件，石杉碱甲产量可达4. 761μ g/ml。在相同发酵条件下， 产品产量提高204%，大幅节约成本。因而，本发明的菌株及发酵条件生产石杉碱甲有其独 特的优势，无论是从生态还是经济条件的角度来看，利用植物内生真菌作为药源是一项不 会枯竭的资源。
具体实施例方式实施例1，本发明菌株的制备方法以产黄青霉为出发菌株，采用微波法筛选变异菌株。稀释后的孢子悬液(密度约 为IO6个/mL)置于盛冰水的烧杯中(用冰浴法消除微波的热效应)，微波(频率2450MHz， 额定输入功率1300W，微波输出功率800W)辐射处理时间分别为:0s、20s、50s、80s、110s、 130s。再将诱变后的孢子悬浮液适当稀释后，吸取0. lmL，涂布于PDA平板，28°C下倒置培养 至生长出单菌落。微波诱变的孢子悬液涂布在PDA培养基上培养2-3d左右，通过计数单菌 落数计算诱变内生真菌孢子的致死率，取诱变明显的菌落孢子继代培养7d，再取真菌孢子 发酵培养，高效液相色谱检测发酵液中石杉碱甲的含量。当辐照处理时间为80s时，诱变真 菌《Β3发酵产量最高。实施例2，摇床发酵生产方法在含有PDA培养基中接种本发明菌株，28°C，160r/min置于恒温摇床中发酵8d， 发酵培养液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，滤液再用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取IOmL装入闪烁 瓶中，通过冷冻干燥离心机旋转干燥。用高效液相色谱(HPLC)测定样品中石杉碱甲的含 量，其石杉碱甲量为4. 76 μ g/ml。实施例3，石杉碱甲有效成分的提取、分离纯化收集发酵培养液，用布氏漏斗抽 滤，收集滤液，滤液再用0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，装入闪烁瓶中，通过冷冻干燥离心机旋 转干燥，即得石杉碱甲提取物。实施例4，石杉碱甲在制备药物中的应用将发酵液经旋转蒸发仪浓缩成稠状再 冷冻干燥成粉末状后纯化，再和其它辅料配比制成药剂(石杉碱甲片或胶囊)。在同样的制 备药剂的条件下，制取相同数量的石杉碱甲片/胶囊，利用本发明菌株的发酵液的成本要低得多。石杉碱甲有助于修复短期的记忆损伤以及长期增强脑力，降低脑老化程度；其能 保护神经系统中的及周边的信息传递分子-神经递质乙酰胆碱；保护胆碱神经元的数量、 大小及功能。对老年性记忆衰退，早老性痴呆症，青少年学习障碍和记忆增强都有明显的改 善作用。采用多中心随机双盲法，对63例与年龄增加相关的记忆减退症(AAMI)患者分别 给予石杉碱甲胶囊或石杉碱甲片剂(商品名双益平)，进行对照研究，疗程8周。两组患 者经治疗后，韦氏记忆量表cms)和匪SE评分均显著提高(p<0.05)，两组患者治疗后 WMS和MMSE评分值增加的程度差异无显著性(P > 0. 05)。给予胶囊组患者的总有效率为 65. 08 %，给予片剂组患者的总有效率为62. 30 %。两组总有效率差异无显著性(P > 0. 05)， 两组不良反应均较少。将61例AD患者随机分为两组，治疗组服用石杉碱甲片，对照组口服吡拉西坦片， 疗程均为9个月，在治疗前、治疗后8和9个月采用匪SE评分。治疗8个月后，治疗组和对 照组的MMSE评分差异有显著性，提示石杉碱甲治疗轻、中度AD疗效较好。对主诉记忆力不佳的青春期中学生，采用双盲法，按照心理健康、记忆商接近、同 班同性别的要求，将68例初中学生配对分成两组，以记忆商及语文、数学和英语以及上述 3门功课均分为观测指标，评定疗效。经口服石杉碱甲(每次0. lmg, bid)治疗4周，用双 盲、配对的方法评价检测结果表明，服用石杉碱甲组学生记忆商明显高于服用安慰药组(P <0. 05)，且服用石杉碱甲组学生“积累”、“再认知”、“联想”、“事实记忆”及“引用数字”因 素的评分均有明显提高，但“理解力”因素的评分未见提高。
权利要求
一种石杉碱甲高产菌株TCM 01，其分类命名为内生菌(Endophyte sp.)TCM 01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年4月16日，保藏编号为CCTCC NO.M2010086。
2.如权利要求1所述的菌株在制备药物石杉碱甲中的应用。
3.一种发酵制备石杉碱甲发酵液的方法，其特征在于发酵条件为温度25-28°C， PH6. 3-6. 5，接种量8-16%，种龄46-50h，转速155_165r/min，发酵时间为7_9天，发酵所用 培养基为PDA培养基，发酵所用菌株为权利要求1所述的菌株。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵条件为温度28°C，PH6.4，接种量 12%，种龄4811，转速160r/min，发酵时间为8天。
5.如权利要求3或4所述的方法得到的石杉碱甲发酵液。
全文摘要
一种石杉碱甲高产菌株TCM-01，其分类命名为内生菌(Endophyte sp.)TCM-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年4月16日，保藏编号为CCTCC NO.M2010086。是以产黄青霉(Penicillium chrysogenum Thom)为出发菌株，通过微波诱变筛选得到。本发明还进一步优化了本菌株的发酵培养条件，在该培养条件下，石杉碱甲产量可达4.761μg/ml。在相同发酵条件下，产品产量大为提高，可大幅节约成本。
文档编号C12P17/12GK101914452SQ20101022614
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者刘东波, 刘仲华, 洪亚辉, 程鹏, 肖浪涛 申请人:洪亚辉;刘东波