专利名称：热稳定性提高的脂肪酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获 得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术：
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯 化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂 肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉 脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1，3_位置选择性，因此常用于油脂加 工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，在65°C下 的半衰期仅有15min左右，热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且易于失活，增加了生产 成本。定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对 某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛 选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大 的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选 择性等方面(Johannes Tff et al. Curr. Opin. Microbiol，2006，9 :261_267)。发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶 的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的高水平分泌表达(Yu Xiao-Wei et al. J Mol CatalB :Enzym，2009，57 :304_311)。本发明以华根霉脂肪酶基因为 模板，利用定向进化技术获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。酶分子的热稳定性提高可以用其半衰期(t5CI)来体现。即酶的活力降低到原来活 力一半时所需要的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，则稳定性差。因此，t5(l的提高代 表了酶分子热稳定性的提高。定义氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。脂肪酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如 Glul07Gly，表示位置107的氨基酸由亲本脂肪酶的Glu替换成Gly，位置的编号对应于附件 序列表1中亲本华根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列编号。如Leul80HiS/Thr218Ser，表示位置 180和位置218的氨基酸都发生了突变。
发明内容
本发明的目的在于提供热稳定性提高的脂肪酶突变体。本发明的技术方案热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于由亲本华根 霉(Rhizopus chinensis) CCTCC M 201021脂肪酶进行定向进化，通过易错PCR、DNA Shuffling和定点突变，获得脂肪酶突变体，亲本华根霉氨基酸序列SEQ ID NO :1中在氨基 酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸_位置_替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突 变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为，表 权利要求
热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于由亲本华根霉(Rhizopuschinensis)CCTCC M 201021脂肪酶进行定向进化，通过易错PCR、DNAShuffling和定点突变，获得脂肪酶突变体，亲本华根霉氨基酸序列SEQ ID NO1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸 位置 替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为，脂肪酶突变体氨基酸取代位置突变体1 Ser234Phe突变体2 Pro168Leu/Val329Ala突变体3 Cys160Leu突变体4 His317Pro/Met101Thr突变体5 Ser151Asn/Leu180His突变体6 Val261Gly/Ser373Cys突变体7 Asp182Tyr/Ala230Phe突变体8 Leu180His/Thr218Ser突变体9 Asn366Asp/Leu180His/Val329Ala突变体10 Ser234Phe/Leu180His/Thr218Ser突变体11 Ser234Phe/Pro168His/Val329Ala/Cys160Leu/His317Pro/Met101Thr突变体12 Leu180His/Thr218Ser/Val261Gly/Lys161Arg突变体13 Glu107Gly/Ala129Ser/Glu363Arg/Lys161Arg/Val261Gly/Leu180His突变体14 Lys161Arg/Leu180His/Thr218Ser/Met101Thr/Thr183Ala/ Glu107Gly/Ser151Asn/Glu363Arg突变体15 Glu107Gly/Ala129Ser/Ser151Asn/Lys161Arg/Leu180His/ Ser234Phe/Glu363Arg/Val329Ala突变体12 1Ala230Phe/Leu180His/Thr218Ser/Val261Gly/Lys161Arg突变体13 1Glu107Gly/Ala129Ser/Ser151Asn/Lys219Asp/Leu180His/ Glu363Arg/Ala230Phe华根霉脂肪酶氨基酸突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO2，有22个突变氨基酸；用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα，pPICZ；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于与亲本华根霉脂肪酶相比，所述 脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以在65°C下的半衰期t5(l来表示热稳定性的提高，所 述脂肪酶突变体的半衰期以及提高的倍数如下脂肪酶突变体 氨基酸取代位置 65 °C t50 (min)Cysl60Leu/His317Pro/Metl01Thr Lysl61ArgLysl61Arg/Val261Gly/Leul80His 'Metl01Thr/Thrl83Ala//Val261Gly/Lysl61Arg /Lys219Asp/Leul80His/°C t50 (min)突变体1 突变体2 突变体3 突变体4Ser234PheProl68Leu/Val329Ala Cysl60Leu提高倍数 2. 18 2. 19 1. 03 1. 16突变体5 突变体6 突变体7 突变体8 突变体9 突变体10 突变体11突变体 突变体 突变体 突变体15突变体 突变体 Lys219Asp/Leu 180His/Glu363Arg/ Ala230Phe亲本华根霉脂肪酶在65°C下的半衰期t5(l为16. 5minc 全文摘要
热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No.M201021脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在各突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为Met101Thr、Glu107Gly、Ala129Ser、Ser151Asn、Cys160Leu、Lys161Arg、Pro168Leu、Pro168His、Leu180His、Asp182Tyr、Thr183Ala、Thr218Ser、Lys219Asp、Ala230Phe、Ser234Phe、Val261Gly、His317Pro、Val329Ala、Glu363Arg、Asn366Asp、Ser373Cys中的一种或几种。以在65℃下半衰期t50来表示，这些突变体的热稳定性较亲本华根霉脂肪酶得到了提高。本发明也公开了编码脂肪酶突变体的DNA序列、表达载体、宿主细胞。
文档编号C12N9/20GK101974499SQ201010254620
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者喻晓蔚, 徐岩, 王睿 申请人:江南大学