专利名称：一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术，即系统进化指数富集技术，制备一组与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
糜蛋白酶是一种胰腺分泌的蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质，其作用、用途与胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。糜蛋白酶具有酶切位点专一性强的特点，它能优先水解酪氨酸和苯丙氨酸的羧基所形成的肽键。酶作用最优PH值为 8. 0 9. 0。糜蛋白酶是特异性较强的蛋白酶，已经成为一种测定蛋白质氨基酸序列不可或缺的工具。基于以上糜蛋白酶的特性，在蛋白质组学的研究中，糜蛋白酶受到越来越多的重视，并已经得到广泛的应用。SELEX技术，即系统进化指数富集技术，是上世纪90年代由Tuerk和Ellington等人发明的一种新的组合化学技术。它利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20 40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在IO14 IO15范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，尤其是RNA序列容易形成凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化学物，甚至是金属离子相结合，形成具有很强结合力的复合体。SELEX技术具有经济、简便、快速等特点。与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸随机文库中筛选出的核酸适配子具有很多优势(1) 寡核苷酸本身分子量较小，易于合成，便于后续试验；( 某些核酸适配子具有强于抗体的亲和性和特异性，无免疫原性；(3)核苷酸的化学结构和性质提供了易于标记的特性；(4) 稳定性好，易于保存和运输，对高温和剧烈环境不敏感。因此，寡核苷酸适配子在生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及临床诊断和疾病治疗中都具有良好的应用前景。目前，尚无有关与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法和应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，提供一组糜蛋白酶核酸适配子，所述核酸适配子与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力。本发明的第二个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，所述方法利用分子生物学技术中的SELEX技术，即系统进化指数富集技术为手段，结合表面修饰的顺磁性磁珠的使用，对糜蛋白酶的核酸适配子进行筛选、扩增和测序，最终获得与糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力的一组核酸适配子。本发明的第三个目的是提供一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，所述核酸适配子与糜蛋白酶相结合，与相结合的糜蛋白酶具有高特异性和高亲和力，可用于对糜蛋白酶进行
所述SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列具有下述结构
权利要求
1.一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子的核苷酸序列选自序列表中的 SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27。
2.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述SEQID No. 1所述的核苷酸序列具有下述结构
3.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是与核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一序列一致性为60% 以上，并且具有相同功能的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是能够与核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一杂交，并且具有相同功能的寡核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一转录的RNA序列。
6.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置的A或T或C或G被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一的任何位置删除或增加部分寡核苷酸残基所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的一组糜蛋白酶核酸适配子，其特征在于所述核酸适配子是核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述的核苷酸序列之一的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
9.一种糜蛋白酶核酸适配子的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤(1)用作筛选的ssDNA的制备使用上游引物和生物素修饰的下游引物对原始随机寡核苷酸库进行PCR扩增，扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收，得到回收的产物，将回收的产物与表面具有链霉亲和素修饰的顺磁性磁珠反应，再利用碱变性，磁力分离去除磁珠，得到ssDNA溶液，将所述ssDNA溶液用酸中和后，得到用作筛选的ssDNA随机文库；O)PCR扩增与糜蛋白酶特异结合的ssDNA，之后进入下一轮筛选；(3)进行不少于10轮循环的筛选，获得目的核酸适配子扩增后高拷贝数的PCR产物； 其中，每隔3轮循环的筛选，进行1次反筛选，即利用未结合糜蛋白酶的固载基质为目标，进行ssDNA的孵育筛选，并去除反筛选后的固载基质；(4)将最后一轮筛选获得的ssDNA经PCR扩增的产物克隆至菌株中，在合适的条件下培养，得到菌落后挑菌、测序，得到本发明所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的核苷酸序列。
10.根据权利要求1 8任一项所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，其特征在于 用于对糜蛋白酶进行检测、分离、纯化以及固定化，应用于生物感应器的制备、目标物质的分析检测，以及制备用于临床诊断的试剂和疾病治疗的药物。
11.根据权利要求10所述的一组糜蛋白酶核酸适配子的应用，其特征在于将所述核酸适配子用于糜蛋白酶的固定化，以及固定化后的糜蛋白酶反应器的研究与应用。
12.一种糜蛋白酶反应器，其特征在于所述糜蛋白酶反应器是以核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子为基础制备得到。
13.根据权利要求12所述的一种糜蛋白酶反应器的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤(1)表面氨基修饰的硅胶颗粒与戊二醛进行反应，而后加入5’端氨基修饰的核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子，持续磁力搅拌，最终得到表面接枝有所述5’端氨基修饰的糜蛋白酶核酸适配子的硅胶颗粒；(2)使用动态混勻器将所述硅胶颗粒装填至聚醚醚酮色谱微柱中；(3)填充结实后，用Tris-HCl缓冲液平衡所述聚醚醚酮色谱微柱系统，然后将糜蛋白酶溶解到Tris-HCl缓冲液中，以流动相方式进样，使糜蛋白酶流经所述聚醚醚酮色谱微柱并进行动态固定化，得到糜蛋白酶反应器；(4)制备好的糜蛋白酶反应器，作为蛋白质类样品的在线酶解反应器进行蛋白质类样品的酶解反应，用于蛋白质和蛋白质组学的研究；(5)所述酶解反应结束后，使用乙腈水溶液作为流动相冲洗，可将固载到核苷酸序列表中SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 27所述核苷酸序列之一的糜蛋白酶核酸适配子上的糜蛋白酶洗脱，洗脱后的糜蛋白酶溶液置于<-20°C条件下保存，再次使用前将其解冻，重复所述步骤C3)将其重新固载，糜蛋白酶反应器即可恢复功能，达到循环使用、可再生的目的。
14.根据权利要求13所述的一种糜蛋白酶反应器的制备方法，其特征在于所述步骤 (5)所述的乙腈水溶液优选为60%的乙腈水溶液；所述洗脱后的糜蛋白酶溶液的保存条件优选为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一组糜蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用，还提供了一种糜蛋白酶反应器及其制备方法，属于生物技术领域。针对现有技术中尚无糜蛋白酶核酸适配子的缺陷，提供了一组糜蛋白酶核酸适配子，其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.27；是通过SELEX技术结合表面修饰的磁珠对原始随机寡核苷酸文库进行筛选、扩增、测序制备得到；可用于检测、分离、纯化以及固定化糜蛋白酶，制备生物感应器，分析检测目标物质和制备用于临床诊断试剂和疾病治疗药物，还可用于制备糜蛋白酶反应器。所述核酸适配子分子量小，可以化学合成，成本低；亲和性和特异性强；便于标记；重复性和稳定性好，易于保存。
文档编号C12N15/115GK102373212SQ20101025414
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者吕雪飞, 周晓萍, 李勤, 肖鹏, 邓玉林 申请人:北京理工大学