专利名称：一种综合利用猪血的方法
技术领域：
本发明涉及一种从猪血中同时提取凝血酶和猪血水解蛋白的方法，属生物活性物 质的分离提取技术领域。
背景技术：
猪血是一种优质蛋白质，营养学家称其为液体肉。猪血中含有人体所需要的几乎 全部的营养成分蛋白质、氨基酸、维生素、糖和钠、钾、铁、钙等人体不可缺少的微量元素。 其中蛋白质18.9%、非蛋白有机体1.2%、矿物质0.9%、水分79%，另外，其氨基酸组成平 衡，含人体所需的8种必需氨基酸的总量高于人乳和全蛋，特别是赖氨酸的含量高达9%， 符合联合国粮农组织、世界卫生组织(FA0/WH0)专家组推荐模式。我国是猪血资源大国，但在猪血资源开发利用上却落后于不少发达国家，由于经 简单加工的猪血蛋白不易被消化吸收且颜色较深、血腥味较重适口性差，所以很久以来，许 多猪血作为废弃物倒进地沟，既造成巨大浪费，又污染环境。国外对动物血的开发始于上世纪初，初期主要用于饲料工业。随着高新技术的发 展，国内外许多研究部门尤其注重用生化技术加工猪血用于食品、制药等方面的研究。目前 血液产品在保健品行业已经形成了一定的规模，产业化前景良好。近年来，我国猪血深度开 发也取得了重要进展，猪血作为一个营养宝库，已经得到极其广泛的研究，所提出的加工生 产工艺流程不下几十种。从直接食用猪血豆腐，到酶解猪血粉，复合氨基酸粉的生产，已经 取得了长足的进展，但是仍然不能满足人类的需要。存在的问题是大多数工艺还不完善，如 有的工艺能耗大耗时长、有的工艺只能生产单一产品、有的工艺得率低、有的工艺使用大量 有机溶剂，存在环保缺陷等。而本发明方法克服了上述缺点，发明了零排放的利用猪血同时 生产凝血酶和猪血水解蛋白的绿色方法。
发明内容
本发明属生物活性物质的分离提取技术领域。具体涉及将新鲜猪血经抗凝处理后 以血浆和血球为出发底物分别制备凝血酶和猪血水解蛋白的方法。血浆经低温冷冻、沉淀 收集凝血酶原、离子激活、酶液纯化等步骤制得高活性的凝血酶；血球经破壁、溶血、复合酶 分段酶解、过滤除菌等步骤制得高活性的猪血水解蛋白。该方法制得的猪血水解蛋白中氨 基酸含量占蛋白质的80%以上，易于吸收利用。本发明方法充分利用了原料，一次投料可以 生产两种高附加值产品。整个生产过程避免使用毒性大的有机溶剂，克服了产品单一、溶剂 残留等缺陷，降低了生产成本。用本发明方法，IL猪血可制得凝血酶精品6000U以上、高活 性的猪血水解蛋白粉150g以上。具体来说，本发明的步骤由以下几步构成1、抗凝猪血的制备取检疫合格的新鲜猪血放入容器1中，该容器中已事先加入 了 0. 5% -5% (w/v)溶于少量去离子水中的抗凝剂柠檬酸三钠，充分搅拌均勻，低温静置备用。
2、血浆、血球分离低温静置后，抗凝猪血上层为无色透明液体为血浆，下层深红 色粘稠液体为血球。用虹吸法将上层血浆吸到容器2中；余下的血球经转速为3000-35001·/ min离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏至容器3中过夜待用。3、血浆沉淀收集凝血酶原容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物 后，用2-8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5. 1-5. 2，低温静置过夜，收集沉淀即 得凝血酶原。4、凝血粗酶液制备将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，加热保温至 37°C，用1. 0% CaCl2溶液，低速搅拌(500-800r/min) 20-30分钟，激活凝血酶原，过滤收集 滤液即得凝血酶粗酶液。5、凝血酶精品制备向凝血酶粗酶液中加入8-10倍冷生理盐水，用截留相对分子 量(Mr)为60000的超滤膜处理，浓缩至原体积的1/20-1/25后收集截留液。该液体即为精 制凝血酶液，也可将截留液冷冻干燥，即得粉状凝血酶精品。6、血球破壁、溶血向容器3中加入血球体积的适量生理盐水(使液体中蛋白质含 量为8% -10% )，升温至10°C左右，高速搅拌(lOOOr/min以上)20-30分钟。7、血球蛋白分段酶解用4. Omol/L NaOH调节pH至7. 5，将温度升至37_40°C，加 入适量复合蛋白酶I，保温2小时后，再升温至55-60°C，保温3小时；调节pH至9. 0，加入 适量复合蛋白酶II，保温4小时使血球蛋白充分水解；8、猪血水解蛋白制备酶解结束后，冷却至常温，用0. 22um的滤膜过滤除菌即可 制成液体猪血水解蛋白，也可将该液体喷雾干燥后制成猪血水解蛋白粉。
具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例1向50L检疫合格新鲜猪血中加入500g溶于少量去离子水的柠檬酸三钠，充分搅拌 均勻，4°C以下静置过夜。按上述发明方法的步骤2操作，得到血浆约35L、血球约15L。血 浆按上述发明方法的步骤3操作，用8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5. 2，低 温静置过夜，收集沉淀得凝血酶原。凝血酶原沉淀按上述发明方法的步骤4、5操作，不冷冻 干燥，得精制凝血酶液1.8L。向冷冻过夜的20L血球中加入适量生理盐水，使其底物浓度为8-10%，升温至 10°C左右，高速搅拌20分钟，按上述发明方法的步骤7、8操作，采用分段复合酶法水解血球 蛋白，用0. 22um的滤膜过滤除菌后得到猪血水解蛋白液体约150L。该液体可根据需要，进 一步浓缩制成复合氨基酸营养液，也可以喷雾干燥制成猪血水解蛋白粉。实例2凝血酶活力检测、猪血水解蛋白组分分析试验1)材料凝血酶标准品、纤维蛋白原、牛血清白蛋白(购自中国药品生物制品检定 所)；凝血酶样品(按实例1方法自制)。2)检测方法①凝血酶活力检测按中华人民共和国药典(二部)(2000版1056-1057页)所示的方法；②蛋白质含量测定采用福林_酚法。③水解氨基酸高效液相色谱法。3)结果连续取3批用上述发明方法制得的样品各100ml，按上述检测方法检测结 果见表1、表2。表1样品检测数据
权利要求
一种综合利用猪血的方法，该方法组成步骤如下1)抗凝猪血的制备取检疫合格的新鲜猪血放入容器1中，该容器中已事先加入了0.5％ 5％(w/v)溶于少量去离子水中的抗凝剂柠檬酸三钠，充分搅拌均匀，低温静置备用；2)血浆、血球分离低温静置后，抗凝猪血上层为无色透明液体为血浆，下层深红色粘稠液体为血球，用虹吸法将上层血浆吸到容器2中；余下的血球经转速为3000 3500r/min离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏至容器3中过夜待用；3)血浆沉淀收集凝血酶原容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物后，用2 8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.1 5.2，低温静置过夜，收集沉淀即得凝血酶原；4)凝血粗酶液制备将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，加热保温至37℃用1.0％CaCl2溶液，低速搅拌(500 800r/min)20 30分钟，激活凝血酶原，过滤收集滤液即得凝血酶粗酶液。5)凝血酶精品制备向凝血酶粗酶液中加入8 10倍冷生理盐水，用截留相对分子量(Mr)为60000的超滤膜处理，浓缩至原体积的1/20 1/25后收集截留液，该液体即为精制凝血酶液，也可将截留液冷冻干燥，即得粉状凝血酶精品；6)血球破壁、溶血向容器3中加入血球体积的适量生理盐水(使液体中蛋白质含量为8％ 10％)，升温至10℃左右，高速搅拌(1000r/min以上)20 30分钟；7)血球蛋白分段酶解用4.0mol/L NaOH调节pH至7.5，将温度升至37 40℃，加入适量复合蛋白酶I，保温2小时后，再升温至55 60℃，保温3小时；调节pH至9.0，加入适量复合蛋白酶II，保温4小时使血球蛋白充分水解；8)猪血水解蛋白制备酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌即可制成液体猪血水解蛋白，也可将该液体喷雾干燥后制成猪血水解蛋白粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是复合蛋白酶I由胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋 白酶按一定比例混合而成。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是复合蛋白酶II由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶按一定比例混合而成。
全文摘要
本发明属生物活性物质的分离提取技术领域。具体涉及将新鲜猪血经抗凝处理后以血浆和血球为出发底物分别制备凝血酶和猪血水解蛋白的方法。血浆经低温冷冻、沉淀收集凝血酶原、离子激活、酶液纯化等步骤制得高活性的凝血酶；血球经破壁、溶血、复合酶分段酶解、过滤除菌等步骤制得高活性的猪血水解蛋白。该方法制得的猪血水解蛋白中氨基酸含量占蛋白质的80％以上，易于吸收利用。本发明方法充分利用了原料，一次投料可以生产两种高附加值产品。整个生产过程避免使用毒性大的有机溶剂，克服了产品单一、溶剂残留等缺陷，降低了生产成本。用本发明方法，1L猪血可制得凝血酶精品6000U以上、高活性的猪血水解蛋白粉150g以上。
文档编号C12N9/74GK101979532SQ20101050476
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者吴保承, 杨春霞 申请人:江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司