专利名称：一种菊花抗旱基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种菊花抗旱相关基因OtMYB，同时涉及 OtMYB基因在提高菊花抗旱能力中的应用。
背景技术：
太行菊(Opisthopappus taihangensis)是菊科太行菊属植物，分布在我国河北、 山西等地，大多生长于海拔1，OOOm的山坡和悬崖岩石上，是我国特有的广义菊属植物中具 有较高抗旱性和抗逆性的种，并具有较强的观赏性。研究太行菊的抗逆分子途径并发现重 要的抗逆基因，将会为菊属植物的抗逆基因工程奠定良好的理论基础，并能提供优良的抗 旱基因资源。菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是世界上最重要的观赏花卉之一， 也是我国栽培历史悠久的传统名花，加强菊花育种工作具有很高的经济效益和社会效益。 多年来，自然突变、杂交和其它传统育种方法在菊花新品种培育上取得了巨大成就。但是， 可利用资源的缺乏严重制约了菊花育种进程，因此，研究种质资源的多样性，利用获得的优 秀基因资源进行分子育种工程，结合常规育种方法，对获得菊花新种质具有重要的作用。干旱是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。据报道全球各地每年因不同程 度的干旱环境条件导致的植物及其产品减产的约在30%左右。尤其在我国北方和西部地 区，干旱胁迫严重地影响了观赏植物的生长，进而限制其推广应用。我国近年来年南方地区 的旱情也严重影响了作物和各种观赏植物的生长。植物的抗旱性是指植物在干旱条件下的 生存能力，而观赏植物的抗旱性是指在土壤干旱或大气干旱条件下植物不仅能存活下来， 而且使其观赏价值保持在一定水平的能力。因此，培养优良的抗旱花卉品种成为解决这一 问题的重要措施之一。植物观赏价值的降低是植物遗传基因在特定环境下表达的产物，其 中干旱是重要的影响因子之一。传统农业中，主要利用常规的方法来选育抗旱的品种，但是 常规育种不仅费时、费力，而且不能满足人们对抗旱节水新品种的需求。近年来，随着分子 生物学研究的不断深入和生物技术的迅猛发展，利用基因工程技术进行培育观赏性强、耐 旱、耐盐、抗病的优良观赏植物新品种，已经成为当前研究热点。MYB类转录因子为一类含MYB结构域的转录因子，MYB结构域为一段约51_52个 氨基酸的肽段，由一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列组成。在MYB类转录因子中，每 隔约18个氨基酸出现一个规则的色氨酸残基，以此形成了转录因子空间。植物中的MYB类 转录因子可简单分成3个亚类，其中的R2R3亚构域类含有两个MYB结构域，对应于动物中 C2MYB蛋白的R2和R3，其在植物次生代谢的调节、细胞的分化控制和对激素刺激的应答方 面起着重要作用(Heine，2007)。通过对拟南芥干旱、高盐和ABA诱导基因的启动子区域进 行分析，鉴定出了 MYB结合位点的核心序列为TAACTG，当MYB类转录因子和下游靶基因启动 子的TAACTG核心序列结合后，即可诱导抗胁迫基因的表达。自1982年以来，在拟南芥和玉米中都发现存在着大量的MYB转录因子，它们是植 物转录因子中最大的家族之一，并在转录调节中起着多方面的重要作用。绝大多数的MYB 转录因子可以起到转录激活的作用。
在拟南芥中首次发现了受ABA诱导表达的AtMYB2基因，AtMYB2蛋白与bHLH类蛋 白RdBPl相互作用，协同调节Rd22基因的表达。这表明拟南芥中的R2R32MYB转录因子广 泛地参与了植物对激素的应答。Agarwal等研究发现拟南芥MYB15为一类调控CBF和其他 冷胁迫应答基因的转录因子。Dai等在拟南芥中过量表达来自水稻的0sMYB3R22基因，发现 转基因拟南芥提高了对冷、旱和盐胁迫的耐受力，在种子发芽过程中，转基因植株Tl代比 野生型更能忍受ABA及NaCl胁迫。拟南芥中的5个AtMYB3R基因所编码的MYB蛋白的功 能在对细胞周期的调控中起作用。上述研究表明，MYB类转录因子在植物应答外界胁迫环 境中起着重要作用。对菊花育种而言，抗性育种是菊花品种培育的重点之一。然而传统的育种方法虽 然取得了重大成就，但菊花的遗传背景复杂，在传统的育种中常受到基因资源和远缘杂交 障碍等不利因素的限制。分子育种可以进行定向育种而不改变其它性状，有利于打破远缘 杂交障碍，扩大基因库。因此，转基因分子育种成为培育抗旱性新品种的捷径。分离差异表 达基因对于了解和揭示植物生长发育规律，进行生物的改良、提高抗逆和抗病性等研究具 有重要的意义，为进一步培育出更新奇、抗旱的菊花新品种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菊花抗旱相关基因OtMYB属于典型的R2R3-MYB转录 因子。本发明的另一个目的在于提供一种抗旱相关基因OtMYB在提高菊花品种抗旱能 力中的应用。本发明利用差异显示(DDRT-PCR)和差减杂交(SSH)技术相结合，研究太行菊在干 旱胁迫下基因的表达情况，进行差异基因的分离。对获得的差异片段进行序列分析，采用 RACE扩增得到抗旱相关基因OtMYB的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示， 该基因共编码424个氨基酸的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，C-端存在一个丝氨 酸丰富区，该基因具有两个典型的MYB类转录因子的DNA结合区，属于典型的R2R3-MYB转 录因子。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明 蛋白还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有 同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术 人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明的基因和蛋白质可以从太行菊中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成 的方法得到。可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表 达载体导入宿主，得到转OtMYB基因的转化体。本发明通过将外源OtMYB基因整合进菊花基因组，转基因植株的抗胁迫能力增 强，并且生长未受到干旱胁迫的显著影响。表明OtMYB可用于提高菊花对干旱胁迫的抗性。
图ImRNA差异显示结果。1-6 不同干旱处理。图2pBI_0tMYB植物表达载体的构建。图 3 转 OtMYB 基因植株的 PCR 检测。M :2000bp DNAMarker ；1 :pBI121_0tMYB 阳性 对照；2 阴性对照；3-14 =PCR阳性植株。图4转基因植株和对照植株在正常浇水和水分胁迫下的表型变化。左对照植株； 中转基因株系1 ；右转基因株系2。图5干旱胁迫处理对转基因株系和对照植株生长的影响。左-右T1，T2，Τ3，Τ4， Τ5，对照。
具体实施例方式实施例IOtMYB基因的克隆1.建立定位群体采用PEG溶液对太行菊组培苗进行干旱胁迫，取样后液氮速冻，-80°C保存，作为 抗旱基因定位群体；2.总RNA的提取和mRNA的分离1)RNA提取方法取幼嫩材料lOOmg，加液氮充分研磨，置入2ml离心管中，加入 ImlTrizol试剂，剧烈振荡混勻，室温静置IOmin ；4°CT 12000rpm离心15min，去除沉淀； 将上清液移入新的离心管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)，剧烈振荡，静置 IOmin ；再次4°C下12000rpm离心15min ；将上层水相移至新的离心管中，加入等体积氯仿/ 异戊醇(24 1)，剧烈振荡，静置IOmin ；4°C下12000rpm离心15min ；将上层清液移入新离 心管，加入等体积异丙醇沉淀RNA，混勻静置30min ；4°C下12000rpm离心IOmin ；弃上清，加 入75%乙醇1ml，洗沉淀3遍；再用100%乙醇洗涤沉淀；室温或真空干燥沉淀10-30min ； 加入30-50 μ 1 DEPC处理水溶解RNA ；55_60°C温育IOmin ；测OD值定量RNA浓度。2)分别提取叶片、根系的总RNA然后进行等量混合，得到的RNA中采用磁珠法进行 mRNA分离。3. OtMYB基因的克隆及序列分析在获得的和拟南芥MYB基因有高度相似性的序列上设计特异引物，进行RACE克 隆。首先用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNAAmplification Kit 分别合成用于 RACE 的 3，-cDNA和5，-cDNA，太行菊的mRNA用于反转录的模板。特异RACE引物包括5，-RACE引 物和3，-RACE引物，按照说明书中对PCR引物的要求(23-28nt, 50-70% GC, Tm > 65°C )， 选择合适的位置，设计特异性引物如下5，-RACE 引物为5，-GGTGTCGCATACTTTBCCCTCGGG-3，3，-RACE 引物为5，-GGCTGGAAGCAGGCGGGACGAGAAC-3，根据5’ -RACE和3’ -RACE的测序结果，分别在起始密码子和终子密码子附近设计 OtMYB全长基因的引物，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。正向引物5，-GGCTGGAAGCAGGGGGCACGAGAAC-3，反向引物5，-GGTGTCGCATACTTTBCCCTCGGA-3，
1)反应体系如下PCR反应体系 2) PCR扩增程序如下
回收PCR产物，并测序检测。
实施例20tMYB表达载体的构建1.利用大肠杆菌DH5a制备感受态细胞，配制OD值在0. 6-0. 9的菌落培养液。分 别取克隆载体和PBI121质粒DNA 3-5 μ L于感受态细胞中，重组质粒转化大肠杆菌；提取大 肠杆菌质粒DNA。2. DNA片段的酶切和回收质粒酶切所用的缓冲液参照Takara试剂目录选择，单酶切选用产品附带的缓冲 液，双酶切根据试剂目录选择最适缓冲液。一般1 μ g质粒至少加IU的酶，37°C温育2h。在本实验使用了试剂盒提取质粒，纯度较高，酶切效果较好。一般酶切时间Ih即 可切开，3-4h可以完全酶切，对没有星号活性的酶进行过夜酶切效果更好，较难切的酶可 在中间补加一次酶，因为酶比重较大易于沉淀管底，所以要最后加酶，加完后用枪轻轻吸打 混合，不要用震荡仪剧烈震荡，最后短暂离心，把管壁上的液体甩下来，酶切总体积一般为 10-20 μ L，尽量保持体积大小不变。DNA片段的回收选用博大泰克公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，操作步骤如下1)将单一的目的DNA条带从凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心
管中称取重量。
2)向胶中加入3倍体积溶胶液PN (如凝胶重为0. Ig,其体积可视为100 μ L，则加 入300 μ L溶胶液)，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充 分溶解。如还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液。待溶胶液降至室温时，加入10yL3M的 醋酸钠，以调节PH值。3)将上步所得溶液加入吸附柱中，13000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重新放 入收集管中。4)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW，13000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重
新放入收集管中。5)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，13000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱重 新放入收集管中，13000rpm再离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱置于室温或50°C烘箱 数分钟，彻底的晾干。6)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65_70°C 水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，13000rpm离心Imin收集DNA溶液。3.表达载体的构建所用植物表达载体为pBI121，含有筛选标记基因Npt错误！未找到引用源。和报 告基因⑶S。Npt错误！未找到引用源。基因的启动子为N0S-pro，Gus基因的启动子为花椰 菜花叶病毒的(CaMV) 35S启动子。用限制性内切酶XbaI和SmaI分别酶切表达载体pBI121 和中间克隆载体，分别回收载体大片段和目的片段，然后进行定向粘端-平末端的连接。连 接产物转化大肠杆菌感受态细胞，PBI121中含有筛选标记基因NPT II，因此含重组质粒的 大肠杆菌可以在平板上生长，未转入重组质粒的则不能正常生长。通过PCR扩增初步确定 阳性克隆，并进行双酶切鉴定，确定目的基因已经连接到植物表达载体。把经酶切鉴定的阳 性克隆通过冻融法转化农杆菌感受态细胞，进行类似的PCR和酶切鉴定。4.农杆菌感受态细胞的制备和液氮冻融法转化农杆菌1)从平板中挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含100 μ g/mL利福平的IOmL LB液 体培养基中，28°C，200rpm震荡培养约20h。2)把上述培养过夜的培养物按1 100转接入液体LB培养基中，28°C，200rpm继 续震荡培养约4-6h，使农杆菌OD值约为0. 3-0. 5。3)将菌液倒入预冷的无菌离心管中，冰浴20-30min，4°C，5000rpm离心lOmin，弃上清。4)加入 20mL 预冷的 0. IM CaCl2 和 0. 05M MgSO4 溶液，悬浮菌体，冰浴 30min。4°C， 5000rpm离心lOmin，弃上清。5)加入预冷的ImL含20_25%甘油的0. IM CaCl2和0. 05MMgS04溶液，悬浮菌体。 按每管150 μ L分装于离心管中，液氮速冻l-2min，于_70°C保存备用。取_70°C保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上融化，取5 μ L质粒于感受态细 胞中，旋转混勻，冰浴30min，液氮中速冻lmin，37°C热激5min，迅速放置冰上2min，然后加 入800-1000 μ L液体LB培养基(不含抗生素)，28°C 140-160rpm振荡培养4_5h使农杆菌 复苏。取300 μ L培养液均勻涂布于含100 μ g/mL Rif和100 μ g/mLKan的平板上，待菌液 被培养基吸收后倒置培养皿，28°C暗培养2d左右。5.根癌农杆菌Ti质粒的提取
1)挑取根癌农杆菌单菌落接种在40mL液体YEB培养基中，28°C，200rpm振荡培养 过夜。2)将40mL菌液分别置于4个IOmL的离心管中，6000rpm离心5min收集菌体。3)每管各加入900μ L溶液I，用涡旋振荡器充分悬浮菌体，室温下放置约lmin。4)每管加入1. 5mL溶液II，缓慢地上下翻转离心管十多次，温和混勻，室温放置 5min。5)每管加入180 μ L预冷的溶液III，上下翻转离心管十多次，温和混勻，冰浴 IOmin,或放入 _20°C冰箱 5min。6) 12000rpm, 4 °C，离心5min，移取上清液，加入2/3倍体积的酚/氯仿抽提， 12000rpm 离心 5min。7)移取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，混勻。放入_20°C冰箱30min。8) 12000rpm离心5min，倒掉无水乙醇，再瞬时离心，然后用移液枪尽可能地吸去 无水乙醇，再用0. 5mL70%乙醇洗DNA沉淀两次，12000rpm离心2min，倒掉乙醇。9)再次12000rpm离心30s，风干lOmin，以进一步去除残留的乙醇。10)每管各加入15 μ L无菌水溶解DNA沉淀，轻弹至完全溶解。6.农杆菌中阳性克隆的筛选和鉴定当单菌落长出后，随机挑取单菌落接种于含100 μ g/mL Rif和100 μ g/mL Kan的 液体LB培养基中，于28°C 200rpm振荡培养l_2d。反应程序为94°C预变性4min，94°C变性 30s，56°C复性lmin，72°C延伸lmin，30个循环，最后在72°C延伸lOmin。用于扩增hpt基 因的引物是 Pl :5，-GAT GTT GGC GAC CTC GTA ΤΤ-3，，P2 :5，-TCG TTA TGT TTA TCG GCA CTT T-3，，预期产物大小为584bp。反应程序为94°C预变性4min，94°C变性30s，55°C复性 45s，72°C延伸lmin，30个循环，最后在72°C延伸5min。结果表明得到了鉴定正确的阳性克 隆。实施例3对抗旱相关基因OtMYB表达的结果和应用根据OtMYB基因所在的克隆序列，用限制性内切酶XbaI和SmaI分别酶切表达载 体PBI121和中间克隆载体进行定向粘端-平末端的连接，采用农杆菌EHA105介导的遗传 转化方法，将基因组载体导入地被菊品种‘晚粉’叶片外植体中，最终获得OtMYB阳性植株 5株。将地被菊品种‘晚粉’的5个转基因株系T1、T2、T3、T4、T5和对照CK，栽植于培养 箱中。选取8-10片真叶时期的菊花苗进行胁迫处理，在30°C 30% RH的条件下控水4d。选 择生长40天的菊花成苗进行控水4d处理，综合分析其抗旱性。经过4天的控水胁迫后，5个转基因株系的幼苗生长和对照相比，株高值均比对照 值大。从表型上观察，5个转基因株系的生长未受到显著的影响，总体的萎蔫程度均比对照 低，叶子相对挺拔，植株干旱受害程度较对照轻。这表明在轻度的干旱胁迫下，转基因株系 的抗旱能力有所提高，转入的转录因子基因延缓了转基因植株的受害程度。经过4天的干 旱后，对转基因株系和对照的株高、冠幅和节间进行了比较，结果显示转基因植株的株高明 显比对照株高大，差异较显著，平均冠幅差异达到了 2. 42cm。由于干旱胁迫导致菊花的节间 伸长受影响，因而对照与转基因植株相比，节间长度也明显受到抑制。因此，抗旱相关基因OtMYB可以在菊花品种中应用，有助于提高菊花对干旱胁迫的抗性。
权利要求
菊花抗旱蛋白OtMYB，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的菊花菊花抗旱基因OtMYB。
3.如权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求2或3所述基因在菊花品种选育中的应用。
7.权利要求2或3所述基因在提高菊花抗旱能力中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种菊花抗旱相关基因OtMYB，同时涉及OtMYB基因在提高菊花抗旱能力中的应用。本发明菊花抗旱基因OtMYB具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该基因具有两个典型的MYB类转录因子的DNA结合区，属于典型的R2R3-MYB转录因子。OtMYB与菊花抗旱性相关，通过遗传转化，将基因转入普通菊花品种，能够有效提高菊花品种对干旱胁迫的抗性。
文档编号C12N5/10GK101928337SQ20101025574
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者张启翔, 蔡明 , 赵伶俐, 陆苗, 高亦珂 申请人:北京林业大学